粉状单薄片脂质体组合物的制作方法

专利名称：：粉状单薄片脂质体组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及稳定的单薄片脂质体粉状组合物，其包含至少一个外部的脂相和水性极性的内核，后者在常温下可以胶凝，本发明还涉及制备它们的方法以及它们作为营养补充方面和在药物组合物(作用于血脂)方面的应用。J.C.Hauton对那些悬浮于水性介质中、含有低浓度胶凝物质并具有内部胶凝核的质脂体进行过描述，他将它们称为Lipogelosomes。特别地，他发展了制备这类质脂体或Lipogelosomes的方法(欧洲专利0393049)，它们与常规质脂体所不同的是被包围的水相是以半固体凝胶形式存在，而不是以液体形式存在。其可以防止质脂体发生碰撞时出现融合。这些Lipogelosomes完全是从天然物质制备的，因此使不能耐受性风险降到了最低。特别地，上述提到的欧洲专利0393049中，在单薄片Lipogelosomes中，这些Lipogelosomes由双层界面相组成，或者在多薄片Lipogelosomes中，由双层界面相的复合体组成，它们以同心圆的方式叠加，并且具有胶凝化的被包围内部水性极性相，其中的胶凝物质(它们可聚合或不可聚合)选自多糖类，多肽类或聚丙烯酰胺类；例如非聚合的胶凝物质选自明胶，琼脂糖或角叉菜胶，聚合的胶凝物质选自聚丙烯酰胺胶。这些Lipogelosomes与用先有技术得到质脂体相比，其稳定性显著增加，这主要是由于在发生颗粒碰撞时不引起颗粒之间的融合。然而，它们的缺点是以液体的形式存在，这对于制备固体制剂来说是不合适的，因为后者更容易储存和给药。本申请人一方面通过选择外部脂相的脂类，另一方面通过选择胶凝剂，现已发现可以制备得到稳定的粉末状Lipogelosomes，作为营养补充剂和欲经口服途径给药的药物来说，其具有特别优良的性质，上述药物可以用于预防高脂血(高胆甾醇血或高甘油三酯血)；这是由于这些稳定的粉末状Lipogelosomes既可以通过口服途径直接给药，也可以在使用时方便地溶于水相中。正如所有的工业化国家一样，在法国心血管疾病是构成死亡率和发病率的主要原因，并代表着一种实实在在的财政负担(1992年，用去30,000,000,000法郎)。这个数字警告人们在所有的死亡中，有36.4％的死亡是由于心血管疾病引起的，其中包括20％由心脏病引起的死亡和12％由中风引起的死亡。为了便于比较，下面给出了由于各种癌症和突然死亡(包括意外死亡和自愿死亡)导致的死亡率，它们分别为24.2％和9.4％。在西方国家居民中如此高的心血管和心脏病发病率使得动脉粥样硬化成为健康领域内一个主要的社会经济罪魁祸首。因此需要一个长期的预防措施。借助低脂饮食方案(其可以结合或不结合药物)有可能降低高胆甾醇血。一种广泛用于高危人群(具有很高胆甾醇血水平)的方法是用消胆胺螯合肠道中的胆汁盐，研究表明用这种合成树脂进行慢性治疗可以降低心脏病的发病率(BMRifkind，Atherosclerosisreviews，1987，18，59-70)。然而很难想象用这种产品进行系统的长期预防，因为其既不容易操作，又显示出患者非常难于接受的副作用。尽管采用严格的低脂饮食方案对于治疗动脉粥样硬化来说似乎是一个最有效的方法，但经验表明这几乎是不可能的，因为牺牲胃肠道的良好感觉对于生活质量必将产生影响，进一步来说，其很难在发达国家现代社会的日常活动中得到应用。利用其它可以降低脂肪的制剂进行了一些尝试，它们作用于内部环境，例如HMGCoA还原酶抑制剂，其可以降低内源性胆甾醇的合成，并可以提高用于致动脉粥样化脂蛋白肝性受体的数量，因此降低了它们在血浆中的浓度(BMBrown等人，Atherosclerosisreviews，1987，18，85-93)。然而，当将药物预防措施应用于具有血脂蛋白谱(其处于所谓的“正常”界限内)但显然很健康的对象时，由于其具有的副作用，就会产生问题。可以用于人群水平的动脉粥样硬化长期预防的产品必须容易获得、长期有效、容易操作，并且具有最小的不需要的副作用。因此，显著的饮食措施应该用肠道水平的作用进行补充，其目的是降低甘油三酯脂解成为游离脂肪酸和甘油单酯的程度，并降低胶束相的产量，因为它们和胆甾醇由此被吸收。饮食中的甘油三酯的水解在胃中开始进行(舌下和胃中的脂酶)，并在十二指肠(胰腺中的脂酶)中继续，然后以乳剂的形式在肠道的近端进行有机化。主要由饮食和胆汁中磷脂组成(GNalbone等人，Lipids，1974，9，765-770)的上述乳剂的单层界面相与脂解的产物(甘油单酯和游离脂肪酸)以及胆汁盐成分相混合。除非去污剂分子(胆汁盐，离子化的脂肪酸和溶磷脂)的浓度达到某一个阈值(临界胶束浓度)，否则肠道界面相无法分离成胶束相。为了有效地抑制甘油三酯的肠道脂解并降低或甚至抑制胶束相(脂解产物在此吸收)的形成，J.C.Hauton已发现(Cab.Nutr.Diet.，1990，25，2，87-91)，以下条件是必须的-通过使部分来自于脂类乳剂颗粒界面相中的消化脂酶与竞争性的界面相进行结合，使之进行转化；且-将足够量的胆汁盐转化到所述的竞争性界面相上，以使它们的浓度降低到给出的阈值之下，从而可以防止胶束相的产生。因此需要解决的问题在于得到无毒的竞争性界面相，其应具有最大的表面积，同时具有尽可能小的体积，并且其可在消化期间进入近端肠道。最合适的结构便是小的单薄片脂质体。从工业生产以及操作和储存方便的角度进行考虑，这种脂类质体应该是稳定的。本发明中的粉末状稳定脂质体组合物给上述问题提供了一种有效的解决办法，一方面是由于其具有胶凝化的内部水性核，另一方面是由于这样一个事实它们可以粉末形式存在，既可以直接口服给药，也可以在使用时再溶于水相中进行给药。结果，申请者为自己确立了一个目标，即提供稳定的粉末状的，以脂质体为基础的组合物，其比其它用先有技术得到的组合物更能满足实际需要，除了具有显著改进的稳定性之外，它可以有效地预防和治疗高脂血症。本发明涉及欲进行口服给药的粉末组合物，其特征为-其基本由单薄片脂质体组成，该脂质体包含外部脂相，其由第4脂类肪(磷脂)组成，不包括第3类物质(胆甾醇，非离子化的长链脂肪酸)和第5类物质(胆汁盐和梭链孢酸)，以及内部的水性核，其形成了温度可逆的水性凝胶，并发散到达外部的脂相，其内部的水性核基本由至少两种不同的非可聚合胶凝剂G1和G2组成的混合物M组成，上述凝胶-溶胶相的转换点高于或等于37℃，其中G1为胶凝剂，选自明胶和角叉菜胶，例如kappa-角叉菜胶，并且G2为角叉菜胶(其性质与为G1选择的角叉菜胶不同，例如iota-角叉菜胶)和纤维素(例如羟丙基纤维素)，上述脂质体的直径在20nm至1mm之间，优选的是50nm至500nm；且-其以颗粒单位形式存在，颗粒单位的平均直径在10mm至1000mm之间，其由一或多个所述的脂质体、糊精或它们的混合物组成，脂质体被选自脱水的温度可逆的水性凝胶的基质所包围，上述的水性凝胶与所述的内核中的水性凝胶是一致的，平均来说，每克粉末中含有1016至1018个脂质体。在预防和治疗动脉粥样硬化和肥胖中，在实施较不严格(因而也更容易被接受)的低脂饮食制度(医生为接受治疗的失调患者所设计的方案)时，使用这类粉末状脂质体组合物被证明是很有效的。令人惊奇的是，这些粉状组合物保留了Lipogelosomes所有的特性，并且在一定的时间内，无论是以粉末形式，还是将它们置于悬浮液中，其都可以保持稳定，这是因为其保持了脂类性质(没有降解产物)的完整性，同时保持了胶凝剂，特别是G1和G2混合物(粘度、胶强度以及断裂强度(breakingforce)、分子量)性质的完整性。因此它们含有稳定的粉状Lipogelosomes。胶凝剂G1和G2在粘度、分子量和凝胶-溶胶相转换点(即熔点)等方面有所不同。对于胶凝剂G1来说，该温度低于或等于45℃，而对于胶凝剂G2来说，该温度高于或等于45℃。上述定义的含有至少两种胶凝剂G1和G2的混合物M显示出织构(texturometric)性质(胶强度和断裂强度)，从所得到的脂质体稳定性角度出发，这是很非常可取的。于是在5℃时，含有至少两种胶凝剂G1和G2的混合物M优先地显示出70-100％，优选的是81-89％的松弛特性，以及1000-1600g，优选的是1109-1503g的断裂强度。按照所述组合物的优选实施方案，所述的脂质体水性内核还含有至少一种配糖特性稳定剂和/或用于调节介质渗透性的试剂和/或至少一种表面活性剂。优选地，所述的粉末组合物包含25-75％(m/m)的第4脂类肪，5-45％(m/m)的胶凝剂，0-70％(m/m)的配糖特性稳定剂，0-15％(m/m)用于调节介质渗透性的试剂，0-20％(m/m)的表面活性剂以及0-15％(m/m)的糊精(主要是麦芽糖糊精和环糊精)，优选的是8-12％。根据本发明，所述Lipogelosomes内部水相含有一种胶凝剂成分，所述Lipogelosomes的外部脂层被另一种胶凝剂成分构成的基质所包围。根据所述粉末组合物的另一个优选实施方案，其包含70-95％的胶凝剂G1以及5-30％胶凝剂G2。根据本发明所述粉末组合物的另一个优选实施方案，配糖特性稳定剂为蔗糖、海藻糖以及其它保护剂。根据本发明所述粉末组合物的另一个优选实施方案，构成所述脂质体外部脂相的脂类优选地包含20-25％的磷脂酰胆碱，10-18％磷脂酰乙醇胺以及9-15％磷脂酰肌醇。所述的磷脂主要是从含有高含量磷脂的大豆蛋白中获得的。作为另一种选择，磷脂由纯化的磷脂构成，它们或单独存在，或以混合物的形式存在，优选地，其比例与上述定义中的相同。本发明还涉及制备本发明中的粉状组合物的方法，在该组合物中，颗粒单位的外部基质包含温度可逆的水性胶状成分，其包括下列步骤(1)通过以下步骤，在水相中制备具有胶凝内核的脂质体分散体(Lipogelosomes)，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶胶相的转换温度下，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，可以制备得到至少一种合适的胶凝剂，特别地，可以得到胶凝剂G1和G2的混合物M。(b)混合物在慢慢搅拌下，于5小时内，优选的是在真空条件下，将脂类混入(a)中得到的溶液，其形成乳剂，且(c)优选的是在真空条件下迅速地搅拌(b)中得到的乳剂，从而得到具有以水相形式存在(其中含有所述的胶凝剂)的胶凝内核的脂质体分散体(Lipogelosomes)，并且(2)使得到的分散体进行适合的直接干燥，得到粉末状的产品。根据所述方法的另一个优选实施方案，干燥是在通过雾化作用、凝聚作用、薄膜或颗粒化作用来进行的。本发明还涉及制备本发明中的粉状组合物的方法，在该组合物中，颗粒单位的外部基质包含温度可逆的水性胶状成分和/或糊精，其特征在于包括下列步骤(1)通过以下步骤，在水相中制备具有胶凝内核的脂质体分散体(Lipogelosomes)，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶液相的转换温度下，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，可以制备得到至少一种合适的胶凝剂溶液，特别地，可以得到胶凝剂G1和G2的混合物M溶液。(b)混合物在慢慢搅拌下，于5小时内，优选的是在真空条件下，将脂类混入(a)中得到的溶液，形成乳剂，且(c)优选的是在真空条件下迅速地搅拌(b)中得到的乳剂，从而得到所述的具有以水相形式存在(其中含有所述的胶凝剂)的胶凝内核的脂质体分散体(Lipogelosomes)，(2)至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相，其中分散有所述的脂质体，(3)加入至少一种合适的糊精，并且(4)使(3)中得到的产品进行雾化，得到粉末状的产品。根据所述方法的另一个优选实施方案，至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相的步骤(2)通过稀释和/或过滤作用来进行。与本发明的制备方法一致，步骤(a)中的水溶液包含有用于调节介质渗透性的试剂(例如0.9％NaCl)和/或配糖特性稳定剂和/或表面活性剂。令人惊奇的是，这些方法使得我们有可能在一个单一步骤的过程中，获得具有胶凝内相的稳定脂质体(Lipogelosomes)的粉末组合物，上述单一步骤由一个低速率的水相成分的相成熟(成熟意义上的)和一个随后的快速相分散(Lipogelosomes的形成)组成，其包含在此过程中在水相获得一个Lipogelosomes的稳定分散体，该分散体具有均匀的形态学，并适合进行干燥步骤；更具体地，所述的具有胶凝内核的脂质体分散体显示出下列形态学·具有直径为20nm至1mm的囊性结构，优选是为70-200nm，·阴性染色显微镜观察，冷断裂，冷转移以及原子作用力的显微镜检查具有磷脂双层特征性外观的囊泡或囊泡聚集；阴性染色使得我们有可能观察到包围着外部磷脂层的胶凝剂混合物M的或多或少的显著存在。·具有10-55％，优选的是30-50％胶凝内核的脂质体的多分散性。这一方法用于工业规模，具有再现性好和适应性强等优点。其进一步的优点是比起先有技术来说，更容易进行实施，正如欧洲专利0393049中所描述的，在先有技术中，需要进行超声、挤压或去除去污剂等步骤。根据所述方法的另一个优选实施方案，步骤(b)优选的是在小于200s-1的切变速率下进行的；作为一种通用的规则，切变速率可用下列比例得到搅拌单位的速率/反应器内壁到搅拌叶片末端的距离(也称为“空气缺口”)。本发明还涉及适合于调节胆甾醇血和甘油三酯血的营养补充剂，其特征是包含上述定义的粉末组合物，它可与或不与合适的赋形剂相结合。本发明还涉及欲进行口服给药的药物组合物，其包含本发明粉末组合物以及至少一种合适的载体；这些组合物特别适合于调节胆甾醇血和甘油三酯血，或作为治疗(其中应用了一或多种可以带来转氨酶或其它毒性源增加的活性成分)的辅助剂；这是因为本发明中稳定的脂质体的粉末组合物在限制肝中GOT和GPT水平增加方面具有显著的作用。无论是营养补充剂还是药物组合物均可以以固体形式(胶囊，片剂或可溶于水中的粉末)或液体形式(可以再溶于水溶液的本发明粉末组合物)存在。这些形式适合于口服给药。优选地，本发明中的营养补充剂和药物组合物欲以单位剂量的方式进行给予，其与构成本发明Lipogelosomes的磷脂的单位剂量一致，一般为0.01-0.07g/kg，日剂量为0.03-0.2g构成本发明Lipogelosomes的磷脂/kg体重，并可以2或3个亚剂量给药。除了上述以外，本发明还包括下面所述的及实施本发明方法的实施例及附图的其它描述，其中-图1显示了放射标记的脂类的分布(以百分比表示)(FA脂肪酸；MG单甘油酯；DG二甘油酯；TG三甘油酯)，它们存在于大鼠的胃容物中，这些大鼠在消化2小时后处死。-图2显示了发现于肠腔的放射标记的脂类与从大鼠胃中排除的脂含量相比(单位为dpm)的百分比，这些大鼠在消化2小时后处死(int.seg.的含义是肠道部分)。-图3显示了放射标记的脂类的分布(以百分比表示)(FA脂肪酸；MG单甘油酯；DG二甘油酯；TG三甘油酯)，它们存在于大鼠的肠腔中，这些大鼠在消化2小时后处死(int.seg.的含义是肠道部分)。-图4显示了发现于肠道粘膜的放射标记的脂类与从大鼠胃中排除的脂含量相比(单位为dpm)的百分比，这些大鼠在消化2小时后处死(int.muc.的含义是粘膜部分)。-图5显示了发现于血浆中的放射标记的脂类与从大鼠胃中排除的脂含量相比(单位为dpm)的百分比，这些大鼠在消化2小时后处死。-图6显示了发现于肝中的放射标记的脂类与从大鼠胃中排除的脂含量相比(单位为dpm)的百分比，这些大鼠在消化2小时后处死。-图7显示了发现于大鼠盲肠和粪便中的放射标记的脂含量(单位为dpm)的百分比，这些大鼠在消化24小时后处死。当然应该明白，所给出的这些实施例仅仅是为了说明本发明的主要内容，在任何意义上不对本发明构成限制。实施1胶凝剂G1和G2混合物的结构测量a)材料和方法测量在RheoTA-XT2i装置上进行，此研究主要注重于在断裂和松弛实验过程中，构成明胶和iota-及kappa角叉菜胶混合物的凝胶的行为。·样品的浓度溶于5mMNa2HPO4和0.9或2％NaCl介质中的7.5％(w/v)明胶/iota-/kappa角叉菜胶(80/17.5/2.5)的混合物。·制备胶凝剂的溶液将氯化钠溶于用叶轮和回旋式构件固定的混合器中，其中含有纯净水。混合15分钟(10转/分钟)；使混合器的温度上升至75℃(以10转/分钟搅拌45分钟)；在75℃下将胶凝剂(明胶和iota-及kappa角叉菜胶)加入混合器中；将搅拌叶轮的转速调至1500转/分钟；此溶解过程大约持续30分钟；当溶液澄清并且悬浮液中不含有任何颗粒物质时，溶解完毕。·样品的制备为了进行松弛实验，将45ml的凝胶投入处于加热状态的外直径为92±2mm平底Petri皿中。为了进行断裂实验，将30ml的凝胶投入处于加热状态的外直径为50±2mm结晶皿中。当将温度冷却至低于或等于37℃时，得到凝胶。在上述研究和实验温度下，与凝胶的最大水合一致的凝胶形成时间为2.5天。·操作条件为了进行松弛实验，在给定的时间内对凝胶施加压缩力。所应用的移动元件是一个直径为25mm的铝筒，其具有1.0mm/s、0.5mm/s的前速度以及10.0mm/s的后速度。30秒内移动元件的位移为1.0mm。为了进行断裂实验，所应用的移动元件是一个直径为10mm的硬橡胶筒，其具有1.0mm/s的前速度、速度及后速度。移动元件的位移为12mm。b)5℃下采用0.9％的NaCl进行实验得到的结果松弛(％)最小值81±2.2最大值81±0.8断裂力(g)最小值1109±25最大值1503±35c)温度及不同浓度氯化钠的影响作用的结果操作条件与a)中所述的一致，除了松弛实验中移动元件的位移有所不同(位移等于凝胶总厚度的20％)松弛(％)5℃下0.9％NaCl89±0.82％NaCl90±0.225℃下0.9％NaCl32±3.92％NaCl38±4.437℃下0.9％NaCl36±3.72％NaCl40±4.9断裂力(g)5℃下0.9％NaCl1413±662％NaCl1114±14325℃下0.9％NaCl211±2.72％NaCl173±1.537℃下0.9％NaCl25.7±2.42％NaCl45.7±3.9实施例2制备本发明(LGS)粉末组合物(其具有由脱水胶凝剂组成的外部基质)的方法1)制备具有胶凝内相的脂质体分散体(Lipogelosomes)-成分大豆卵磷脂11.915kg(7.943％)明胶B1507.149kg(4.766％)Iota-角叉菜胶1.565kg(1.043％)kappa-角叉菜胶0.222kg(0.148％)蔗糖8.936kg(5.957％)氯化钠1.073kg(0.715％)纯净水119.15(79.43％)总内容物150.01kg(100％)a)制备胶凝剂溶液此过程与实施例1相同。通过取样对溶液的性质进行验证，然后加入糖苷稳定剂(蔗糖)。b)将磷脂混入a)中得到的溶液中向混合器中加入大豆卵磷脂，该混合器的回旋式构件的转速为10转/分钟，叶轮的转速为1500转/分钟，此过程于真空条件下进行5小时(乳剂形成)。-最终的分散体可以通过提高回旋式构件(25转/分钟)和叶轮(2500转/分钟)的转速来获得，时间的长短应以是否能够获得小于40％的多分散性来决定。上述过程生成了在水溶液中的Lipogelosomes分散体。对在分散过程结束时分离出来的样品进行研究显示，囊性结构的直径为120±30nm。阴性染色显微镜观察，冷断裂，冷转移以及原子作用力的显微镜检查具有磷脂双层特征性外观的囊泡或囊泡聚集；阴性染色使得我们有可能观察到外部胶凝剂的存在，根据所选择的制备和/或分离方法，其或较显著或较不显著。2)生成的分散体的干燥在真空下(50-100mbar)，将生成的Lipogelosomes分散体的水溶液转移到干燥器中，保持大约4小时。此过程生成了相对均一的粉末，其具有非常浅的稻草黄色，并含有直径为0.1-1mm的细颗粒。也可以使用其它干燥方法。在电子显微镜下，可以观察到由于脱水作用，脂性的囊泡本身处于收缩状态。另外，还可以观察到，在液体状态下LGSs通常聚集在一个均一的胶凝基质内部。在有许多分离的囊性结构的环境下，干燥步骤将此胶凝的基质转化成为胶凝剂的干燥丝状体，无论是在聚集物的表面，还是在分离的囊性结构表面申请人认为形态学上的不同可能是在于，与湿LGS形式相比，干燥结构的LGS在脂类的代谢行为上有所差异。另一种干燥方法如下进行将Lipogelosomes分散体的水溶液直接分布到旋转鼓干燥器上(鼓的温度为120-150℃，旋转速度为3-6转/分钟)。然后使生成的“薄片”进行研磨，并用合适的滤栅进行校准。由此生成了Lipogelosomes粉末(下文中又称为LGS)，其具有上述所定义的特性。实施例3制备本发明(LGS)粉末组合物(其具有麦芽糖糊精组成的外部基质)的方法1)制备具有胶凝内相的脂质体分散体(Lipogelosomes)-成分大豆卵磷脂11.915kg(7.943％)明胶B1507.149kg(4.766％)Iota-角叉菜胶1.565kg(1.043％)kappa-角叉菜胶0.222kg(0.148％)蔗糖8.936kg(5.957％)氯化钠1.073kg(0.715％)纯净水119.15(79.43％)总内容物150.01kg(100％)a)制备胶凝剂溶液此过程与实施例2相同。b)将磷脂混入a)中得到的溶液中向混合器中加入大豆卵磷脂，其中的回旋式构件的转速为10转/分钟，叶轮的转速为1500转/分钟，此过程于真空条件下进行5小时(乳剂形成)。-最终的分散体可以通过提高回旋式构件(25转/分钟)和叶轮(2500转/分钟)的转速来获得，时间的长短应以是否能够获得小于40％的多分散性来决定。上述过程生成了在水溶液中的Lipogelosomes分散体。对在分散过程结束时分离出来的样品进行研究显示，囊性结构的直径为120±30nm。阴性染色显微镜观察，冷断裂，冷转移以及原子作用力的显微镜检查具有磷脂双层特征性外观的囊泡或囊泡聚集；阴性染色使得我们有可能观察到外部胶凝剂的存在，根据所选择的制备和/或分离方法，其或较显著或较不显著。2)用0.9％的NaCl溶液将在外部胶凝介质中的LGS分散体稀释至1/10。然后在37℃下，经过300kDa或500kDa的滤器过滤(来自于PALFILTRON的“开放通道”切向过滤系统)。浓缩LGS后，得到一个分散体，它的干燥物质的含量为37-50％(m/v)。向其中加入相当于4-6％(m/m)的麦芽糖糊精。在麦芽糖糊精溶解并且混合物均匀后，进行雾化(例如使用NIRO指示雾化器)。由此生成了颗粒单位，其外部基质包含麦芽糖糊精，它的组分大致如下浓缩至44.6％干燥物质的LGS1500g麦芽糖糊精80g总LGS雾化理论值830g获得的量760g(产率84％)雾化过程在下列条件下进行空气内流温度180-200℃，空气外流温度80-90℃，压力为叶轮所能承受的最大压力大约为4bars将要进行雾化的溶液的出口温度20-45℃。实施例4在大鼠体内，于膳食后摄取实施例2中粉末组合物对于饮食中脂类在肠道吸收的影响本实验在具有正常脂血的大鼠身上并于其进食后进行。采用正常脂血的大鼠是为了在不受病原状态导致的代谢失调的任何影响下研究Lipogelosomes的真实效果。采取进食后是为了进行机制研究，提供Lipogelosomes在消化过程中某一给定时间下的作用“照片”。材料和方法动物和实验方案*动物尊重法国(No.87-848，1987年10月19日)和欧洲(No.86-609，1986年11月24日)官方有关保护和使用实验室动物的规定。所用的动物为雄性Wistar大鼠(Iffa-Credo，1’Arbresle，法国)，体重为300g。在为期10天的实验期间，将其置于有空调房间的笼子中(温度为21℃，湿度为50％)，并制造出12h-12h的光亮-黑暗周期；任意给予水和饲料。在实验开始前48小时，将这些大鼠置于固定的笼子中，并给予50g葡萄糖/l的饮食方案。在实验开始前24小时，任意向它们提供仅有水的饥饿饮食方案，以避免食粪现象出现。以这种方式，使得大鼠的胃在用插管法给予实验食物之前不含有任何食物。以随机的方式将动物分成6组两个对照组(C)，两个“Lipogelosomes”组(LGS)以及两个“成分”组(I)，它们或在消化后2小时或在消化后24小时被处死。由于实验的强制因素，大鼠的数量随实验组的变化而变化。*实验饮食每一种实验饮食由脂类乳剂组成，在使用时，向其中加入Lipogelosomes(LGS组)，Lipogelosomes成分(I组)或氯化钠(C组)。*脂类乳剂将含有三油酸甘油酯，胆甾醇和大豆卵磷脂(表I)的522.5mg的混合物加到氯化钠、蔗糖和白蛋白的水溶液中。通过磁力搅拌和超声使该制剂乳化。每周更新。每天用颗粒计(Capa700，Horiba，Kyoto，Japan)检查此乳剂中颗粒的直径。每天所观察到的结果之间没有差异，平均直径为2.97μm。在每餐食物中。C14-三油酸甘油酯和H3-胆甾醇的具体放射活性分别为68.45kBq/mmol以及4.27kBq/mmol。-Lipogelosomes将实施例2中的粉末组合物溶于水中，得到浓度为39.47mg/ml的磷脂；经颗粒计和电子显微镜检查的所得到的悬浮Lipogelosomes的直径是稳定的，大约为164.9nm(平均值)。-Lipogelosomes的成分采用如实施例2中所指定的构成Lipogelosomes的起始物质。分别制备磷脂和胶凝混合物。-给予实验食物在LGS组和I组中，使用时将2.2ml的Lipogelosomes制剂或其成分与1.5ml的脂类乳剂在注射器中进行混合。在C组中，则是将等量的氯化钠加到脂类乳剂中。在所有实验组中，总摄入饮食中的三甘油酯/磷脂的比例为40，该比例与在人类饮食中所观察到的比例一致。然而为了考虑这一点，结果降低了接受LGS或I治疗的动物其实验食物中脂类的贡献。使用胃探针，采用聚乙烯导管对大鼠进行插管。在导入乳剂之前，弃去等量的两份，以使能够准确定量大鼠摄入的放射标记物。表I实验食物组分*蒸馏水(mg)1500.00氯化钠(mg)13.50蔗糖(mg)800.00牛血清白蛋白200.00Lipogelosomes/成分中的卵磷脂87.50(+或-)(mg)脂类混合物522.50三油酸甘油酯(mg)500.00C14-三油酸甘油酯(kBq)37.00胆甾醇(mg)10.00H3-胆甾醇(kBq)111.00大豆卵磷脂(mg)12.50*牛血清白蛋白(缺乏脂肪酸)Calbiochem，SanDiego，CA.三油酸甘油酯(99％)Serva。Heidelberg，FRG。C14-三油酸甘油酯(纯度为98.3％)，4.1Gbq/mmolNEN研究产品，DupontdeNemours.Paris，France。胆甾醇(纯度为99％)，814Gbq/mmolNEN研究产品，DupontdeNemours.大豆卵磷脂(纯度为90％)Frangis，St-Maur，France.样品采集血消化2或24小时后，用氯胺酮/丙谷胺(60mg/kg/7.5mg/kg)的混合物使大鼠麻醉，然后通过放血将其处死。通过对腹主动脉进行穿刺取血，将大约10ml的血收集在含有EDTA的试管中，以防止它们凝固。下列表II中例举了一些条件，在这些条件下进行不同的采样。表II*TCL分离不同脂类的薄层层析**org有机的在2小时的消化情况下，直接放射活性的测量结果用除了胃幽门之外所发现的放射活性的百分比来表示，目的是为了降低胃排空的影响，因其在同一个组内亦可以有变化。对于24小时消化的处死的大鼠来说则不需要这样，因为对于所有的大鼠来说排空已达99.9％。结果用dpm来表示。结果1)Lipogelosomes对于胃中脂类脂解的影响正如先前在动物和人类身上所观察到的的，饮食中的脂类在大鼠胃中部分地发生水解。消化2小时后，尽管LGS组大鼠(胃容物)的量稍低，但C、I和LGS三个组的胃容物没有显著不同(表III)。这些结果与先前所观察到的大鼠消耗实验食物后的胃排空的水平一致(GallaherD.等人，Am.J.Physiol.，1985，249，184-191)。表III消化2小时后胃容物和胃排空情*结果用插管法得到的放射活性(dpm)的百分比来表示。第一行与14C-脂类有关，第二行与3H-胆甾醇有关。用Fisher实验检验，这些组的结果之间没有发现显著差异(p＜0.05)。经过2小时的消化后，三组大鼠胃中的14C-脂类和3H-胆甾醇的量没有差异。另一方面，在具有不同程度水解(随各组的情况变化)的组中，其14C-脂类的量有所不同。图1显示的是在经插管法给予含有甘油三酯的实验食物2小时后，胃容物中所发现的甘油三酯(TG)，甘油二酯(DG)，甘油单酯(MG)以及脂肪酸(FA)的百分比。当实验食物中存在成分(与C组相比为+21.6％)和Lipogelosomes(+31.3％)时，甘油三酯的比例明显较高，与之相反，甘油二酯和脂肪酸的比例则明显较低。甘油单酯的比例在三组之中没有显著差异；然而，LGS组大鼠胃容物中的该比例值却显著降低(与C组相比为-48.5％)。成分组大鼠胃容物中脂类的比例介于对照组和LGS组之间。胆固醇在胃中的浓度没有变化且没有任何转化。在图1中，每个直方图是各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.05)。*号表示用Scheffe检验计算后，与对照组相比较具有显著性差异(p＜0.05)。2)Lipogelosomes在肠腔中的影响正如在胃容物中的情况一样，在消化2小时后被处死的大鼠肠容物中14C-脂类的量在对照、成分和LGS组中没有显著不同。图2显示在对照组和LGS组中，三个肠道部分中的14C-脂类是相似的，从肠道的上部到下部，C14-脂类的量程下降趋势。在成分组的肠道上部和整个肠道的内容物中，14C-脂类的量明显降低(但不具显著性)。在图2中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.05)。*号表示用Scheffe检验计算后，与对照组相比较具有显著性差异(p＜0.05)。在肠道部分内容物中发现的不同类型脂类的比例可以根据经插管法给予的测试食物而变化(图3)。在属于成分组和Lipogelosomes组的大鼠的肠道的下部的甘油二酯显著较高。在同一部位，成分组和Lipogelosomes组的脂肪酸显著降低。由于在同一组内出现了相对高程度的可变性，成分组和Lipogelosomes组在肠道的上部和中部的内容物中没有出现任何显著性差异。在图3中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.05)。*号表示用Scheffe检验计算后，与对照组相比较具有显著性差异(p＜0.05)。如图2所示，在成分组和Lipogelosomes组中，胆甾醇的分布沿肠道变化。成分组中肠道上部内容物中的胆甾醇显著降低(与C组比较为-57.3％)；Lipogelosomes组中肠道下部以及整个肠道内容物中的胆甾醇显著增高(与C组比较相应地为+104.5％和+34.4％)。消化24小时后处死的大鼠的结果在三个组之间没有显著性的差异。所测得的放射活性极低，因为这时胃实际上已经基本排空。3)Lipogelosomes对于饮食甘油三酯和胆甾醇吸收的作用仅在消化2小时后，采集肠道粘膜内容物样品，并进行分析；由于脂类在肠细胞中的转运时间很短，故在24小时时进行的分析没有任何关系。在C、I和LGS组之间，肠道粘膜细胞中甘油三酯的含量没有显著性的差异(图4)。饮食胆甾醇的吸收由于测试食物中Lipogelosomes的存在，甚至在其成分较低程度的存在下而得到很大程度的改善。由于肠道粘膜的上部成分的存在，胆甾醇的吸收被显著降低。Lipogelosomes使得肠道粘膜的上部和下部以及整个肠道粘膜中的胆甾醇的吸收出现了明显的降低(与C组比较，相应地为-32.9％，-47％和-16.8％)。在图4中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.05)。*号表示用Seheffe检验计算后，与对照组相比较具有显著性差异(p＜0.05)。4)Lipogelosomes对于脂类血浆水平的影响图5给出了消化2小时后被处死的大鼠血浆中14C-甘油三酯和3H-胆甾醇的量。当成份和lipogelosomes倾向于降低血浆甘油三脂时，所观察的差异不明显。Lipogelosomes明显的降低了血浆胆甾醇的量(与C组比较，为-42.6％)。与对照组大鼠的血浆胆甾醇量相比较，成分所产生的作用类似，但不具显著性。在图5中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.05)。*号表示用Scheffe检验计算后，与对照组相比较具有显著性差异(p＜0.05)。在24小时的情况下，三组之间没有观察到有显著性差异。5)Lipogelosomes对于肝中脂代谢的影响在消化2小时后(图6)，成分和Lipogelosomes对肝脏14C-脂类的存储不产生任何显著的影响。另一方面，它们导致了肝脏内储存的胆甾醇含量的降低，由于较高程度的组内可变性，故上述降低不具显著性，与C组相比，前者的降低为35％，后者为33％(C组)。在图6中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。采用Fisher检验，没有观察到存在显著性差异(p＜0.05)。24小时消化后，肝脏中存在的放射标记的脂类的含量在三个组之间没有显著性差异。6)盲肠和粪便中的饮食脂类和胆甾醇消化2小时后被处死的动物的盲肠中或不含任何14C或3H放射标记，或仅含有小剂量的放射活性。进一步地，它们没有粪便。24小时消化后(图7)，给予含有Lipogelosomes测试食物的大鼠盲肠和粪便中的14C-脂类的量明显增高(与C组相比为+229.5％)。对于饮食胆甾醇含量来说，该效果更加明显，在成分组和LGS组的情况下，其含量显著性地增加(与C组相比分别为+133.3％和+229.4％)。未被肠道粘膜吸收的饮食胆甾醇量的增加在I组中显著低于LGS组。在图7中，每个直方图表示各组得到的数值的平均值±SEM(C对照；I成分；LLipogelosomes)。不同的字母表示经Fisher检验和Scheffe检验计算后，组与组之间的显著性差异(p＜0.01)。这一研究证明，与饮食定量剂量一起摄入Lipogelosomes的确可以导致饮食脂类(甘油三酯和胆甾醇)吸收的降低。基于这些结果，有关Lipogelosomes作用方式最可能的假设是它们使得肠腔中甘油三酯脂解程度有所降低，并导致甘油单酯和游离脂肪酸产量降低。这一脂解的降低将带来两个结果甘油单酯和游离脂肪酸吸收降低；降低了胶束相中胆甾醇的增溶作用，因此带来了胆甾醇吸收的降低。Lipogelosomes通过肠道粘膜降低胆甾醇吸收的作用要比其降低甘油单酯和游离脂肪酸吸收的作用大。这可以归因于这样一个事实胆甾醇的吸收水平要比甘油三酯的吸收水平低得多(相应地为80-100％及40-60％)。于是，胆甾醇的吸收甚至被限制在“正常”的消化条件之下。一个参数的改变(甘油单酯和游离脂肪酸浓度的下降)可以导致胆甾醇吸收实质性的破坏。进一步地，Lipogelosomes可以捕获一部分胆汁盐。这一作用的结果使得胶束相中胆甾醇增溶作用降低，并导致其吸收的下降。上述这些结果被有关慢性摄入Lipogelosomes对于脂类代谢影响的研究过程中得到的一些结果所印证(下面实施例5)。实施例5不同量LGS的慢性摄入对脂类代谢的影响动物和饮食方案将8组(每组10只)14周龄的Wistar大鼠(IFFACREDO，L’Arbresle，France)随机进行组合。将动物关在空调房间的笼子中(温度为21℃，湿度为50％)，并制造出12h-12h的光亮-黑暗周期；任意给予水和饲料。人工提供了8种饮食方案。Lipogelosomes(LGS)和组成LGSs(I＝成分)的起始物质与实施例2中的那些物质相同。表IV中给出每种饮食方案的详细组分。在考虑由Lipogelosomes和成分产生的脂分布的情况下，计算饮食方案中各种营养成分的比例。8种测试的饮食方案PL-缺脂饮食方案(4％甘油三酯)RL-富脂饮食方案(25％甘油三酯+1.2％胆甾醇)LGS1-富脂饮食方案，其中包括1.25％PL(LGS)LGS2-富脂饮食方案，其中包括2.5％PL(LGS)LGS3-富脂饮食方案，其中包括3.75％PL(LGS)I1-富脂饮食方案，其中包括1.25％PL(LGS成分)I2-富脂饮食方案，其中包括2.5％PL(LGS成分)I3-富脂饮食方案，其中包括3.75％PL(LGS成分)为了不使LGS降解，LGS1，2和3饮食方案是在使用时现进行制备，其它方案的制剂在-20℃下冷冻。表IV饮食方案的组成(g/100)。PL＝缺脂饮食方案(3％)；RL＝富脂饮食方案(25％)；LGS1＝含有25％脂类，其中包括1.25％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS2＝含有25％脂类，其中包括2.5％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS3＝含有25％脂类，其中包括3.75％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；I1＝含有25％脂类，其中包括1.25％的磷脂的饮食方案；I2＝含有25％脂类，其中包括2.5％的磷脂的饮食方案；I3＝含有25％脂类，其中包括3.75％的磷脂的饮食方案。研究的过程在研究开始和结束时测定大鼠的体重。在研究开始后2周和结束时测定消化量(持续时间为3天)。在研究开始时和实施饮食方案3周后从RL组和LGS3组采集血样。在倒数第二周时收集粪便样品(持续时间为4天)，对它们进行称重并在-20℃下冷冻。用粪便测定胆甾醇的吸收因子，上述粪便样品是在最后一周开始时采集的。实施饮食方案6周后，经一天禁食后，在麻醉下，将动物处死移出肝(称重并在-20℃下冷冻)并取出大约10ml血(腹部主动脉穿刺)。对全血离心得到血清。所有血清的分析均用新鲜的血清进行。分析-在研究开始时及实施饮食方案3周后，采用酶比色方法，用20只大鼠(RL和LGS3组)对甘油三酯(G.BUCCOLO等人，Clin.Chem.，1973，19，476-482)，磷脂(M.TAKAYAMA等人，Clin.Chem.Acta..，1977，79，93-98)，总胆甾醇(J.SIEDEL等人，Clin.Chem.，1983，29，1075-1080)以及游离胆甾醇(F.STAHLER等人Med.Lag.，1973，30，29-37)等物质进行分析。-在实施饮食方案6周后，采用同样的方法，对每只大鼠血清中的甘油三酯，磷脂，总胆甾醇和游离胆甾醇进行分析。-在研究结束时，借助于连续超离心方法，可将每只大鼠血清中的VLDL(极低密度脂蛋白)，LDL(低密度脂蛋白)，以及HDL(高密度脂蛋白)进行分离(T.BROUSSEAU等人，Clin.Chem.，1993，39，960-964)(VLDL436,000g，10℃下2.5h；LDL436,000g，10℃下2.5h；HDL436,000g，10℃下5h)，离心所用的仪器为BecmanOptimaTLX超离心机以及TL-100.2转子。采用上述的酶比色方法，可就脂蛋白的不同类型，对甘油三酯，磷脂，总胆甾醇和游离胆甾醇进行分析。-在研究开始时及实施饮食方案3周后，对RL组和LGS3组血清中的g-GT(JP.PRESIJN等人，J.Clin.Chem.Biochem.，1976，14，421-427)，GOT(G.KESSLER等人，9thInt.Congr.Clin.Chem.，Toronto，1975)，GPT(G.KESSLER等人，9thInt.Congr.Clin.Chem.，Toronto，1975)以及碱性磷脂酶(S.MORGENSTERN等人，Clin.Chem.，1965，11，876-881)毒理学酶活性进行了测定，并在实施饮食方案6周结束时对每只大鼠血清的上述指标进行了测定。-将得自每只大鼠的大约1g肝脏组织在乙醇中进行研磨，提取后，用Folch方法(J.FOLCH等人，J.Biol.Chem.，1957，226，498-509)对其中的甘油三酯(G.BUCCOLO等人，Clin.Chem.，1973，19，476-482)和磷脂(J.AMIC等人，Clin.Chem.Acta..，1972，40，107-114)进行分析。皂化用石油醚提取，乙醇/水洗涤，蒸发并将其溶于异丙醇中后对其中的总胆甾醇(J.SIEDEL等人，Clin.Chem.，1983，29，1075-1080)进行分析(L.CARA等人，Nutr.Res.，1991，11，907-916)。-在-80℃下通过冷冻方法，制备每只大鼠肝脏的等分试样(具体的制剂)以便保存起来用于日后的分析(HMGCoA红，ACAT，7a水解酶)。结果体重以及摄入量的变化在本实验开始时，每组大鼠的体重平均值没有显著性差异(从325±2g到330±2g)。实施饮食制度6周后，I1(419±7g)和I3(414±9g)组大鼠的体重明显的低于LGS3组大鼠的体重(444±7g)。相反，LGS组和I组与对照RL饮食方案组(425±8g)的体重没有出现显著性的差异。就体重的增加而言，得到了同样的显著性差异(RL95±9g，LGS3116±9g，I192±7g，I389±9g)。2周和5周后，PL组(相应地为41.2±1.5g和38.9±0.9g)摄入的量要明显地高于其它组(从25.3±1.0g和31.7±1.0g)的摄入量。由于PL饮食方案每克食物中含有的卡路里较低，因此这一组中的大鼠摄入的食物量有所增加。摄入的LGS(以粉末形式存在)的量如下LGS10.51g/d；LGS21.04g/d；LGS31.67g/d，其与下列磷脂的量一致LGS10.28g/d；LGS2O.57g/d；LGS30.92g/d。血清脂类参数的变化表V显示了实施饮食方案6周后大鼠血清参数值。表V<p>续表V</tables>表中数值代表10只大鼠所得值的平均值±SEM。对于给定的参数，不同的字母表示显著性差异。对于给定的参数，有两条结果的值表示该分析在两个不同的实验室进行。PL＝缺脂饮食方案(3％)；RL＝富脂饮食方案(25％)；LGS1＝含有25％脂类，其中包括1.25％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS2＝含有25％脂类，其中包括2.5％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS3＝含有25％脂类，其中包括3.75％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；I1＝含有25％脂类，其中包括1.25％的磷脂的饮食方案；I2＝含有25％脂类，其中包括2.5％的磷脂的饮食方案；I3＝含有25％脂类，其中包括3.75％的磷脂的饮食方案。与缺脂饮食方案相比，富脂饮食方案导致了大鼠血清中甘油三酯的明显降低(表V)。尽管其它研究也发现了这一结果(JL.VIGNE等人.，Br.J.Nutr.，1987，58，404-413；FCHANUSSOT等人.，Ann.Nutr.Metab.，1988，32，271-281；G.NALBONE等人，J.Nutr.，1988，118，809-817；G.NALBONE等人.，Lipids.，1989，24，179-186)，但根据饮食方案的组成，大鼠的种属以及实施饮食方案的时间长短等因素，结果可以有很大的变化。与RL，LGS1，I1和I3组比较，I2组饮食方案导致了血清甘油三酯的明显升高。不同脂蛋白中脂类的分析结果显示(表VI)PL饮食方案所获得的甘油三酯血症的增加首先是由于VLDL中甘油三酯的明显升高，其次是由于LDL和HDL中甘油三酯的明显升高。I2饮食方案组所获得的增加则主要是由于VLDL中甘油三酯的升高。当与RL饮食方案进行比较时，LGS3饮食方案导致了LDL中甘油三酯的明显升高；LGS2，I2和I3饮食方案则带来了HDL中甘油三酯的明显升高。增加LGS或I的摄入量仅能引起脂蛋白中不同类型甘油三酯的很小变化因此在采用这一参数的情况下，不出现剂量作用。表VI实施饮食方案6周后脂蛋白中的脂类组成续表VI<p>表VI说明表中数值代表10只大鼠所得值的平均值±SEM(斜体)。在每一栏中，不同的字母(用上标形式书写的)表示显著性差异。VLDL＝极低密度脂蛋白；LDL＝低密度脂蛋白；HDL＝高密度脂蛋白；PL＝缺乏脂类的饮食方案(3％)；RL＝富含脂类的饮食方案(25％)；LGS1＝含有25％脂类，其中包括1.25％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS2＝含有25％脂类，其中包括2.5％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS3＝含有25％脂类，其中包括3.75％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；I1＝含有25％脂类，其中包括1.25％的磷脂的饮食方案；I2＝含有25％脂类，其中包括2.5％的磷脂的饮食方案；I3＝含有25％脂类，其中包括3.75％的磷脂的饮食方案。就血清中的磷脂而言(表V)，与富脂饮食方案相比，缺脂饮食方案也导致了这一参数的显著升高。与富脂饮食方案相比，仅I2饮食方案带来了血清磷脂的升高。在将不同类型的脂蛋白分离后(表VI)，在PL组中可以观察到，本质上磷脂的升高是由于HDL磷脂的定量升高引起的。由于这脂类蛋白含有较多的磷脂，在这种水平下发现升高是很自然的。当考虑由于LGS和I引起的效果时，与RL组相比，可以观察到LGS1，LGS2，I2和I3饮食方案可以带来的显著的升高。与PL饮食方案相比，RL饮食方案使血清中的总胆甾醇稍有升高(表V)。与RL饮食方案相比，可以观察到LGS3引起血清中的总胆甾醇的显著降低(-22.3％)。I3方案所得到的降低较小(-10.9％)。表VI显示，LGS3饮食方案获得的显著降低的降低主要是由于存在VLDL中总胆甾醇的显著降低，次要的是由于LDL中总胆甾醇降低的趋势引起的。与RL饮食方案相比，在按照LGS3方案摄入饮食后，VLDL+LDL中的总胆甾醇降低了36.4％。相反，在按照上述方案摄入饮食后，HDL中的总胆甾醇没有变化。在动物体内所观察到的饮食磷脂的效果也取决于所应用的方法。如果将LGS3和I3饮食方案的效果进行比较，很重要的是注意到LGS3饮食方案引起了胆甾醇血降低两倍。另一方面，LGS对于胆甾醇血的这些效果是所摄入剂量的函数。增加摄入的饮食磷脂的量不引起血清中游离胆甾醇的显著变化(除了采用LGS3饮食方案)(表V)。与RL饮食方案相比，仅LGS3饮食方案使血清中游离胆甾醇有显著的降低(39％)。相反，所获得的脂蛋白中不同类型的脂类结果(VI)显示，游离胆甾醇的分布按摄入的饮食方案而有所不同。与RL饮食方案相比，采用LGS3饮食方案后血清中游离胆甾醇的降低是由于VLDL和LDL中游离胆甾醇的显著降低。还应该提到的是，与RL饮食方案相比，I3饮食方案引起了HDL中游离胆甾醇的显著升高。与RL饮食方案相比，采用LGS3饮食方案后，可以观察到血清中酯化胆甾醇显著下降了20％(表V)。对于LGS2，I2和I3饮食方案而言，它们具有引起这一参数降低的倾向，但这种降低是不显著的。在采用LGS3饮食方案的情况下，与RL饮食方案相比，这一降低是由于VLDL中酯化胆甾醇的显著降低以及这一参数在LDL和HDL这种浓度下降的趋势(表VI)。仍然与RL饮食方案相比，当采用含有LGS或I的饮食方案时，我们没有观察到LDL和HDL中酯化胆甾醇有任何显著的变化。表V(续)给出了采用饮食方案6周后，所获得的大鼠血清中的毒理学参数。与RL饮食方案相比，在饮食方案中加入脂类，不引起碱性磷酸酯酶的任何增加。另一方面，与RL，LGS1和I2饮食方案相比，I1方案则可引起这一参数的显著降低。与PL饮食方案相比，RL饮食方案显著地使GOT的活性升高。与PL饮食方案相比，其它饮食方案不显著改变此转氨酶的活性。另一方面，与RL饮食方案相比，采用LGS3饮食方案可以引起实质性的显著降低(47％)。采用I3饮食方案也可以获得显著降低(30％)。与PL饮食方案相比，RL饮食方案使得GPT的活性升高。与PL和RL饮食方案相比，含有LGS或I的饮食方案并不显著改变此转氨酶的活性。在这种情况下，在按照LGS3和I3方案摄入饮食后，也获得了最低的值。关于g-GT的活性，如果这个值太低的话，分析方法的敏感度不足以测量此酶的活性。无论采用何种饮食方案，均无法检测到此酶的活性。毒理学分析结果显示，在这些剂量下摄入LGS在大鼠体内不引起毒性。LGS甚至显示出具有肝保护作用。肝中脂类参数的变化在饮食方案中加入脂类可以引起肝重量的显著增高，而LGS量的升高则有降低肝重量的趋势。当成分的量(组I)升高时，这种变化是显著的。有必要再提的是在组I中大鼠的重量是较低的。因此在这些组中肝重量较低是正常的。表VII实施饮食方案6周后大鼠的肝重量和脂类的含量表中数值代表10只大鼠所得值的平均值±SEM。对于给定的参数，不同的字母表示显著性差异。PL＝缺脂饮食方案(3％)；RL＝富脂饮食方案(25％)；LGS1＝含有25％脂类，其中包括1.25％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS2＝含有25％脂类，其中包括2.5％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；LGS3＝含有25％脂类，其中包括3.75％以Lipogelosomes形式存在的磷脂的饮食方案；I1＝含有25％脂类，其中包括1.25％的磷脂的饮食方案；I2＝含有25％脂类，其中包括2.5％的磷脂的饮食方案；I3＝含有25％脂类，其中包括3.75％的磷脂的饮食方案。关于肝中的总胆甾醇，在饮食方案中加入脂类导致了肝中总胆甾醇的浓度(mg/g)和总量(mg/肝)的显著升高(表VII)。与RL饮食方案相比，当采用LGS3饮食方案和三个I饮食方案时，总胆甾醇的浓度显著升高。另一方面，当采用I3饮食方案时，肝中胆甾醇的总量不再有显著差异，而与RL饮食方案比较时，其它组的显著性差异没有改变。增加饮食中脂类的含量可以使得肝中总甘油三酯的浓度和总量(mg/肝)的显著升高(表VII)。与RL饮食方案相比，加入LGS3或I可以使肝中甘油三酯的浓度(mg/g肝)显著升高。另一方面，假定各组之间肝重量不同，在I1和I3组中，我们没有观察到肝中甘油三酯的量(mg/肝)有任何显著性差异。不同量的LGS或I对于肝中脂类参数的影响与摄入的量不呈相关关系。在这个实验中，LGS的摄入不引起肝重量的任何显著变化。然而，所得到的结果证明Lipogelosomes作用与由成分产生的作用不同。结论本实验证明了以下几个重要的结果-所采用的LGS的量(在饮食方案中为1.25-3.75％)无毒。-当在饮食方案中采用3.75％以LGS形式存在的磷脂时(饮食甘油三酯与磷脂的比例为TG/PL＝5.7)，可以从大鼠体内获得代谢效果。2.5％的剂量下所产生的效果不显著(TG/PL＝9)。假设大鼠具有很好的调节脂代谢的功能，那么当采用2.5％的剂量时，很可能在人体上可以观察到效果。如果我们认为人每天大约摄入100g甘油三酯的话，他需要摄入大约11g以LGS形式存在的磷脂，才有希望观察到效果(如果LGS含有55％的磷脂，LGS的摄入量为20g)。-在血浆胆甾醇水平下，可以观察LGS的主要效果且是摄入剂量的函数(总胆甾醇相关因子R＝0.91；游离胆甾醇R＝0.98；酯化胆甾醇R＝0.88)。此结果的降低主要与VLDL以及LDL有关。由LGS导致的对脂类代谢的一些效果可与由消胆胺所导致的效果进行比较。下列表VIII显示了LGS对胆汁盐和甾醇所起的作用。表VIII>*10只大鼠所得值的平均值±SEM，a、b和c显著不同，从前向后相应地为p＜0.05，p＜0.008，p＜0.001。总体来说，本实验的结果证明LGS令人吃惊地显示出下列性质-对脂代谢的作用在对照饮食方案(RL)和最高的LGS剂量(LGS3)之间，总胆甾醇降低(表V)。更准确地说，LGS3带来了总血浆胆甾醇22％的显著降低以及酯化的胆甾醇20％的显著降低。这些降低与剂量有依赖关系。进一步地，LGS3带来了总血浆胆甾醇中VDL44％的降低以及总胆甾醇中LDL36％的降低。LGS导致了脂蛋白中不同类型脂类的优选分布(表VI)。-无毒性和低毒性作用当采用LGS3时，与对照(RL)相比，GOT(续表V)降低，GPT有降低的趋势。-经过口服途径的有效剂量饮食方案中含有2.5-3.75％磷脂。-初级胆汁酸/次级胆汁酸的比例以及初级中性甾醇/次级中性甾醇的比例降低(表VIII)；这些结果表明了LGS存在下肠道细菌的数量和/或质量的变化。-当采用LGS3时，可以观察到中性甾醇在粪便中的排泄量增加了+36％，而粪便中胆汁酸的量下降了-17％。实施例6得自本发明实施例2步骤1中的Lipogelosomes分散体的水溶液与由得自本发明实施例2步骤2中的粉末组合物重组生成的水溶液的定性和定量比较表IXLGS分散体重组溶液差异干燥物质的[PL]0.359±0.0200.341±0.017-5.0％(NS)单位为g/g[干燥物质的胶凝剂]0.344±0.0280.315±0.014-8.4％(NS)单位为g/g[胶凝剂]/[PL]1.041.08+3.8％(NS)脂类外形变化无无-Φ单位为nm多分散性(％)183±3180±27-1.6％(NS)显微外观40.9±2.241.7±2.1+2.0％(NS)球状囊泡收缩的囊泡是[PL]＝磷脂的浓度(Biomerieuxenzymekit)；[胶凝剂]＝总胶凝剂的浓度(Lowry比色方法)；脂类外形变化根据PL的HPLC结果；Φ数目和多分散性根据SCP颗粒计；电子显微镜外观照片观察(阴性染色后电子显微镜下观察)；(NS)＝没有显著性差异。因此根据以上所述的证据，本发明无论从何种意义上来说也不应限于已经详细描述的它的实施例和应用方式；相反它应该包含专业人员能够设想出来的、并且不背离本
发明内容和范围的所有实施例的变形。权利要求1.用于口服给药的粉状组合物，其特征为-其基本由单薄片脂质体组成，该脂质体包含外部脂相，其由4类脂肪(磷脂)，不包括3类物质(胆甾醇，非离子化的长链脂肪酸)和5类物质(胆汁盐和梭链孢酸)组成，以及水性内核，其形成了温度可逆的水性凝胶，并发散到达外部的脂相，水性内核必须由至少两种不同的非可聚合胶凝剂G1和G2组成的混合物M组成，上述凝胶-溶液相的转换点高于或等于37℃，其中G1为胶凝剂，选自明胶和角叉菜胶，并且G2为性质与为G1选择的角叉菜胶不同的)角叉菜胶和纤维素，上述脂质体的直径在20nm至1mm之间，优选的是50nm至500nm；且-其以颗粒单位形式存在，颗粒单位的平均直径在10mm至1000mm之间，其由一或多个所述的脂质体、糊精或它们的混合物组成，脂质体被选自脱水的温度可逆水性凝胶的基质所包围，上述的水性凝胶与所述的内核中的水性凝胶是一致的，平均来说，每克粉末中含有1016至1018个脂质体，2.权利要求1中的粉状组合物，其特征为所述的脂质体的内部水性核额外地包含至少一种配糖特性稳定剂和/或一种用于调节介质渗透性的试剂和/或至少一种表面活性剂。3.权利要求1或2中的粉状组合物，其特征为其包含25-75％(m/m)的4类脂肪，5-45％(m/m)胶凝剂，0-70％(m/m)配糖特性稳定剂，0-15％(m/m)用于调节介质渗透性的试剂，0-20％(m/m)的表面活性剂以及0-15％(m/m)的糊精。4.权利要求1-3任意一项中所述的粉状组合物，其特征为其包含70-95％胶凝剂G1和5-30％胶凝剂G2。5.权利要求1-4任意一项中所述的粉状组合物，其特征为配糖特性稳定剂为蔗糖，海藻糖或任何其它保护剂。6.权利要求1-5任意一项中所述的粉状组合物，其特征在于构成所述的脂质体外部脂相的脂肪类物质优选含有20-25％磷脂酰胆碱，10-18％磷脂酰乙醇胺以及9-15％磷脂酰肌醇。7.权利要求1-5任意一项中所述的粉状组合物，其特征在于构成所述的脂质体外部脂相包含纯化的磷脂，或其本身或为它们的混合物，优选地与权利要求6中定义的比例相同。8.制备权利要求1-7任意一项中所述的粉状组合物的方法，在该组合物中，颗粒单位的外部基质包含脱水温度可逆水性胶状成分，其包括下列步骤(1)通过以下步骤，在水相中制备具有胶凝内核的脂质体分散体，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶液相的转换温度下，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，可以制备得到至少一种合适的胶凝剂，特别地，可以得到胶凝剂G1和G2的混合物M，(b)混合物在慢慢搅拌下，于5小时内，优选的是在真空条件下，将脂类混入(a)中得到的溶液，其形成乳剂，且(c)优选的是在真空条件下迅速地搅拌(b)中得到的乳剂，从而得到具有以水相形式存在(其中含有所述的胶凝剂)的胶凝内核的脂质体分散体，并且(2)使得到的分散体进行适合的直接干燥，得到粉末状的产品。9.权利要求8中所述的方法，其特征在于步骤(2)中的干燥是在通过雾化作用、凝聚作用、薄膜或颗粒化作用来进行的。10.制备权利要求1-7任意一项中所述的粉状组合物的方法，在该组合物中，颗粒单位的外部基质包含脱水温度可逆的水性胶状成分和/或糊精，其包括下列步骤(1)通过以下步骤，在水相中制备具有胶凝内核的脂质体分散体，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶液相的转换温度下，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，可以制备得到至少一种合适的胶凝剂，特别地，可以得到胶凝剂G1和G2的混合物M，(b)混合物在慢慢搅拌下，于5小时内，优选的是在真空条件下，将脂类混入(a)中得到的溶液，其形成乳剂，且(c)优选的是在真空条件下迅速地搅拌(b)中得到的乳剂，从而得到所述的具有以水相形式存在(其中含有所述的胶凝剂)的胶凝内核的脂质体分散体，(2)至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相，其中分散有所述的脂质体，(3)加入至少一种合适的糊精，并且(4)使(3)中得到的产品进行雾化，得到粉末状的产品。11.权利要求10中所述的方法，其特征是至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相的步骤(2)是通过稀释和/或过滤作用来进行。12.权利要求8-11中所述的方法，其特征是步骤(a)中的水溶液包含有用于调节介质渗透性的试剂(例如0.9％NaCl)和/或配糖特性稳定剂。13.权利要求8-12中所述的方法，其特征是步骤(b)优选的是在小于200s-1的切变速率下进行的。14.适合调节胆甾醇血和甘油三酯血的营养补充剂，其包含权利要求1-7任意一项中所述的粉状组合物，该组合物可与或不与合适的赋形剂相配伍。15.口服给药的药物组合物，其含有权利要求1-7任意一项中所述的粉状组合物以及至少一种合适的载体。16.权利要求1-7任意一项中所述的组合物用于制备药物的用途，该药物欲进行口服给药，用来治疗高胆甾醇血和/或高甘油三酯血。17.权利要求1-7任意一项中所述的组合物用于制备治疗用辅助剂的用途，其应用使转氨酶或其它毒性制造源有所增加的一或多种活性成分。18.权利要求14中所述的营养补充或权利要求15中所述的药物组合物，其特征是它们既可以固体(胶囊、片剂或需要溶于水中的粉末)形式存在，也可以通过重组将权利要求1-7任意一项中所述的组合物溶于水溶液中后，以液体形式存在。19.具有溶于水相中胶凝内核的脂质体分散体，其含有权利要求1中所定义的胶凝剂的混合物，该分散体中所述的脂质体显示出下列形态学·具有直径为20nm至1mm的囊性结构，优选是为70-200nm，并且·具有10-55％，优选的是30-50％胶凝内相的脂质体的多分散性。全文摘要本发明涉及稳定的单薄片脂质体粉状组合物,其包含至少一个外部的脂相和一个内部的水性极性核,后者在常温下可以胶凝,本发明还涉及制备它们的方法以及它们作为营养添加剂和口服给药的药物组合物(具有抗脂血作用)的应用。所述的药物组合物必须由单薄片脂质体组成,该脂质体包含一个由4类脂肪(磷脂)组成的外部脂相以及一个水性的内核,该水性内核必须由至少两种不同的非可聚合胶凝剂(G1和G2)的混合物M组成,其凝胶－溶液相的转换点不低于37℃,其中G1为胶凝剂。选自明胶和角叉菜胶,且G2为角叉菜胶(其性质与为G1选择的角叉菜胶不同)和纤维素。上述脂质体的直径在20nm至1mm之间,优选的是50nm至500nm,并且,其以颗粒单位形式存在,颗粒单位的平均直径在10mm至1000mm之间,其由一或多个所述的脂质体、糊精或它们的混合物组成,脂质体被选自无水的温度可逆的水性凝胶所包围,上述的水性凝胶与所述的内核中的水性凝胶是一致的,平均来说,每克粉末中含有10文档编号A61K31/685GK1264296SQ9880728公开日2000年8月23日申请日期1998年6月11日优先权日1997年6月11日发明者J－P·纱利斯申请人:利波格尔公司