专利名称：脂环二胺作为免疫调节剂的用途的制作方法
本申请涉及脂环二胺的新用途。
FR-A-1387971描述了新的脂环二胺及其制备方法。
以下通式代表的脂环二胺及其与无机或有机酸的加成盐具有影响脂类代谢的特性R-NH-K-Q-K-NH-R(I)其中Q代表相应于下式II-V的二价基团
K代表亚甲基，或当Q由式(II)代表时K为一连接键，R为选自以下VI-XVII的基团VI 苄基VII 由卤原子或一个、两个或三个三卤甲基取代的苄基VIII 取代的三卤甲基苄基IX 2，3-二氢化茚基X烷基XI 环烷基XII 环烷基烷基XIII 链烯基XIV 环烯基烷基XV 双环烷基XVI 双环烯基烷基XII 双环烷基烷基。
经长期研究后，申请人发现如上定义的产物具有显著的调节免疫的新颖特性。
实际上上述产物特别能够在与内源或外源性病态相关的功能紊乱中恢复细胞因子和/或其受体的基因表达。这些特性将在下文试验部分予以证实。
它们还能够刺激人体防卸必需的炎性分子的产生，如趋化因子(MIP1α，β和Rantes，其抗病毒特性已由例如Cochi等在《科学》(Science)，270，1811-1518，1995描述)。
式I二胺似作为TH1型细胞因子的刺激剂起作用，已知在艾兹病中这些细胞因子首先被扰乱(如IL2，IL12)；这些化合物通过这种机制可限制由HIV和其他疾病诱导的凋亡作用。
因而本发明的主题是如上所定义的式I化合物在制备免疫调节药物中的用途，物别是能够在与外源或内源性病态相关的功能紊乱中调节细胞因子和/或其受体的基因表达的药物，和在刺激产生细胞因子中的应用。
所述病态可与一种病毒侵入相关，如I型或II型艾滋病、疱疹、肝炎、乳头瘤，或与寄生虫的侵入相关，如利什曼病、疟疾或biharziose。这种病态也可能是医源的，例如由于免疫抑制剂如环孢菌等的作用或由皮质激素的作用或由肿瘤(特别是血液肿癌如骨髓瘤或组织肿瘤)引起。
相关病态尤其是一种自体免疫疾病，如类风湿性多关节炎、红斑狼疮或自体免疫性糖尿病。
对于上述式I化合物的更详细的定义以及它们的制备方法和已知的应用，可特别参见FR-A-1387971及其法国的和国外的等同物，特别是法国药物特殊专利号3559M。也有大量关于这些化合物的文献，特别是关于反式1-4双[2-氯苄基氨基甲基]-环己烷，又名AY 9944。
特别是，关于该物质的药理和毒理数据已在文献中大量记载。
本发明特别谈及上述一种化合物在制备用于治疗下述疾病的药物中的用途--病毒性疾病，
--寄生虫病，--肿瘤，--自体免疫疾病。
对于这些应用，特别使用这样的式I化合物，其中Q代表环己烷-1，4-二基，即Q为前述式II；特别是这样的式I化合物，其中R为苄基，或被卤素如氟、溴特别是氯取代的或被一、二或三个三卤甲基取代的苄基，或例如被一、二或三个卤原子或C1-C5烷基或烷氧基取代的三卤甲基苄基，尤其是化合物AY 9944，即下式化合物的二盐酸盐
以下试验部分证明的在与外源或内源性病态相关的功能紊乱中使细胞因子和/或其受体基因恢复表达的特性，指明了上述式I衍生物及其盐作为用于校正外源或内源病态相关的功能紊乱中细胞因子和/或其受体基因表达的药物的用途。
本发明的药物例如用于上述提及的病态的治疗，无论是治疗性还是预防性的。
特别用于治疗自体免疫疾病。
常用剂量根据所治疗主体和疾病而变化，例如对需此治疗的人，每日口服10mg到2g AY9944化合物。
作为药物，上述式I化合物及其盐可掺入在用于消化道或胃肠外的药物组合物中。这些药物组合物例如可为固态或液态，呈现今用于人类医学的药物形式，例如简单片剂或糖衣片剂、胶囊、粒剂、焦糖剂、栓剂、注射剂；按常规方法制备它们。活性成分可与常规用于药物组合物的赋形剂一起掺入组合物中，如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂，含水或不含水载体、动物或植物脂肪、石蜡衍生物、二元醇、各种润湿剂、分散剂或乳化剂、防腐剂。
另外还发现当将如上定义的式I免疫调节化合物与具有抗病毒性质的化合物(如DDI、DDC、抗蛋白酶，3TC和优选的AZT)结合时，如在下文试验部分所示，发现各自的效应得到加强。
因而本申请还涉及一种组合，特征在于它包括如果上定义的化合物，特别是反式1，4-双[2-氯苄基氨基甲基]-环己烷，和一种具有抗病毒特性的化合物。
抗病毒化合物优先选自DDI、DDC、抗蛋白酶、3TC和AZT。
图1显示终浓度为3×10-6M的AY 9944(AY)对来自艾滋病人的外周血培养物中存在的单核细胞数目(T4＝400/mm3)的作用。横坐标为以天表示的培养时间，纵坐标为每孔的细胞数目。
图2显示浓度为3×10-6M的AY 9944(AY)对来自艾滋病人的外周血培养物中存活细胞百分率的作用(T4＝400/mm3)。横坐标为以天表示的培养时间，纵坐标为细胞死亡的百分率。
图3显示浓度为3×10-6M的AY 9944随着培养时间对培养基中的RT活性的作用。
图4显示浓度为3×10-6M的AY 9944对从健康主体(对照Tém)或不同的艾滋病人(1-5)分离的外周血淋巴细胞群中表达IL-2受体的细胞百分率的作用。
图5显示几种受试物质在3×10-6M浓度下对表达CD4的外周血淋巴细胞的百分率的作用。对照为未处理的艾滋病人外周血淋巴细胞(T4约为400/mm3)。
图6表示试验物质对逆转录酶活性的影响，对得自艾滋病人单核细胞的细胞提取物测定。
图7表示试验物质在3×10-6M剂量下抗HIV-1IIIB病毒的细胞致病作用的效果，在得自健康主体的淋巴细胞中测定。
图8、9、10和11代表试验物质在3×10-6M剂量下分别对细胞因子IFN-γ、MIP1α、MIP1β、Rantes合成的作用。
下列实施例说明本发明。试验部分在Ficoll梯度上分离来自艾滋病人的单核细胞，37℃下用植物凝集素(PHA)活化一夜。然后洗涤，在40UI/ml白介素-2(重组的，Roussel-Uclaf)存在下、在有或无试验浓度(即3×10-6M)的AY 9944存在下，以8×105/ml的比例在补有10％脱补体胎牛血清的RPMI培养基中培养。在用一种或多种试验物质和更新培养基处理或不处理下，每3天对细胞存活进行计数和检测(台盼蓝试验)。
利用与荧光素偶联的抗辅助T淋巴细胞特征性CD4膜抗原的单克隆抗体，借助于细胞筛分仪(“FACS”Beckton-Dickinson)定期进行细胞分类。实施例1对细胞增殖和存活百分率的作用图1显示，来自艾滋病供者的血中存在的单核细胞数目(T4400/mm3)略有增加，感染细胞中10天后降低(病毒的细胞致病作用和凋亡进程)，而相反在用3×10-6M的试验分子(AYAY 9944)处理的感染培养物中观察到大量的增殖。因此，例如对于AY 9944，培养15天后细胞数目比未处理培养物中的高5-7倍。
另外，在图2中可以看到，例如用AY 9944处理的培养物中，培养中死亡细胞的百分率在感染后保持在10％左右，而在感染但未处理的培养物(对照)中，死亡百分率在感染后15天达到约70％。另外，因为已知细胞死于艾滋病病毒所致的凋亡，因而可从中得出结论AY 9944具有抗细胞凋亡作用。这种抗凋亡效果从下述对细胞因子的作用结果得到证实。
因此，培养基中式(I)化合物的存在保护单核细胞对抗病毒的细胞致病作用，使细胞在凝集素(PHA)存在下能大量增殖。实施例2对培养基中逆转录酶(RT)活性的作用按Barré-Sinousi等(科学，1983，220868)描述的方法测定逆转录酶(RT)活性。在不同的培养时间在感染细胞的培养基中测定了RT活性。
图3所示结果清楚地表明在用AY 9944处理的培养物中，介质中的RT活性保持极低水平，而在未处理培养物的上清液中却升高了1000％以上。这种惊人的效果令人想到，此类化合物急剧减低病毒量。另外，将在以下看到这不是对RT酶的直接抑制，而是通过其他机制对病毒产量的抑制。实施例3对白介素2(IL-2)受体表达的作用白细胞介素2是在免疫系统的调节中起基本作用的一种细胞因子，特别是对辅助T淋巴细胞增殖的调节，人们已知辅助T淋巴细胞在艾滋病中尤其受影响。图4显示对AY 9944处理的培养物中IL-2受体表达的特别显著的刺激。有趣的是注意到，在对来自5位不同病人的外周血淋巴细胞进行的这项研究中，在每例中都观察到IL-2受体大量增加，包括第4号病人，其中受体表达水平以前没有显著的降低。在这后一例中，与对照(正常人外周血淋巴细胞)相比，IL-2受体超量表达。对于第1、2和5号病人，受体表达的百分率从15-18％(对照为40％)达到30-45％，即该受体表达程度得到了真正的正常化。最后可注意到受试物质对健康人外周血的淋巴细胞(对照)没有明显影响。
这一效应是很重要的，IL-2被视为在免疫中起主要作用的细胞因子之一，其生产的失调可能是HIV感染后观察到的疾病的关键所在。IL-2受体率的下降实际上与CD4计数以及与病毒量相关。另外最近的试验证明早熟表达的病毒蛋白Tat抑制IL-2信使的表达(Chirmule等，1995，病毒学杂志(J.Virol.)69492)。实施例4对表达CD4的细胞百分率的作用人们已知表达CD4标志的T4淋巴细胞的数目下降是艾滋病感染最显著的特征之一，以致“CD4”计数成为跟踪艾滋病发展的最有用的参数之一。图5显示表达CD4的细胞百分率显著的回升(利用抗CD4的荧光抗体用FACS检测)。在此系列试验中，证明AY 9944(AY)最有效，使CD4+细胞百分率升高约30％(在对照中，病人外周血淋巴细胞，未处理)至约70％(在两种上述化合物存在下培养的外周血淋巴细胞中)。
综上所述，在AY 9944处理后，观察到了对细胞增殖和对细胞生存率的积极作用、病毒量的下降、对白介素2信使和白介素2的受体Tac的表达刺激、以及最后提高CD4+淋巴细胞的百分率、重建正常的CD4/CD8比例。值得注意的是，当受试物质以10-7M或10-8M的浓度使用时，得到了相似的结果。实施例5转录水平的作用研究了AY 9944对IL12(由抗原呈递细胞分泌)的信使RMA表达的影响，IL12是一种在T淋巴细胞增值中同样起重要作用的白细胞介素。裂解106个细胞，按常规技术提取DNA，在商业逆转录酶的作用下获得相应的RNA，然后利用相应于所研究RNA的引物进物PCR扩增。结果显示AY 9944可提高编码IL12的信使RNA的表达。用下式的不同引物实施PCR技术TL 12-P35(+)5′CAT GCT-TTC AGA ATT CGG GC 3′TL 12-P35(-)5′GTT AGC TCA GAT GCT TTC ATG 3′TL 12-P40(+)5′CCC TGA CAC CTG GAG TAC TC 3′TL 12-P40(-)5′GGC TAT ACC ATG AAG CCT AG 3′这相应于IL12的两个亚单位(P401-4道；P355-8道)。对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的mRNA进行了对比研究(9-12道)。
因此，看来试验物质的作用机制中有转录水平的，这样就恢复了被HIV-1类逆转录病毒所抑制的某些基因的表达。从而观察到对病原体引起的基因组水平早熟紊乱的上游作用。实施例6细胞分化水平的作用还进行了另外的试验以研究AY 9944对单核细胞分化状态的影响。在AY 9944存在下培养6天后，得自艾滋病人外周血的单核细胞群中活化巨噬细胞的百分率显示净增长。实施例7对体外测定的逆转录酶(细胞提取物)的作用还证明了AY 9944处理的培养物上清中显示的RT活性的降低(见图3)不是由于化合物的直接抑制。图6显示受试物质在所用浓度范围内(10-6-10-5M)对于细胞提取物都没有显著地抑制RT活性。
用AY 9944获得的结果显示在左起的第3、4柱，向右的其他柱代表其他受试物。
总之，式(I)化合物未显示为逆转录酶的抑制剂。这与其活性的新颖特点符，所述化合物与现用的AZT类药物没有共同的作用点。实施例8体外保护阳离子两亲性分子处理的淋巴细胞对抗HIV感染使用了用强毒株(HIV-IIIB)体外继发感染的来自健康个体外周血的淋巴细胞，以检查受试物对抗大病毒量的作用。图7表明，此时用化合物(3×10-6受试物)在感染前预处理一周，AY 9944保护这些细胞对抗病毒的细胞致病作用。实施例9-12在Ficoll梯度上分离来自艾滋病人的单核细胞，37℃下用植物凝集素(PHA)活化一夜。然后洗涤，在40UI/ml白介素-2(重组的，Roussel-Uclaf)存在下、在有或无试验浓度(即3×10-6M)的AY 9944存在下，以8×105/ml的比例在补有10％脱补体胎牛血清的RPMI培养基中培养。在用一种或多种试验物质和更新培养基处理或不处理下，每3天对细胞存活进行计数和检测(台盼蓝试验)。
第10天分别测定培养基中产生的IFN-γ，MIP1α、MIP1β、Rantes的量。结果报告在图8、9、10、11中。左边的两柱相应于一个病人(F7)，另外两柱相应于另一病人(F130)。对于每位病人，左侧柱(-)代表无AY 9944时的产量，而右侧柱(+)代表有AY 9944时的产量。
在每一例中都观察到这些细胞因子的合成在AY 944存在下大大增强，其产量在四周的培养中保持高水平。实施例13AY 9944和抗病毒化合物的协同作用用病毒株HIV-HTLV IIIB感染H9人细胞系。
每3天将这些淋巴细胞以3×105细胞/ml重悬在加有10％胎牛血清的RPMI培养基中。
在此培养基中加入AY 9944、AZT或AY 9944和AZT的混合物。
培养30天后，用P24试验检查病毒的存在，用氚标胸腺嘧啶的掺入检查细胞增殖，用台盼蓝排斥试验检查细胞存活率，以及这些细胞表达的CD4分子的百分率。
结果报告在下表中，-v表示“无病毒”，+v表示“有病毒”。
观察到在3×10-8M的AY 9944和1μg/ml AZT的剂量下有强协同作用，而单用AY 9944即使在3×10-6M剂量下作用也较弱(P24＝70)，1μg/ml的AZT根本没有作用(P24＞1000)。
还观察到AY 9944对被病毒抑制的细胞增殖有恢复作用。
还观察到细胞死亡率的降低(从仅用1μg/ml AZT的58％到加入浓度仅为3×10-8M的AY 9944时的11％)。
最后观察到在向AZT(1μg/ml)中加入3×10-8的AY 9944时CD4表型的恢复，从26％到正常值83％。
结果列在下表中，它表示AZT和AY 9944对HIV增殖、淋巴细胞的病毒裂解和CD4抗原表达的联合作用。这些结果是在用分离株(HIV-1IIIB)感染的IH9细胞培养4周后获得的。将这些淋巴细胞每3天进行一次传代，以3×10-5/ml的浓度接种。
如表中结果所示，具有抗病毒作用(P24＝0)的10μg/ml AZT也对H9免疫细胞系具有抑制作用，因为使用AZT时细胞增殖被降至28000cpm。向该浓度的AZT中加入AY(表中第6行)使细胞增殖升至47000cpm。这表明，对于具抗增殖效果的药物(AZT 10μg/ml)的作用，AY 9944对细胞增殖有恢复作用。
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实施例14制备了具有如下配方的片剂反式1-4双[2-氯苄基氨基甲基]-环己烷二盐酸盐10mg足量赋形剂至最终片剂达100mg(赋形剂具体为乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸镁)。实施例15制备了具有如下配方的可分割片剂反式1-4双[2-氯苄基氨基甲基]-环己烷二盐酸盐15mg足量赋形剂至最终片剂达100mg(赋形剂具体为乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸镁)。实施例16制备了具有如下配方的可分割片剂反式1-4双[2-氯苄基氨基甲基]-环己烷二盐酸盐15mgAZT 100mg足量赋形剂至最终片剂达250mg(赋形剂具体为乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸镁)。
权利要求
1.通式(I)化合物和其与无机或有机酸的加成盐在制备免疫调节药物中的用途R-NH-K-Q-K-NH-R(I)其中Q代表相应于下式II-V的二价基团
K代表亚甲基，或当Q由式(II)代表时K为一连接键，R为选自以下VI-XVII的基团VI 苄基VII 由卤原子或一个、两个或三个三卤甲基取代的苄基VIII 取代的三卤甲基苄基IX 2，3-二氢化茚基X烷基XI 环烷基XII 环烷基烷基XIII 链烯基XIV 环烯基烷基XV 环烷基XVI 环烯基烷基XII 双环烷基烷基。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述免疫调节剂在与外源或内源性病态相关的功能紊乱中校正细胞因子和/或其受体基因的表达。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于所述病态与病毒侵入相关。
4.根据权利要求2的用途，其特征在于所述病态与寄生虫侵入相关，如利什曼病、疟疾或biharziose。
5.根据权利要求2的用途，其特征在于所述病态与医源侵犯相关，例如由免疫抑制剂如环孢菌素的作用或由皮质激素的作用所引起。
6.根据权利要求2的用途，其特征在于所述病态与肿瘤侵犯相关，例如血液肿瘤如骨髓瘤，或组织肿瘤。
7.根据权利要求2的用途，其特征在于所述病态与自体免疫病的侵犯相关。
8.根据权利要求3的用途，其特征在于所述病态与I型或II型HIV的病毒侵入相关。
9.根据权利要求1-8之一的用途，其特征在于化合物为其中Q代表环己烷-1，4-二基，K代表亚甲基，R代表苄基或由卤原子或一个、两个或三个三卤甲基取代的苄基或取代的三卤甲基苄基的式(I)化合物。
10.根据权利要求1-8之一的用途，其特征在于式(I)化合物为反式1-4双[α-氯苄基氨基甲基]-环己烷二盐酸盐。
11.一种如权利要求1、9和10之一所定义的化合物和一种具抗病毒特性的化合物的组合。
12.根据权利要求11的组合，其特征在于所述抗病毒化合物选自DDI、DDC、抗蛋白酶、3TC和AZT。
全文摘要
本发明公开了式(Ⅰ)R－NH－K－Q－K－NH－R化合物和其与有机或无机酸加成盐的用途,式中Q为式(Ⅱ)到(Ⅴ)的二价基团;K为亚甲基,或当Q为式(Ⅱ)基团时,K为连接键;R为选自苄基、由卤原子或三卤甲基取代的苄基、2,3－二氢化茚基、烷基、环烷基、环烷基烷基、链烯基、环烯基烷基、双环烷基、双环烷基烷基、双环烷基烷基。还描述了用于校正细胞因子和/或其受体基因的表达以治疗与外源或内源病态相关的功能紊乱的药物的制备。
文档编号A61K31/132GK1193910SQ9619653
公开日1998年9月23日 申请日期1996年8月2日 优先权日1995年8月3日
发明者J－C·马奇勒, A·阿果尔, J－C·朗杜里奥, D·查古芮 申请人:新疫苗公司