专利名称：高纯度n－(4－[n,n－二(2－碘乙基)氨基]苯氧羰基)－l－谷氨酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抗体定向酶前药治疗(ADEPT)的新的高纯度形式的已知前药和一种新的该前药盐，以及它们的药物组合物和该盐的制备方法。
前药N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸于1994年2月3日公开于国际专利申请WO94/02450；参见该申请的实施例33，该实施例描述了所生产的胶状三氟乙酸(TFA)盐。据知胶状形式的前药不可能是非常高纯度的，因为处理胶状类型的化合物具有相当难度。任何一种高纯度形式的该前药的氢碘酸盐或前药本身在以前还从未公开过。
一方面，本发明提供基本上纯净形式的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸。
术语“基本上纯净形式的”是指对于反应杂质，前药的纯度至少为95％(优选至少是96％，更优选至少为97％，最优选至少是98％)，所述反应杂质由前药的各种合成反应带入，包括反应溶剂。如此高的纯度只有通过本发明公开的前药的氢碘酸盐才可能获得，该氢碘酸盐可以结晶形式制备。因为该盐可有效地从该反应混合物收集并使用溶剂洗涤除去合成过程中包括溶液溶剂的杂质，所以结晶形式的前药易于使其获得高纯度的形式。基本上纯的前药优选是与缓冲剂混合的干粉形式的，它在重新配制后适于静脉施用。
另一方面，本发明提供N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐。该盐优选是基本上纯净形式的。N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐优选是结晶形式的。该结晶的熔点为142-145℃。优选结晶的X-射线衍射光谱基本上如附图3所示。
该盐具有下述优点良好的热稳定性；因为可有效地从该反应混合物中收集该盐，所以易于合成和纯化；提高的纯度和降低的吸湿/潮解特性，方便处理。
虽然不希望受到理论根据的束缚，但据信HI的存在确实或多或少地有助于逆转前药在芥子气烷基化链区的降解。据信当前药以干燥贮存时，由1-氮杂环丙烯(aziridene)中间体衍生的前药可在贮存或热压下生产。前药的HI盐溶于水溶液时有助于其稳定，这可能是由于原位的碘反荷离子的生成。本领域普通专业技术人员不可能将高浓度NaI等加到药用(唯一已知的用途)前药中，因为这类化合物本身即可起药物作用。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，它含有基本上纯净形式的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸和可药用赋形剂。
优选的组合物是以干燥形式提供的。优选的赋形剂是缓冲剂，尤其是碳酸氢钠。优选该组合物用作ADEPT组分，在临用前不久用无菌稀释剂重新配制。
另一方面，本发明提供一种两种成分的药物组合物，它含有第一种成分为干燥形式的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐和第二种成分无菌稀释剂。优选的盐是结晶形式的。
另一方面，本发明提供一种制备N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐的方法，该方法包括脱去式I化合物的保护(参见附图4)，其中Pr1和Pr2表示保护基(优选Pr1和Pr2是叔丁基酯基或三甲硅烷基，尤其是三甲硅烷基)。脱保护优选在酸性条件下，在惰性气保护和HI的存在下进行制备N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐。脱保护优选是在非质子传递溶剂中，优选二氯甲烷或甲苯，尤其是二氯甲烷的存在下进行。脱保护优选分两个阶段进行，其中Pr1和Pr2被不同的保护基Pr3和Pr4置换，但在第一阶段HI也参与脱保护。优选使用碘代三甲基硅烷(TMSI)处理式I化合物，进行第二阶段的脱保护。Pr3和Pr4优选是三甲硅烷基保护基，然后，优选在酸性条件下将它们除去(优选含有晶种)。对于第二阶段的脱保护，在室温(15-30℃)下，第一步通常需30分钟至24小时，特别是4-6小时；第二步通常需1-48小时，优选12-18小时。优选在室温下的至少约14小时延长时间的搅拌，(尤其是至少约18小时)对于结晶而言是较重要的。
下面以非限定性实施例说明本发明，其中附
图1显示化学式；附图2显示前药N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸的HI盐的合成途径；和附图3显示结晶形式的前药N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸HI盐的X-射线衍射光谱；附图4显示分子式。
实施例1-制备N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐(参见附图1和2)在氮气保护和室温下，将N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸二叔丁酯(附图1，化合物5；25.9g)溶于二氯甲烷(173ml)。往该溶液中加入碘代三甲基硅烷(26.2ml)并将该反应搅拌4-6小时。一旦反应完成，将溶液缓慢加到优选含有终产物晶种的乙醚(834ml)和乙酸(43ml)的混合物中(第一次的反应仍在进行)。将所得悬浮液在室温搅拌18小时，获得结晶。注意长时间的搅拌对于获得结晶是十分重要的。将结晶形式的目的终产物，N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐(附图1，化合物6)滤出，用乙醚(2×150ml)洗并在真空干燥箱中干燥至衡重。产物重量＝22.1g。
M.P.＝142-5℃(分解)旋光度-[α]D25＝-21.1°(C＝1，二甲基甲酰胺)NMR(DMSOd6)δ7.93(d，1H)；6.91(d，2H)；6.63(d，2H)；4.0(m，1H)；3.69(t，4H)；3.28(t，4H)；2.33(m，2H)；2.0(m，1H)；1.8(m，1H)。
13C化学位移(相对于39.6δ的DMSO)-3.9，52.9，143.0，112.1，122.6，142.0，154.9，53.2，26.1，30.1，173.6，173.2元素分析-C16H20I2N2O6.HI.
实测值C26.9％，H3.1％，N3.8％，I52.7％理论值C26.7％，H3.0％，N3.9％，I52.9％如下制备N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸二叔丁酯(附图1，化合物5)。
a)N-(4-硝基-苯氧羰基)-L-谷氨酸(附图1的化合物1)的制备在氮气保护下，将L-谷氨酸(附图1，化合物b；73.6g)悬浮于2L烧瓶中的二氯甲烷(750ml)中。一次性地加入N，N-二异丙基乙基胺(193.9g)，用20分钟加入氯代三甲基硅烷(135.8g)，同时使反应温度保持在或低于反应混合物的回流温度下(参见附注1)。添加完毕后，将反应混合物回流1.5小时，然后冷却到1℃，得到L-谷氨酸二-三甲硅烷酯(TMS)。
在洁净、干燥的3L反应器中，在氮气保护下，将氯甲酸对硝基苯酯(附图1，化合物a；100.8g)溶于二氯甲烷(375ml)并将该溶液冷却至-3℃。然后，用15分钟加入先前生成的L-谷氨酸二-TMS酯溶液同时将反应温度保持在10℃以下。添加完毕后，搅拌该混合物15分钟，然后冷却至约5℃。用水(750ml)和浓盐酸(148ml)制备稀盐酸溶液。然后，用15分钟加入二氯甲烷溶液，同时将反应温度保持在约20℃。添加完毕后，将反应混合物在20℃搅拌30分钟，然后放置30分钟；得到三层体系。分离出低层并弃去，用甲基异丁基酮(MIBK；1000ml，500ml)萃取产物两次。将两个有机层合并，并用饱和NaCl(250ml)洗，在减压下除去溶剂(浴温为40℃)，得到白色固体。在40℃下，将产物溶于乙酸乙酯(600ml)，然后加入己烷(600ml)，搅拌下将混合物冷却到20℃，搅拌过夜，然后过滤分离。目的产物126g(产率77％)用1∶1乙酸乙酯/己烷(300ml)洗，然后在50℃干燥至衡重。
附注1如果不加以冷却，氯代三甲基硅烷的加入会使反应温度由13℃升至40℃。
化合物的特性NMR(DMSOd6)δ8.45(d，1H)；8.25(d，2H)；7.4(d，2H)；4.07(m，1H)；2.35(m，2H)；2.05(m，1H)；1.85(m，1H).
b)N-(4-硝基-苯氧羰基)-L-谷氨酸二-叔丁酯的制备(附图1的化合物2)将a)步产物(附图1，化合物1；2120g)加到100升反应器中，然后加入甲基异丁基酮(24升)。将所得浆状物加热至50℃使产物溶解，然后将溶液冷却至0-5℃，再在0-5℃下用10分钟加入浓硫酸(700ml)。
使用氩气流，在-25℃至-30℃下，将异丁烯冷凝到10升预先标记的空容器中，然后在0-5℃，用18分钟将异丁烯转移到该反应混合物中。用2小时时间将反应混合物温热到18-20℃，然后使其在18-20℃搅拌18小时。
使用冰水浴将碳酸氢钠溶液(2332g在27.1升水中)冷却到0-5℃，然后用20分钟往其中加入反应混合物。搅拌该混合物并使其温热到18-20℃，然后放置使其分成两层。将有机相(上层)分离并用9.87升0.36M正磷酸二氢钾缓冲液(通过将530g正磷酸二氢钾溶在9.87升水中制备)洗。
将有机相分离并在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到含所需产物的琥珀色油(2334g)。
NMR(DMSOd6)δ7.33(d，2H)；8.24(d，2H)；5.90(d，1H)；4.32(m，1H)；2.0-2.4(m，4H)；1.50(s，9H)；1.46(s，9H).
c)N-(4-氨基-苯氧羰基)-L-谷氨酸二-叔丁酯的制备(附图1的化合物3)往适宜使用的氢化仪中加入10％钯碳(200g水润湿糊)，然后加入化合物2(1.0kg)的乙酸正丁酯(5L)溶液。将搅拌的悬浮液冷却到15℃，然后使用弱压(0.1巴)氢气氢化，同时采用外部冷却使反应温度保持在15-25℃(附注1)。当不再消耗氢气时，将催化剂滤除并用乙酸正丁酯(2×500ml)洗。将合并的滤液以用水加至2L的100Tw氢氧化钠(0.114L；特定重力1.5g/ml，46-48w/v)溶液洗，然后再用水(2×2L)洗。在35-45℃减压蒸发有机层(约7L)直至体积达约2L。加热搅拌的该溶液至50-55℃，然后加入Wssochem Solvent 30TM(5L；来自Exxon ChemicalLtd，PO Box 122，4600 Parkway，Fareham，Hampshire PO157AP，UK一种烃类的溶剂；注也可使用其它溶剂，如己烷)，并同时使反应温度保持在50-55℃。将该混合物冷却到+5℃并过滤。分离的固体用乙酸正丁酯(250ml)和Essochem Solvent 30TM(750ml)的混合物洗两次，抽干并在室温下真空干燥，得到0.54kg目的产物。
附注1氢化反应是放热的。
产物的NMR(DMSOd6)δ7.80(d，1H)；6.45-6.75(m，4H)；4.95(bs，2H)；3.95(m，1H)；2.4(m，2H)；1.7-2.0(m，2H)；1.4(18H).
FAB MS[MH+]395d)N-(4-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸二叔丁酯的制备(附图1的化合物4)将c)步产物(化合物3，60g)溶于乙酸(430ml)并加入水(430ml)成浑浊溶液。在数小时内，用环氧乙烷气(78g)处理搅拌下的该溶液，同时使反应温度保持在低于30℃。使用固态CO2冷凝器收集过量气体。将混合物搅拌至少18小时，然后通过薄层色谱抽样检测反应结束。之后，使用“指形”布氏旋转蒸发器减压下蒸发混合物至干。将所得油溶于乙酸乙酯(600ml)，用碳酸氢钠(25g)的水(350ml)溶液洗。将分离的有机层用水(250ml)洗两次，经硫酸镁干燥，过滤，然后减压蒸发得到含所需产物(强度约为50％)的油(77g)。
如下将所需产物结晶。在40℃下，将产物(57g@82％强度)溶于乙酸乙酯(228ml)，然后冷却至22℃，加入碳Darko KB(5.7g；可从NoritUK Ltd，Clydesmill Place，Cambuslang Industrial-Estate，Glasgow G328RF得到的)。将该混合物搅拌90分钟，然后滤过硅藻土，滤饼用乙酸乙酯(57ml)洗。将所得溶液加热至50℃并在45-50℃下用45分钟加入己烷(570ml)。一旦添加完毕，使溶液自行冷却，在35℃种下晶种，然后搅拌过夜。将混合物冷却到15℃1小时，然后过滤并用2∶1己烷/乙酸乙酯(45ml)洗，于50℃干燥前再用己烷洗(45ml)。产物重＝35.7g(产率76％)。熔点＝91～93℃。
NMR(DMSOd6)δ6.85(d，2H)；6.6(d，2H)；4.65(m，1H).
e)N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸二叔丁酯的制备(附图1的化合物5)在氮气保护下，将三苯基膦(32.6g)溶于二氯甲烷(200ml)，加入咪唑(8.4g)，当得到溶液时，将该溶液冷却到5℃。分次加入碘(31.5g)并同时使反应温度保持低于21℃。当添加完毕后，用1小时使反应混合物温热至室温。加入d)步产物(20.0g)的二氯甲烷(50ml)溶液，同使反应温度保持低于26℃，并将该反应混合物搅拌过夜直至反应完全。冷却至5℃后，加入10％碘化钾溶液(120ml)并同时使反应温度保持低于10℃。放置约10分钟后，分离出下层有机层。蒸发除去溶剂，将油状残留物溶于乙酸乙酯(100ml)。将环己烷(200ml)缓慢加到该混合物中，沉淀出三苯基膦氧化物，搅拌至少10分钟后，将固体滤除并用(2∶1)环己烷/乙酸乙酯(60ml)洗。蒸发滤液，在叔丁基甲基醚中(MTBE)(200ml)研磨残留物。将悬浮液滤过硅胶柱(100g)，用MTBE(2×100ml)洗。蒸发合并的有机相，得到无色油状目的化合物(26.0g)。
NMR(CDCl3)δ7.0(d，2H)；6.6(d，2H)；5.4(d，1H)；4.3(m，1H)；3.7(t，4H)；3.2(t，4H)；2.4-1.9(m，4H)；1.5(s，9H)；1.45(s，9H).
实施例2-药物组合物3只20ml的1型玻璃小瓶，每瓶含610mg前药，三只安瓿，每只含11ml 2.15％w/v碳酸氢钠，用于最终剂型的制备。还包括用于小瓶通气的针头(3×18G)和疏水滤器及3只一次性使用用以过滤水溶液的无菌0.22微米滤器。使用材料都必须贮存在冰箱(2-8℃)中。
这些操作预先在无菌条件下进行。在施用前1小时之内，将前药的小瓶用针头和疏水滤器进行通气。然后使用注射器和针头直接穿过塞加入无菌2.15％w/v碳酸氢钠(10ml)。仍在通气下轻轻摇动小瓶，获得澄明溶液(在此游离碱为50mg/ml)。将所需剂量体积通过无菌滤器抽取到无菌注射器中。然后用护套式无菌针头代替滤器，并使滤器在施用前保持冷却。采用相同方法，以1小时间隔制备剩下的每个小瓶，以获得例如相距1小时间隔的三次分别给药剂量。注意该制剂可与适宜的ADEPT抗体-酶共轭物合用，如与国际专利申请WO94/02450和美国专利5405990中所述的A5B7-羧肽酶G2合用。
实施例3-抗肿瘤活性采用下面的模型证明N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐(前药)的抗肿瘤活性。将LoVo肿瘤细胞(107)(ECACC No87060101)皮下注射到无胸腺裸鼠的肋腹侧。当肿瘤的异种移植的直径达到4-5mm时，以2.5mg/kg(500U CPG2活度/kg)剂量静脉施用F(ab’)2A5B7-CPG2共轭物(如在国际专利申请WO94/02450和美国专利5405990所述的)。在接下来的时间(72小时)里，使共轭物定位于肿瘤并从血和组织中清除，腹膜内快速浓注施用前药(3×70mg/kg)，每小时一次，满2小时共三次。共轭物和前药的合用导致肿瘤消退和使肿瘤生长延缓＞30天。据观察，共轭物与前药合用对体重和外周白细胞数仅有很小影响。在该模型中，剂量范围从0.25-10mg/kg的共轭物与前药(3×50-90mg/kg)合用具有明显的抗肿瘤活性。2小时使用三次剂量前药比单次剂量可获得更好的抗肿瘤活性。
基于该抗肿瘤数据，共轭物的临床剂量为0.025-1.0mg/kg，更优选0.5-1.0mg/kg。一旦共轭物已经定于肿瘤并从血和正常组织中清除(共轭物血浆水平＜1μg/ml)将施用前药。基于施用F(ab’)2A5B7-CPG2共轭物的临床数据(Bagshawe，临床药代动力学原理(ClinicalPharmacokinetic Concepts)27，368，1994)可在施用共轭物后48-96小时施用前药。前药的静脉施用剂量为2小时内，每小时3次快速浓注剂量。基于小鼠异种移植数据，预期施用15-150mg/kg的总剂量会对患者产生抗肿瘤活性。不管怎样，应采用前药的标准剂量逐步升级研究来确定最佳治疗剂量。
实施例4-X-射线衍射在Siemens D5000TM衍射仪上进行X-射线衍射研究。小心地将约1克样品(结晶形式的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐)(样品应使用研杵和乳钵研出细颗粒形式，如果需要，应确保进行研究的最小粒径)加载到普通Siemens载片上并借助普通玻璃显微镜载片校平。于30rpm旋转样品(这改善了计数统计学)并使用在40千伏和40毫安通过“细长的铜聚焦管”产生的波长为1.5406A的X-射线放射(Angstroms)。使平行X-射线源通过设定于V20的“自动可变扩散狭缝”，以使在全Theta-Theta扫描范围内的发光面积不变，并使其反射通过2mm抗散射狭缝和0.2mm检测狭缝。在2度至45度2-θ范围(连续扫描)内，每0.02度2-θ增量暴露4秒。因此，每份样品需2小时23分20秒完成扫描。该仪器安装有闪烁计数器作为检测器。通过使用具有Diffrac ATTM(Socabim)软件运行的Dell 325PTM专用计算机作对照和数据记录。附图3显示了结晶形式的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐的衍射图谱。
权利要求
1.基本上纯净的化合物N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸。
2.纯度至少为95％的化合物N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，所述纯度是相对于所述化合物的合成反应带来的反应杂质而言的。
3.N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐。
4.权利要求3的氢碘酸盐，是基本上纯净的。
5.权利要求3-4任一项的氢碘酸盐，其是结晶形式的。
6.权利要求5的氢碘酸盐，其中所述结晶的熔点为142-145℃。
7.权利要求5-6任一项的氢碘酸盐，其中所述结晶的X-射线衍射光谱图基本上如附图3所示。
8.一种药物组合物，它含有基本上纯净的N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸和可药用赋形剂。
9.权利要求8的药物组合物，是干燥形式的。
10.权利要求9的药物组合物，其中的赋形剂是缓冲剂。
11.权利要求10的药物组合物，其中的缓冲剂是碳酸氢钠。
12.一种两种成分的药物组合物，它包含作为第一种成分的权利要求9-11任一项的药物组合物和作为第二种成分的无菌稀释剂，它用于第一种成分的重新配制。
13.一种制备N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐的方法，该方法包括在HI存在下，对式I化合物脱保护，产生N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐。
其中Pr1和Pr2表示保护基
14.权利要求13的方法，其中Pr1和Pr2是叔丁酯基。
15.权利要求13的方法，其中的脱保护分两个阶段进行，其中起初Pr1和Pr2是在第二种保护基脱去之前被第二种保护基置换的叔丁酯基，在HI的存在下，产生N-(4-[N，N-二(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸氢碘酸盐，所述第二种保护基是三甲硅烷基。
16.权利要求13的方法，其中Pr1和Pr2是三甲硅烷基保护基。
全文摘要
本发明公开一种新的用于抗体定向酶前药治疗法(ADEPT)的前药盐。通过制备可获得结晶形式的前药N－(4－[N,N－二(2－碘乙基)氨基]苯氧羰基)－L－谷氨酸的氢碘酸盐。该结晶前药的制备可制备高纯度的前药。
文档编号A61K31/215GK1171100SQ9519699
公开日1998年1月21日 申请日期1995年12月21日 优先权日1994年12月23日
发明者D·W·希顿, S·丹斯, R·I·杜威尔 申请人:曾尼卡有限公司