增模板，在DNA taq酶的作用下进行PCR扩 增，PCR扩增的上游引物序列为5'-AATGAATTCATGGACCCCAACTGCTCCT-3'（SEQIDN0 :3)， 下游引物序列为 5'-AATCTCGAGGGCGCAGCAGCTGCACTT-3'（SEQ ID N0:4)。PCR 扩增程序为： 总量为20ul的反应体系于94°C预变性5min后，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s， 共进行35个循环，最后72 °C延伸5min ;扩增产物序列如SEQ ID NO :2所示。
[0044] 将扩增后的产物经EcoR I酶和Xho I酶酶切后，T4DNA连接酶连接到pET32a 载体的相应酶切位点，获得原核表达克隆。测序检测正确的重组载体经42°C热激转化至 BL21(DE3)感受态细胞。在37°C利用ImM IPTG (终浓度）诱导表达获得带Trx标签的MT-2 重组蛋白。利用AKTA层析系统，采用NI-NTA亲和层析纯化后，加入重组肠激酶切除Trx标 签，进一步采用S-TAG亲和层析纯化分离，最后采用阴离子交换树脂精纯共获得10. 8mg大 鼠 MT-2纯蛋白。纯化后的MT-2蛋白SDS-PAGE电泳图见图1。利用Western blot结果证实 纯化蛋白为MT-2。（一抗为抗His-probe抗体，购自美国Santa cruz公司，货号sc-53073， 二抗为抗 Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody，购自美国 cell signaling technology 公司）。利用ABTS化学法检测MT-2纯蛋白总抗氧化能力为2. 20mM/g，该结果说明本发明制 备的纯化MT-2蛋白具有较强生物学活性。
[0045] 将纯化的MT-2重组蛋白利用SDS-PAGE电泳分离，利用考马斯亮蓝R250进行染 色（染色液：去离子水500ml，乙醇400ml，醋酸100ml，Ig考马斯亮蓝R250,搅拌均匀后 用滤纸过滤；脱色液：去离子水500ml，乙醇400ml，醋酸100ml)，脱色后割取MT-2蛋白 条带进行质谱鉴定，检测仪器型号：LTQ VEL0S，进样方式：Microspray,仪器公司：Thermo Finnigan, San Jose, CA,检测方式：正离子，Trap 柱：Zorbax300SB_C18peptide traps (Agilent Technologies, Wilmington, DE), Column ：0. 15MM*150MM(RP-C18) (Column Technology Inc.)，质谱结果如图2所示，提示所获得的蛋白为MT-2蛋白。
[0046] 实施例2MT-2蛋白对大鼠哮喘模型气道阻力、肺顺应性影响
[0047] L实验材料
[0048] I. 1实验对象
[0049] SD大鼠，雄性，4周龄，体重100?120g。
[0050] 1. 2实验试剂
[0051] 1)腹腔注射致敏液，为含有Img OVA和IOmgAl (OH) 3的生理盐水，每只大鼠腹腔注 射 lml。
[0052] 2)激发液为含有0. 5%0VA的生理盐水溶液，按5mg/kg剂量颈外静脉注射激发。
[0053] 3)其他试剂均采用分析纯的药物用生理盐水配置获得。
[0054] 4) MT-2蛋白，实施例1制备。
[0055] 5) Trx蛋白，作为蛋白阴性对照，该蛋白的制备方法为：将pET32a质粒转化至 BL21 (DE3)感受态细胞，37°C，250rpm，振荡培养至OD6tltl约0· 6后，每瓶加入IPTG至终浓度 为ImM，在25°C和37°C下进行诱导表达4h。IOOOOrpm离心30min收获细菌存于。利用AKTA 层析系统，采用NI-NTA亲和层析进行提纯，Trx蛋白位于19KD条带处（图3)。
[0056] 2.实验方法
[0057] 2. 1哮喘模型的制备
[0058] 卵白蛋白（OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后对SD大鼠进行OVA颈外静脉激发。
[0059] 2. 2实验组的制备
[0060] 卵白蛋白（OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后对SD大鼠进行OVA颈外静脉激发； 激发前10分钟，将阴性对照试剂(生理盐水)、阳性对照药物(特布他林、氢化可的松)、不同 剂量（lng/kg，10ng/kg，100ng/kg，1000ng/kg) MT-2 蛋白，或不同剂量（lng/kg，10ng/kg， 100ng/kg，1000ng/kg) Trx蛋白，颈外静脉注射入大鼠体内。OVA激发后，检测大鼠呼吸功 能。
[0061] 实验组具体分为以下13组，每组8个平行。
[0062] (1)空白对照组（Blank):首次不做特殊处理，2周后颈外静脉注射OVA激发。
[0063] (2)哮喘模型对照组（AS):首次用含有ImgOVA和IOmg氢氧化铝的生理盐水Iml 腹腔注射致敏，2周后颈外静脉注射0. 5%0VA激发（5mg/kg)。
[0064] (3)哮喘模型生理盐水组（NS):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈外静脉注射NS, 剂量为lml/Kg，IOmin后OVA激发。
[0065] (4)哮喘模型特布他林组（TB):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈外静脉注射TB， 剂量为55 μ g/kg，IOmin后OVA激发。
[0066] (5)哮喘模型氢化可的松组（HC):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈外静脉注射 HC，剂量为 15mg/Kg，IOmin 后 OVA 激发。
[0067] (6)哮喘模型MT-2_lng/kg蛋白组（MT-2_1):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈 外静脉注射MT-2蛋白，剂量为lng/kg，IOmin后OVA激发。
[0068] (7)哮喘模型MT-2_10ng/kg蛋白组（MT-2_10):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后 颈外静脉注射MT-2蛋白，剂量为10ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0069] (8)哮喘模型MT-2_100ng/kg蛋白组（MT-2_100):首次用OVA腹腔注射致敏，2周 后颈外静脉注射MT-2蛋白，剂量为100ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0070] (9)哮喘模型MT-2_1000ng/kg蛋白组（MT-2_1000):首次用OVA腹腔注射致敏，2 周后颈外静脉注射MT-2蛋白，剂量为1000ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0071] (10)哮喘模型Trx_lng/kg蛋白组（Trx_l):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈外 静脉注射Trx蛋白，齐[J量为lng/kg，IOmin后OVA激发。
[0072] (11)哮喘模型Trx_10ng/kg蛋白组（Trx_10):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后颈 外静脉注射Trx蛋白，剂量为10ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0073] (12)哮喘模型Trx_100ng/kg蛋白组（Trx_100):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后 颈外静脉注射Trx蛋白，剂量为100ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0074] (13)哮喘模型Trx_1000ng/kg蛋白组（Trx_1000):首次用OVA腹腔注射致敏，2周 后颈外静脉注射Trx蛋白，剂量为1000ng/kg，IOmin后OVA激发。
[0075] 3.实验结果
[0076] 表1大鼠哮喘模型各组气道阻力比较（kPa/ml/sX 1000)
【主权项】
1. 金属硫蛋白MT-2在制备哮喘治疗药物中的用途。
2. -种治疗哮喘的药物组合物，含有金属硫蛋白MT-2。
3. -种治疗哮喘的药物制剂，其有效量成分为金属硫蛋白MT-2。
4. 如权利要求3所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还含有药学上可接受的 载体。
5. 如权利要求3所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为针剂或气雾剂。
6. -种治疗哮喘的方法，包括对患者施用金属硫蛋白MT-2。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述金属硫蛋白MT-2作用于患者的气道平 滑肌。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述施用的方式包括吸入、口服或注射。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述金属硫蛋白MT-2通过配制为气雾剂递 送至患者。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述金属硫蛋白MT-2为SEQ ID NO :1所 示氨基酸序列的蛋白或其同源蛋白。
【专利摘要】本发明涉及蛋白药物领域，具体公开了一种金属硫蛋白MT-2制备哮喘治疗药物的用途及含有该蛋白的药物制剂。本发明揭示了金属硫蛋白MT-2舒张气道平滑肌、降低气道阻力的新功能，MT-2能明显舒张气道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的气道阻力，起到治疗哮喘的作用，可用于哮喘疾病的预防、治疗以及哮喘治疗药物的制备，将其应用于哮喘疾病的治疗，具有使用安全、有效、稳定等优点。
【IPC分类】A61K38-16, A61P11-06, A61K38-17
【公开号】CN104548065
【申请号】CN201310493199
【发明人】杨永清, 尹磊淼, 王宇, 徐玉东
【申请人】上海中医药大学, 上海市针灸经络研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月18日