F标记组合物和方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及正电子发射断层扫描(PET)成像的领域。更具体地，本发明涉及用于 PET成像的示踪剂以及制备所述示踪剂的方法。
【背景技术】
[0002] 由于其物理和核特性，正电子发射体氟-18是用于制备标记生物活性肽和小蛋白 质的低分子量放射性示踪剂和放射性药物的理想的放射性核素。氟-18衰变具有高正电子 丰度(99%)。与碳-11、氧-15和氮-13相比，氟-18的最低正电子发射能量(最大635keV)和在 组织中的最短正电子线性范围（2.3mm)提供了 PET成像的最高分辨率。其相对较长的半衰期 (109.8分钟)使得可以进行多步合成方法、在几个小时内的延长的成像方案、动力学研究和 代谢产物分析。
[0003] 几乎所有的现有技术的氟-18标记试剂被设计为通过氨基官能团偶联到肽或蛋白 质。例如，活化酯4-[18F]氟苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯( 18F-SFB)是最流行的用于引入辅基来 标记肽和蛋白质的试剂之一，这通过酰化反应实现(2-4)。除了 18F-SFB，18F-标记的羧酸和 氨基试剂也是已知的。然而，它们主要用于与在所关注的生物材料中的氨基和羧酸基团的 偶联相结合(5-10)，而不是用于PET探针设计和合成。这些现有技术的 18F-标记试剂的一个 主要缺点是，氨基和羧基官能团是在蛋白质中普遍存在的，因此，没有可能对其选择性标 记。
[0004] 考虑到上述情况，仍然需要一种能够选择性标记所关注的蛋白质或肽的新的标记 方法和试剂。
【发明内容】
[0005] 因此，本发明的一个目的是提供一种对可用作PET示踪剂的化合物进行放射标记 的化学选择性方法。
[0006] 本发明的另一个目的是提供新颖的PET示踪剂，其在PET成像中具有令人满意的生 理特性。
[0007] 考虑本发明的目的，本领域熟知在大多数肽和蛋白质中游离巯基基团不如氨基和 羧酸一样普遍。因此，巯基反应性试剂已被用来在特定位点修饰肽和蛋白质，从而提供比羧 酸和胺反应性试剂更高的化学选择性的一个手段。1989年，Shiue等率先开发使用 18F-标记 的N-取代马来酰亚胺作为Michael受体的巯基反应试剂。合成了N-(对18F氟苯基)马来酰亚 胺和间马来酰亚胺基-N-(对 18F氟苄基)苯甲酰胺（11)用于在半胱氨酸位点处的Fab蛋白（来 白兔IgG)标记。在这一研究之后，报道了三种基于作为巯基选择性试剂的 18F标记的N-取代 马来酰亚胺的新方法。2003年，Toyokuni等人开发了作为疏基选择性试剂的N-[4-[(4- 18F氟 亚苄基)氨基氧]丁基]马来酰亚胺(18F-FBABM)(12)(图1A)。在10分钟内于室温，在不优化反 应条件的情况下，含巯基的三肽谷胱甘肽与 18F-FBABM偶联，得到约70%的经衰变校正的放 射化学产率(扣￥)。2005年，de Bruin等报道了另一种18F-马来酰亚胺试剂l-[3-(2-(18F氟 吡啶-3-基氧基）丙基）吡咯-2，5-二酮（18F-FpyME)(图IB)。18F-FpyME(13)通过三个连续步 骤合成，以[3-(3-Boc氨基丙氧基)吡啶-2-基]三甲基三氟甲磺酸铵为起始物。总反应时间 在110分钟内，经衰变校正的放射化学产率为28%至37%。该巯基反应剂用于标记两种8kDa 的含巯基蛋白质，得到60 %至70 %的分离产率(未经衰变校正）。2006年，Cai等合成了N-[ 2-(4-18F氟苯甲酰氨基）乙基]马来酰亚胺(18F-FBEM)(图1C)。通过 18F-SFB与N-(2-氨基乙基） 马来酰亚胺偶合获得了 18F-FBEM(14) APLC纯化后，使巯基反应剂与含巯基R⑶肽的单体和 二聚物在室温反应20分钟，R⑶单体和二聚体总的经衰变校正RCY为20±4% (n = 5)。
[0008] 尽管上述现有技术中的巯基反应性标记试剂取得了初步成功，但是多步标记反 应、复杂的程序和相对低的产率限制了这些试剂应用。因此，现有技术的放射性标记的巯基 反应性试剂仍有许多不足之处。
[0009] 为了克服现有技术的上述困难，本发明的发明人发明了涉及新的试剂类型的放射 标记巯基反应剂和用于制造该试剂的方法的新途径。
[0010] 本发明的一个方面是一种18F标记方法，其用于对存在或被引入到肽或蛋白的游离 疏基进行位点特异性标记。使用这种新方法合成了一种NTR1祀向PET成像剂，其表现出特定 的肿瘤摄取和优越的肿瘤对背景的对比度。提高的肿瘤相比主要器官的摄取率(包括肿瘤/ 肾）产生了在注射后的较早时间点的高对比度图像。在正常组织中非常低的背景应使得可 以通过PET成像 18f-deg-vs-nt进行非常小的肿瘤的检测(特别是在腹部区域）。
[0011] 因此，本发明的一个方面涉及一类新的能够化学选择性标记靶化合物的放射性标 记试剂。根据本发明的该方面的放射性标记试剂通常包括乙烯基砜官能团和放射性标记同 位素，通式为*R-L_VS，其中*R是放射性同位素，L为连接基团，且VS代表乙烯基砜官能团。 [0012 ] *R放射性同位素可以是任何在本领域中公知的合适的放射性同位素。示例性放射 性同位素可以是1工、？、8^但不限于此。在一个优选的实施方式中，放射性同位素是 1中。此 优选实施方式在本文中也称为18F乙烯基砜或18F-VS。
[0013] 该连接基团L可以是任何具有可以容纳乙烯基砜官能团和R*放射标记的官能部分 的合适的分子骨架。示例性连接基团可以选自芳族、脂族、PEG、含有杂原子的连接基团，但 不限于此。
[0014] 本发明的另一个方面涉及一种用放射性标记来选择性地标记蛋白质或肽的方法。 根据本发明的这一方面的方法通常包括将如上所述的乙烯基砜放射性标记试剂连接至靶 蛋白质或肽的步骤。在一些实施方式中，提供或合成放射性标记试剂的步骤可以在连接步 骤前不久进行。本领域技术人员熟知，提供或合成步骤之前的时段受到所使用的特定*R标 记的半衰期的限制。在放射性标记具有较短的可用半衰期时，合成和连接*R_VS标记试剂至 靶蛋白/肽以及它们的最终应用之间的时间间隔较短。在这种情况下，放射性基团的连接必 须在使用标记的蛋白质/肽前很短的时间内发生，这需要当场执行所述标记方法的系统。在 其它情况下，当*R标记的半衰期长时，则靶蛋白质/肽的标记可以在大规模生产环境下非现 场进行，将得到的标记的蛋白质/肽以封装的形式递送。
[0015] 上述适用于被乙烯基砜标记试剂标记的蛋白质和肽一般包括至少一个半胱氨酸 残基或游离硫反应性官能团，其能够与标记物的乙烯基砜基团反应以形成稳定的连接。在 一些实施方式中，通过一个共价硫酯键形成连接。在其他实施方式中，可以通过非共价连接 进行连接。优选地，靶蛋白质/肽具有介于1至10个游离巯基反应性基团和/或半胱氨酸残 基。更优选地，所述靶蛋白质/肽还具有生物功能，如酶底物或涉及某些致病途径的结构成 分。在一个优选的实施方式中，靶蛋白质/肽是神经降压素或其变体、或巯基化神经降压素 变体、其他经稳定化的神经降压素、多聚体神经降压素、与其他配体的杂聚体神经降压素。 在一个更优选的实施方式中，标记放射性同位素是 18F。最优选地，所述放射性标记试剂是 18f-deg-vs，而所靶向的肽是神经降压素（即 18f-deg-vs-nt)。这种放射性标记的蛋白质或 肽可以在成像技术如正电子发射断层扫描(PET)中用作示踪剂。
[0016] 本发明的另一个方面涉及利用如上所述的本发明的新颖的示踪剂进行PET成像的 方法。
[0017] 根据本发明的这个方面的方法一般包括:给受试者施用有效量的18F-VS示标记踪 化合物的步骤;以及使用PET成像仪器对受试者在所关注位置进行成像的步骤。
[0018] 施用示踪化合物的方法通常是本领域已知的，其可包括但不限于静脉注射、口服 施用或其他本领域已知的方式。
[0019] 18F乙烯基砜至少具有下列优于18F标记马来酰亚胺的优点：1)一步法18F-氟化前 体，以得到18F乙烯基砜;2)用乙烯基砜与巯基的反应的产物得到了单一立体异构体的结构， 这不同于会产生两种可能的立体异构体的与马来酰亚胺的偶联;和3)这些乙烯基砜基团在 溶液中是长时间稳定的，因为它们在中性pH不水解(15)。因此，即使在水性缓冲液条件下使 用，它们保留优秀与含巯基的蛋白质或其他分子偶联的潜力。
[0020] 本发明的再一个方面是涉及通过利用上述的放射性示踪剂对生物或生理过程进 行成像的系统和装置。图7示出根据本发明的这个方面的系统/装置的示例性示意图。按照 本发明的这一方面的实施方式可以包括它们的传统的自动化或半自动化盒、微波反应器或 微流控反应器或者它们的等同物。
[0021] 本发明的其它特征、目的以及优点将通过说明书和附图以及由所附的权利要求变 得显而易见。
【附图说明】
[0022]图1示出了根据本发明实施方式的18F-标记化合物的示例性合成方案和HPLC图。 (A)F-DEG-VS的合成方案；（B)18F-DEG-VS粗反应的的HPLC图谱；（C)富集 18F-DEG-VS的HPLC 图谱。
[0023] 图2. (A)F-DEG-VS-c(RGDyC)和F-DEG-VS-c(RGDyK)的化学结构；（B)放射性-HPLC (UV)上的 19F-DEG-VS-c (RGDyC)、19F-DEG-VS-c (RGDyK)、18F-DEG-VS与c (RGDyC) /c (RGDyK) (放射)的粗反应以及19F-DEG-VS-c (RGDyC)标准物的HPLC图谱。
[0024] 图3示出了根据本发明实施方式的示例性放射合成方案。(A)18F-DEG-VS-NT放射合 成方案。（B) 19F-DEG-VS和NT的粗反应的HPLC图；（C) 18F-DEG-VS-NT (放射性)19F-DEG-VS-NT (UV)和（19F-DEG-VS) 2-NT (UV)的HPLC图谱。
[0025] 图4显示了按照本发明的实施方式的竞争性结合测试的示例性结果。125I-NT(8-13)和19F-DEG-VS-NT或NT (8-13)在HT-29细胞中的竞争性结合测试。数据为平均值土 SE (η = 3) J轴反映了非放射性标记竞争物的浓度。19F-DEG-VS-NT和ΝΤ(8-13)的IC5Q值分别为2.03 ±0.22nmol/L 和 2.12±0.26nmol/L〇
[0026] 图5.(A)携带HT-29异种移植体的小鼠在注射3.7MBq的不带未经放射标记NT(8- 13)的18F-DEG-VS-NT (上图）或带未经放射标记NT (8-13)的18F-DEG-VS-NT (中图）之后以及 在注射3.7MBq的18F-FBEM-NT(下图）之后的代表性冠状显微PET图像；（B)在携带HT-29异种 移植体的小鼠中在注射后(P. i .) 2小时的18F-DEG-VS-NT生物分布。
[0027] 图6示出18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT在尿、肿瘤、肾和肝中的代谢稳定性。 18F- DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT的保留时间分别为18.5分钟和19.0分钟。
[0028] 图7示出在根据本发明的该方面的系统/装置的示例性示意图。
[0029] 图8.18F-DEG-VS-NT于37C在1 XPBS中温育5小时后的放射HPLC示踪。
[0030]图9.18F-DEG-VS-(Ac)-NT的放射合成方案和相应的放射HPLC示踪。
[0031 ]图10.18F-DEG-VS-c(RGDyC)标准物和在尿中的代谢稳定性的放射性HPLC图谱。 [0032]图 11 · (A)18F-FBEM的放射合成方案；（B)18F-FBEM-c(RGDyC)和 18F-FBEM-NT的化学 结构。
[0033]图12.18F-FBEM-c(RGDyC)标准物和在尿中的代谢稳定性的放射性HPLC图谱。
[0034] 图13·(A)注射18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后2小时的携带HT-29肿瘤的小鼠的二维 投影显微PET图像（箭头表示HT29肿瘤）；⑶注射 18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后的肿瘤、肾、 肝、肌肉的时间活性曲线。
【具体实施方式】
[0035] 定义
[0036]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普 通技术人员能通常理解的相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文本(包括定义)为准。在 此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以整体并入本文。本文公开 的材料、方法和实例只是说明性的，并不旨在进行限制。
[0037] 如本文所用，术语"氨基酸"是D或L形式的天然氨基酸残基（例如Ala、Arg、Asn、 Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和 Val)，以及具有一个或多个开放价的非天然氨基酸(例如，磷酸丝氨酸;磷酸苏氨酸;磷酸酪 氨酸;轻脯氨酸；γ -羧基谷氨酸；马尿酸;八氢吲哚-2-羧酸;抑胃酶氨酸；1，2，3，4-四氢 异喹啉-3-甲酸;青霉胺：鸟氨酸;瓜氨酸; α_甲基丙氨酸;对苯甲酰基苯丙氨酸；苯基甘氨 酸;炔丙基甘氨酸;肌氨酸;和叔丁基甘氨酸)残基。该术语还包括携带有氨基保护基(例如 乙酰基、酰基、三氟乙酰基或苄氧基羰基）的天然和非天然氨基酸，以及在羧基处被保护基 团保护(例如，保护为(Q-C6)烷基酯或酰胺、苯基酯或酰胺或者苄基酯或酰胺）的天然和非 天然氨基酸。其他合适的氨基和羧基保护基团也是本领域技术人员已知的(例如，参见T.W. Greene^Protecting Groups In Organic Synthesis;Wiley:New York，1981;D·Voet， Biochemistry?ffiley：New York?1990；L Stryer^Biochemistry?(3rd Ed.)?ff H.Freeman and Co:New York，1975;J.March，Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Structure，（2nd Ed·)，McGraw Hi 11:New York，1977;F·