一种以树枝状聚乙烯亚胺为模板剂和催化剂制备大孔生物活性玻璃纳米簇的方法与流程

【技术领域】

本发明涉及一种用于骨组织修复与再生、蛋白及药物递送以及基因治疗的大孔生物活性玻璃纳米簇的制备技术，具体涉及一种以树枝状聚乙烯亚胺为模板剂和催化剂制备大孔生物活性玻璃纳米簇的方法。

背景技术：

生物活性玻璃是一种以三维硅氧四面体形成的玻璃网络为基础，掺入ca，p和na等其他元素作为改性剂的硅酸盐玻璃。由于生物活性玻璃具有良好的生物活性，生物相容性及成骨基因激活能力，能与骨组织和软组织形成化学键合并且促进，因此在骨缺损及皮肤组织的修复与重建等方面得到了广泛的应用。

微纳米生物活性玻璃因为具有相对较小的尺寸以及多样的结构，有着更加优越的性能。而传统方法制备的生物活性玻璃大多形状不规则、粒度不均匀，由于孔径和孔容过小，药物和基因运输的效率过低，从而限制了微纳米生物活性玻璃的广泛应用。因此，近年来逐渐发展出各种具有特定形貌、尺寸均匀且分散性能良好的微纳米生物活性玻璃材料，旨在通过调整微纳米生物活性玻璃特殊的形貌来提高生物活性玻璃的骨、齿缺损修复效率、基因和生长因子装载效率等性能。

高分子模板技术是合成生物活性玻璃的一种常见方法。主要是利用某些两亲表面活性剂大分子，嵌段共聚物或生物大分子在反应体系中通过自组装形成特定的形态结构，作为纳米颗粒形成的结构导向剂或者形态模板剂。目前已有使用高分子模板剂吐温-80合成纳米线组成的生物活性玻璃纳米簇，聚乙二醇作为模板剂合成的生物活性玻璃微球等技术，其所使用的模板剂多为线性高分子。但还未有人尝试利用聚乙烯亚胺这种树枝状的高分子作为模板剂来调控生物活性玻璃的形貌和尺寸。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以树枝状聚乙烯亚胺为模板剂和催化剂制备大孔生物活性玻璃纳米簇的方法，该方法初次使用树枝状的高分子作为模板剂与催化剂调控生物活性玻璃的形貌和尺寸，操作简单，反应条件温和，可制备不同尺寸的生物活性玻璃纳米团簇。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种以树枝状聚乙烯亚胺为模板剂和催化剂制备大孔生物活性玻璃纳米簇的方法，包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺溶于醇水溶液中，醇与水的体积比为3:1，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；

2)硅烷的水解与缩合：将硅烷在搅拌下逐滴加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，开始水解与缩合反应；

3)加入钙源和磷源：将磷酸三乙酯和四水合硝酸钙在搅拌下加入上述反应体系中，反应完全得到乳白色生物活性玻璃溶胶-凝胶；

4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶进行洗涤，干燥和煅烧，得到生物活性玻璃纳米团簇。

进一步，所述步骤1)中树枝状的聚乙烯亚胺为分子量mw为25000的氨基封端的树枝状聚乙烯亚胺。

进一步，所述步骤2)中加入的硅烷，使聚乙烯亚胺的摩尔量为硅烷摩尔量的10％～30％。

进一步，所述步骤1)中聚乙烯亚胺的溶解温度为40℃，在磁转子的搅拌下溶解。

进一步，所述步骤2)中所用硅烷为正硅酸乙酯。

进一步，所述步骤1)中醇水溶液为乙醇水溶液，步骤2)中硅烷按照硅烷与乙醇的体积比为1:(40～80)的量加入。

进一步，所述步骤3)中待步骤2)加入硅烷反应30分钟后，在磁转子搅拌下加入磷酸三乙酯，反应30分钟后将四水合硝酸钙溶于微量去离子水中、并在磁转子搅拌下加入反应体系中，40℃反应3小时得到乳白色生物活性玻璃溶胶-凝胶。

进一步，所述步骤3)中加入的磷酸三乙酯和四水合硝酸钙的投料比按si：ca：p原子数比80：16：4或si：ca：p原子数比60：36：4。

进一步，所述步骤4)中得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶使用无水乙醇和去离子水各洗涤3次；然后将生物活性玻璃在-80℃的冷冻干燥机中干燥过夜。

进一步，所述步骤4)中生物活性玻璃煅烧的具体过程是将生物活性玻璃置于马弗炉中，以2℃/min的速度从室温升温到350℃，并在350℃下煅烧3小时后，再由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果及优点：

1)本发明首次利用树枝状的聚乙烯亚胺高分子作为模板剂和催化剂，调控生物活性玻璃的形貌和尺寸，聚乙烯亚胺特殊的树枝状结构使生物活性玻璃形成了特殊的类似于枝状的纳米团簇，可广泛应用于药物、蛋白或基因的运输；本发明中聚乙烯亚胺的投料比在一定范围内越小，将导致生物活性玻璃纳米团簇的尺寸越小，因此通过控制聚乙烯亚胺的投料比可制备出不同尺寸的生物活性玻璃纳米团簇以满足实际应用中的需求；

2)本发明中生物活性玻璃纳米团簇的制备技术简单易行，反应条件温和，制备的生物活性玻璃具有良好的生物活性和生物相容性；

3)本发明中生物活性玻璃纳米团簇的大孔结构使其孔径远远大于传统的小孔和介孔微纳米生物活性玻璃，大的孔径使其具有良好的基因负载能力，并且能保护基因不受酶的降解作用，从而将基因安全送到靶向细胞或组织，使基因能有效的发挥作用，是非常有潜力的非病毒基因载体，可用于组织的修复与重建及癌症治疗等生物医学领域。

【附图说明】

图1为本发明制备的生物活性玻璃纳米团簇的透射电子显微镜照片，其中，图1(a)为聚乙烯亚胺摩尔量为正硅酸乙酯摩尔量的10％时制备的生物活性玻璃，命名为10％bgnc，同理，图1(b)为20％bgnc，图1(c)为30％bgnc。

图2为本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇在模拟体液(sbf)中进行矿化实验后的透射电子显微镜照片，其中，图2(a)为10％bgnc矿化1天，图2(b)为20％bgnc矿化1天，图2(c)为30％bgnc矿化1天。

图3为本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇对骨髓基质干细胞(bmscs)细胞毒性的测定。

图4为本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇作为基因载体用于细胞基因转染结果。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明做详细描述：

本发明致力于以树枝状聚乙烯亚胺高分子作为模板剂和催化剂，制备一种大孔生物活性玻璃纳米团簇。一方面，聚乙烯亚胺作为催化剂，可有效的催化硅烷的水解缩合反应，从而形成硅氧网络，促进反应的进行。另一方面，聚乙烯亚胺树枝状大分子作为模板剂，发挥了结构导向的重要作用，其特有的树枝状结构使生物活性玻璃形成了类似于枝状的纳米团簇结构，并且聚乙烯亚胺可以组装入纳米生物活性玻璃团簇的网络结构中从而产生介孔和大孔结构。生物活性玻璃纳米团簇特有的大孔结构使其具有优异的基因负载能力，在组织工程和基因治疗等生物医学领域具有很大的应用潜力。

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的10％；

2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到生物活性玻璃纳米团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例2

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的20％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例3

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的30％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例4

1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的10％；

2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到生物活性玻璃纳米团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例5

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的20％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例6

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的30％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:40；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例7

1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的10％；

2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到生物活性玻璃纳米团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例8

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的20％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例9

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的30％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照80si：16ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例10

1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的10％；

2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到生物活性玻璃纳米团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例11

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的20％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

实施例12

(1)聚乙烯亚胺醇水溶液的制备：将树枝状的聚乙烯亚胺在40℃下溶于醇水溶液中，得到透明的聚乙烯亚胺醇水溶液；其中，醇与水的体积比为3:1，分子量(mw)为25000的聚乙烯亚胺在磁转子搅拌下溶于醇水溶液，溶解的聚乙烯亚胺的摩尔量为反应中硅烷摩尔量的30％；

(2)硅烷的水解与缩合：正硅酸乙酯在磁转子搅拌下逐滴缓慢地加入聚乙烯亚胺醇水溶液中，在40℃下开始水解和缩合反应，其中，硅烷与无水乙醇的体积比为1:80；

(3)加入钙源和磷源：在加入正硅酸乙酯30分钟后，缓慢加入作为磷源的磷酸三乙酯反应30分钟后，加入作为钙源的四水合硝酸钙，反应3个小时，得到乳白色的生物活性玻璃溶胶-凝胶溶液；其中，四水合硝酸钙先溶于微量去离子水中再加入到反应体系中，反应物按照60si：36ca：4p的投料比投料；

(4)纯化和烧结：将得到的生物活性玻璃溶胶-凝胶在9500rpm的转速下离心15分钟，去掉上清液后分别用无水乙醇和去离子水将得到的生物活性玻璃白色固体洗涤3次，随后在-80℃的条件下冷冻干燥过夜，最终将得到的生物活性玻璃白色粉体在马弗炉中进行烧结以去除模板剂，得到纳米生物活性玻璃团簇的白色粉体；其中，烧结条件为：将温度由常温以2℃/min的升温速度升到在350℃，在下350℃的条件下煅烧3小时后，将温度由350℃以1℃/min的升温速度升到650℃，煅烧3小时。

本发明制备过程中得到的生物活性玻璃经过煅烧后为白色粉体。

本发明制得的生物活性玻璃纳米团簇的形貌和尺寸对聚乙烯亚胺的投料量具有依赖性。图一为生物活性玻璃纳米团簇的透射电子显微镜照片，生物活性玻璃之所以是团簇状，这与模板剂聚乙烯亚胺的枝状结构有关。当聚乙烯亚胺加入反应体系中的摩尔量为正硅酸乙酯摩尔量的10％时，生物活性玻璃纳米团簇的尺寸为100nm左右，见图1(a)，当聚乙烯亚胺加入反应体系中的摩尔量为正硅酸乙酯摩尔量的20％时，生物活性玻璃纳米团簇的尺寸约为200-300nm，见图1(b)，当聚乙烯亚胺加入反应体系中的摩尔量为正硅酸乙酯摩尔量的30％时，生物活性玻璃纳米团簇的尺寸约为500nm，见图1(c)。因此，在一定范围内，随着聚乙烯亚胺的投料量的增加，所制备的生物活性玻璃纳米团簇的尺寸越来越大。这说明可以通过调控聚乙烯亚胺的投料比来调控生物活性玻璃纳米团簇的尺寸大小。

图2是本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇在模拟体液(sbf)中进行矿化实验后的透射电子显微镜照片，将生物活性玻璃纳米团簇以1.5mg/ml的浓度分散到sbf中后在37℃的环境中静置1天，随后将生物活性玻璃纳米团簇在sbf中的分散液进行离心，并用去离子水清洗3次，样品在-80℃的环境下干燥过夜。图2(a)为10％bgnc矿化1天，图2(b)为20％bgnc矿化1天，图2(c)为30％bgnc矿化1天的透射电子显微镜照片，从矿化后的生物活性玻璃纳米团簇的透射电镜照片中可以看出，所有的生物活性玻璃纳米团簇的表面都形成了明显的羟基磷灰石的层状结晶，这说明本发明中制备的生物活性玻璃纳米团簇具有良好的生物活性。

图3是本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇对骨髓基质干细胞(bmscs)细胞毒性的测定结果。将浓度为40μg/ml，80μg/ml和160μg/ml的10％bgnc与bmscs共同培养1天，3天和5天后测试细胞的毒性发现本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇对细胞的生长没有任何抑制作用，具有良好的细胞相容性。

图4是本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇作为基因运输载体，负载mirna后进行细胞转染后细胞摄取的结果。与本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇具有相同化学成分的一般的球状生物活性纳米玻璃微球以及常见的商业化基因载体lipofectamine^tm3000(lipo)作为对照，从结果可以看出本发明所制备的生物活性玻璃纳米团簇表现出了优于传统生物活性玻璃微球及lipo的基因负载效率，因此，有望成为一种新型的基因运输工具应用于组织工程和基因治疗中。

本发明中的生物活性玻璃的制备方法简单，反应条件温和；制得的生物活性玻璃具有团簇状的结构，且制备的生物活性玻璃纳米团簇的尺寸在一定范围内随着模板剂聚乙烯亚胺的投料质量的增加而增加，因此可通过调控模板剂聚乙烯亚胺的投料比来控制生物活性玻璃纳米团簇的尺寸，同时，聚乙烯亚胺可作为一种新型的模板剂用于纳米合成技术中；本发明制备的生物活性玻璃纳米团簇具有良好的生物活性和生物相容性，并表现出优异的基因负载能力，可广泛应用于骨组织修复与重建，药物递送及蛋白和基因的运输等生物医学领域。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。