专利名称：含有具有rgd氨基酸序列的肽表面涂层的骨替代材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂层的多孔聚合材料的骨替代材料。
骨替代材料指由于疾病或意外伤害引起的外科手术后的损伤而被用作替代或再构成骨结构的植入物的材料。可提及的实例为成形植入物，如各种类型的骨修补物、例如髓状爪、骨螺旋和骨合成板形式的骨连接部件、用于填充骨松质缺乏或拔牙后留下的洞以及用于上颌面区的外形缺陷的整形外科治疗中的植入物材料。
被认为尤其可用于掺合过程的植入物材料为具有高生物活性的那些，即被身体接受并整合进去的那些。在骨替代材料的情况下，这指与内源组织，尤其是与骨的牢固永久性粘着不久即应发生。
业已知至今最有利的掺入结果是实际上仅使用内源材料而获得，也就是说使用骨移植物。骨移植物的可获得性受其性质的限制。如果实际上其能以适宜形状和数量获得，自身移植物，也就是说来自相同个体的移植物，仅可通过至少另外一项外科手术来取得，这本身在取出部位导致另外的愈合过程。这原则上也适用于同种移植物，也就是说来自同种供体的移植物。在后一种情况下，还存在仍不能完全排除的相容性甚至被病毒，尤其是如肝炎和HIV病毒感染的危险的问题。而且，捐献材料在骨库中的储存非常昂贵，并且在最终分析中仅局限于一定的时间内。
取决于它们的性质和组成，由与身体无关的合成材料或与身体有关的材料制成的用于骨替代的植入物材料可能显示从生物惰性至生物活性范围的特点。然而，目前通过任何合成植入物材料都没有获得掺入内源骨移植物的结果。
最近的发现表明植入物材料掺入骨中之前必须进行表面的细胞集群。这之后是胞外基质的沉积和新的骨组织的形成。整个过程是多因素的，并相当大地受骨替代材料的性质，基层骨的活力和生物力学环境的影响。
业已知磷酸钙陶瓷、含有羟基磷灰石的骨粘合剂和尤其是特征在于亲水性表面的特定聚合物具有好或非常好的骨传导性质。然而，这些材料良好的骨传导性质通常不能与优化的生物力学性质相结合，以致陶瓷特别脆，并具有低的对骨的弹性要求的适应性。
随着整合素(细胞膜中的蛋白)的发现而找到了刺激细胞粘着于表面的可能性。整合素识别结构蛋白中的例如RGD序列的氨基酸序列并与其结合。这控制着体内细胞的粘着。
业已知为了加快植入物的掺入，对植入物表面提供可合成获得的具有RGD序列的肽。目前公开的植入物几乎均为金属修补物，尤其是由钛或钛合金制成。然而，仍不能获得具有可能接近掺入内源骨移植物的结果的具有说服力的这种类型的植入物。
因此，本发明基于提供不仅能产生细胞粘着，而且能被较快地整合到骨中，从而具有尽可能接近内源骨移植物的生物活性的骨替代材料这一难题。
现已发现这通过一种骨替代材料而得以实现，其中骨替代材料基本上由含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂层的多孔聚合物材料组成。
业已知对植入物表面提供合成可获得的具有RGD序列的肽。目前公开和试验的植入物几乎均为金属修补物，尤其是由钛或钛合金制成的。另外还已知(例如从WO 91-05036)用尤其是可能也具有RGD序列的肽处理表面，如聚合物、金属或还有陶瓷材料的表面。然而，在这种情况下，这些肽为特异性地共价结合。所述表面被适当地用反应基活化，并使用偶联剂与肽反应，其中肽为共价结合。然而，它不包含将导致根据本发明的被填充有(也就是说没有特定的共价键的形成)刺激植入物表面细胞粘着的肽的多孔聚合骨替代材料的线索。
因此，本发明涉及基于含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂层的多孔聚合材料的骨替代材料。
本发明尤其涉及为成形植入物形式的这种类型的骨替代材料。
本发明还涉及由两个或多个独立成分组成的植入试剂盒，其中一种成分包含根据本发明的骨替代材料，另一种成分包含具有RGD氨基酸序列的肽的液体制备物。
本发明进一步涉及具有RGD氨基酸序列的肽在填充用于骨替代的多孔和/或表面具有网纹的聚合材料表面，从而通过刺激细胞与该表面的粘着进行生物活化中的用途。
本发明进一步涉及一种通过刺激细胞与其表面粘着来生物活化基于多孔聚合材料的骨替代材料的方法，其特征在于该表面被涂覆有具有RGD氨基酸序列的肽的液体制备物。
聚合材料代表另外的为低生物相容性的材料，虽然其机械性质可适宜于骨的性质，但目前它们未被采用作为骨替代物，因为它们不与骨结合在一起。
本发明现在所涉及的是通过填充RGD肽来优化由于机械原因而非常可望作为骨替代物的这种低生物相容性的聚合材料，并获得生物相容性。
本文优选的多孔聚合材料基本上为聚丙烯酸酯和/或聚甲基丙烯酸酯、聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和/或聚四氟乙烯(PTFE)。当然还可以采用所述聚合物相互之间的共聚物和这些聚合物与其它聚合物的共聚物。技术人员通常已知这些类型的聚合材料的制备，而不需要在这里详细描述。
在一个优选的具体实施方案中，在根据本发明的骨替代材料中，多孔聚合材料本身为成形植入物形式，或在另一个优选的具体实施方案中，它形成成形植入物的表面或表面涂层。
根据本发明尤其优选的成形制品为具有部分或完全互连的孔系统的那些。可以例如类似于专利申请号EP0705609中描述的方法来制备具有这种孔系统的聚合物。然而，技术人员另外还熟知制备多孔聚合材料的一般方法，因此在这里不需要对此进行进一步的描述。此外，这种类型的材料还可从市场上购得。技术人员熟知它们的组成和加工它们的方法。
在本文中还优选的是尤其是为颗粒或纤维形式的聚合物和无机物或金属添加剂的聚合物或组合物。
如果聚合材料本身为多孔植入物形式，它可通过例如上述EP0705609中描述的方法，通过聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)的点熔结来制备。该方法基本上通过将三种不同的成分混合在一起来进行。其第一种成分为由丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的细粒聚合物(这些聚合物从市场上可购得)组成的固体成分，适宜时还含有其它添加剂，如聚合作用催化剂、X-射线对比介质、填料和染料。第二种成分为由丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯单体组成的液体成分，适宜时还含有添加剂，如聚合作用促进剂和稳定剂。第三种成分由最大粒径为0.5-10mm的生物相容性材料的粗粒子颗粒组成。优选的材料基于聚丙烯酸和/或聚甲基丙烯酸、聚烯烃、丙烯酸与苯乙烯和/或丁二烯的共聚物以及环氧树脂。将三种主要成分混合在一起。在将成分完全混合后，由于存在的催化剂聚合作用开始；组合物仍为液体或能在几分钟时间内发生塑性形变，此后出现凝固的终产物。因此，以这种方式可从优选具有内连多孔的骨粘合剂颗粒制备多孔植入物。接着根据本发明将这些材料用含有RGD的肽填充。在液体或塑性阶段，该多孔骨替代材料可以常规方式使用作为用于移植骨修补物的骨粘合剂。外科医生还能将组合物转化为任何形状和大小的成形部件，并且在凝固后植入它们用于骨损伤的重构或作为局部活性物质沉积至待处理的身体区域。
在一个优选的具体实施方案中，多孔聚合材料具有0.05-2.50mm的平均孔宽度，尤其优选0.10-1.25mm。
因此，根据本发明，成形植入物的表面具有多孔形状是必需的，其中该形状可通过例如提供具有多孔表面涂层或相应的粗糙表面的复合材料或骨粘合剂来实现。
如果多孔聚合材料形成成形植入物的表面或表面涂层，它们可由所有已知的常规植入材料组成，只要它们可被一层多孔聚合物层涂覆。可将植入材料分成以下的类型无机物，尤其是陶瓷材料、生理上可接受的金属材料、生理上可接受的聚合物材料和所述两种或多种类型材料的复合材料。
适宜的无机物材料的实例为基于含钙物质的材料，尤其如碳酸钙、磷酸钙和由这些化合物产生的系统。被提及优于磷酸钙的为羟基磷灰石、磷酸三钙和磷酸四钙。
然而，只有当它们被采用作为陶瓷时，也就是说为在足够高的温度下烧结的材料或加工件的形式时，基于无机物的植入物材料通常才能确保高的机械稳定性。
可在例如专利文件DE3727606，DE3903695，DE4100897和DE4028683中找到关于骨陶瓷和制备它们的尤其有利的方法的详细说明。
采用的金属材料主要为钛或钛合金。还尤其感兴趣的是其机械性质比纯聚合物覆盖显著更宽范围的混合材料。因此，除开使用RGD肽涂覆的聚合物作为骨替代物外，这种类型的材料与其它植入物成分的结合也是非常重要的。
可提及的这种结合的实例为将金属修补物(例如钛)与根据本发明处理的多孔聚合物混合。为此目的，例如将钛植入物以本质上已知的方式处理以用于与聚合物的混合。这可通过例如Kevloc方法或Sulicoater方法(描述在DE4225106中)来进行。接着以例如类似于EP0705609中描述的方式将多孔聚合物层加至预处理的钛表面。随后将修补物的聚合物涂覆的部分用RGD肽涂覆。
本发明的另一个优选的具体实施方案由下面的植入材料处理来代表。代替钛植入物，将由纤维状的复合材料(碳纤维和环氧树脂)制成的相应的植入物用例如PMMA的多孔层涂覆，此后进行肽的涂覆。这种类型的植入具有这一优点即适合于骨的弹性，产生无边界层的骨植入物界面以及实现从植入物至骨的最佳力的转移。
临床上，这避免通过应力保护的骨吸收，并且修补物被保持更长的时间。
加到适宜的植入材料的多孔聚合物层优选具有0.2mm-25mm的层厚度，尤其优选2.0mm-20mm。
平均孔宽度优选为0.05mm-2.50mm，尤其优选0.10mm-1.25mm的范围。
根据本发明可采用的具有RGD序列的适宜肽为包含氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的所有肽和具有非肽取代基的它们的化合物，它们能借助于肽和非肽取代基粘着于聚合物表面。
下面列出的优选的肽和肽化合物旨在仅作为例证，而不限制其特征，其中使用下面缩写Asp＝天冬氨酸Gly＝甘氨酸Arg＝精氨酸Tyr＝酪氨酸Ser＝丝氨酸Phe＝苯丙氨酸RGD(Arg-Gly-Asp)、GRGD(Gly-Arg-Gly-Asp)、GRGDY(Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr)、RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)、GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser)、RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe)、GRGDF(Gly-Arg-Gly-Asp-Phe)以及具有脂肪酸的肽化合物或其它丙烯酸取代的RGD肽。肽可为线性或环状。
用具有RGD序列的肽化合物或肽涂覆根据本发明的骨替代材料本质上并不困难。优选从适宜肽的适宜液体溶液开始，将要填充的物质浸入其中。本文可显示植入物表面的最终涂覆在一个宽的范围内相对独立于溶液的浓度。可使用极低浓度通过适当延长暴露时间获得完全的表面填充。
肽溶液的优选浓度范围可为10ng-100ug/ml。暴露时间优选为10分钟至24小时。
具有肽的表面涂层优选占自由表面的50％-100％。
而且，不用进一步处理，肽物质与聚合物表面紧密粘着。用常规方法，例如通过γ照射、加热或环氧乙烷消毒植入物，接着准备用于植入。
在一个优选的具体实施方案中，根据本发明的骨替代材料为即时可用的由两种或多种单独的成分组成的植入试剂盒的形式，其中一种成分包含多孔聚合材料，优选为成形植入物，另一种成分包括具有RGD序列的肽的液体制备物。这种类型的具体实施方案尤其有利于有效消除在长期贮存根据本发明制成的骨替代材料中可能产生的稳定性问题。通过在外科手术之前立即或期间，以指定的方式用含有RGD肽的溶液填充多孔聚合植入材料来使用根据本发明的这类植入试剂盒形式的骨替代材料。
因此，根据具体实施方案，本发明的骨替代材料代表同种或自身骨移植的至少等同的替代物，或在对于其它类型的骨替代的掺入性质方面显著的改善。
由于具有RGD序列的肽在多孔聚合植入物中的固定，根据本发明的骨替代材料不仅产生细胞粘着，而且还可通过实验证实骨中的这些植入材料的整合比未处理的植入物明显进行得更快。
如已描述的，RGD涂层对用于骨替代的植入物的掺入性质的有利影响可适用于事实上所有类型的骨替代材料和植入物材料，只要它们具有全部或部分由多孔聚合材料组成，或植入物被这种多孔聚合层涂覆的性质或设计。该要求还通过例如其表面具有多孔结构或至少粗糙的植入物来满足。
取决于掺入部位的要求和使用目的，根据本发明的骨替代材料原则上可不仅为成形植入物形式，而且可为粉末、颗粒、细粒或纤维形式。
甚至不用进一步解释可设想技术人员能在最广泛的含义上利用上面的描述。因此，优选的具体实施方案被认为仅为说明性的，而决不限制所公开的内容。
下面的实施例为本发明的代表性实例。
所有在上文和下文提到的申请、专利和公开的全部公开内容被本申请引作参考。
实施例1a)多孔聚合成形部件的制备用常规方法将低粘度的骨粘合剂(组成31g聚甲基甲基丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸[sic](94/6)共聚物，6g羟基磷灰石粉末，3g二氧化锆)与30ml甲基甲基丙烯酸酯单体一起搅拌。成分包括过氧化二苯甲酰/二甲基对甲苯胺起动系统。将100g纯的圆柱形的聚甲基聚丙烯酸颗粒(直径2mm，长度3mm)加入到此膏状物中，并与骨粘合剂膏状物充分混合。将混合的组合物放入聚丙烯塑模中并让其凝固约15分钟。结果为具有内[sic]连孔和孔隙度为20％的部件。
b)用RGD肽填充聚合成形部件将如a)中获得的成形部件浸入浓度为100ug/ml的四肽GRGD溶液中，暴露时间约60分钟以填充该RGD肽，并最终干燥。接着用细胞粘着试验测定涂覆的成功率。结果表明未填充的圆柱体最终未被细胞集群，而根据本发明的材料显示出扩展深入至孔的密集的细胞集落。
实施例2实验研究种类兔植入物a)多孔PMMA成形部件b)根据本发明的涂覆有GRGD的PMMA成形部件通过γ照射将骨植入物消毒，并植入兔股骨中。
植入部位植入左侧和右侧股骨的髌骨滑动轴中。
2周后，用组织学检测评价新骨形成和矿化。
结果a)PMMA植入床仅显示薄的新形成的渗透有结缔组织的小梁骨的圆形环。没有显示在粘着剂珠上的小梁骨的直接的重叠。
b)PMMA+GRGD在这种情况下可发现广泛的新的小梁骨的形成，并覆盖了四分之三的整个植入物；在粘合剂珠上小梁骨直接重叠。
权利要求
1.基于多孔聚合材料的骨替代材料，特征在于它含有具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂层。
2.根据权利要求1的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料为成形植入物形式。
3.根据权利要求1或2的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料形成成形植入物的表面或表面涂层。
4.根据权利要求1-3任一项的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料形成由无机或金属材料或复合材料组成的成形植入物的表面或表面涂层。
5.根据权利要求1-4任一项的骨替代材料，特征在于多孔聚合材料基本上为聚丙烯酸酯和/或聚甲基丙烯酸酯、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和/或聚四氟乙烯和/或这些聚合物与其它聚合物的共聚物。
6.根据权利要求1-5任一项的骨替代材料，特征在于这些多孔成形部件具有部分或全部内连孔系统。
7.根据权利要求1-6任一项的骨替代材料，特征在于具有RGD氨基酸序列的肽的表面涂层占自由表面的50％-100％。
8.由两种或多种独立成分组成的植入试剂盒，其中一种成分包含根据权利要求1-7任一项的骨替代材料，另一种成分包含具有RGD氨基酸序列的肽的液体制备物。
9.具有RGD氨基酸序列的肽在填充用于骨替代的多孔和/或表面具有网纹的聚合材料表面中的用途，从而通过刺激细胞与该表面的粘着进行生物活化。
10.通过刺激细胞与其表面粘着来生物活化基于多孔聚合材料的骨替代材料的方法，其特征在于该表面被具有RGD氨基酸序列的肽的液体制备物涂覆。
全文摘要
本发明涉及基于其表面涂覆有具有RGD氨基酸序列的肽的多孔聚合材料的骨替代材料。
文档编号A61L27/00GK1247474SQ98802485
公开日2000年3月15日 申请日期1998年2月11日 优先权日1997年2月20日
发明者B·尼斯 申请人:默克专利股份公司