抗黑色素瘤dna质粒疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA疫苗，具体涉及一种抗黑色素瘤DNA质粒及其制备方法。 技术背景
[0002] 恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM)是一类起源于神经嵴黑色素细胞的恶性 肿瘤，多发于皮肤，是一种最具有侵袭性的皮肤肿瘤，具有发病年龄早，转移率高等特征。目 前，我国MM的发病率相对较低，但随着我国工业的发展和环境状况的恶化，其发病率的增 长速度已远远超过其他恶性肿瘤，近四年间我国恶性黑色素瘤的发病率升高了 5倍，是肿 瘤发病率增长最快的一种。由于MM的恶性程度高，发生比较隐匿，且对目前临床各种治疗 方法极不敏感，尤其是对化疗药具有较高的耐受性。因此，应用免疫疗法治疗恶性黑色素瘤 被认为是极具前景的治疗策略。
[0003] DNA疫苗是在基因治疗和转基因技术基础上产生的第三代疫苗，是疫苗的一次革 命，在预防和治疗病毒、细菌等传染病和肿瘤等方面具有广阔的应用前景，DNA疫苗进入体 内后主要依靠树突状细胞（DCs)的递呈，产生免疫应答。不成熟的DCs会导致肿瘤的特异 性耐受和免疫逃逸，而成熟的DCs可产生免疫反应，也就是说处于不同成熟阶段的DCs决定 了机体发生免疫反应的类型。可见，改变DC的表型和功能将是机体对肿瘤抗原产生免疫应 答的前提。
[0004] 作为肿瘤免疫治疗的DNA疫苗是将编码某种肿瘤特异性抗原蛋白的外源基因 (DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达、合成抗原蛋白，进而活化能 特异性杀伤肿瘤细胞的T细胞，以达到预防和治疗肿瘤的目的。树突状细胞是机体内抗原 呈递功能最强、唯一能在体内激活初始型T细胞的抗原呈递细胞，同时可以通过MHC I和 MHC II类分子途径呈递抗原，并提供充分的共刺激信号，在T细胞抗肿瘤免疫应答的启动、 调控过程中起着关键作用。而细胞因子能刺激DCs的成熟和递呈，特别是GM-CSF (粒细 胞-巨噬细胞集落刺激因子）是一种强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增 殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子。但现有的DNA疫苗的抗原性不强，并不能有效防治 黑色素瘤，为此需要寻找一种有效的DNA疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是现有DNA疫苗的抗原性不强，并提供一种制备简单、 成本低廉且安全可靠有效防治黑色素瘤的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗。
[0006] 本发明还相应地提供一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗， 包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中除了黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp2)目的基因， 增加了强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的 细胞因子（GM-CSF)以及Fc融合蛋白2种基因表达单位元件和报告基因的重组质粒的真核 表达载体。
[0008] 所述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗含有TrpJi应的全部基因序列。
[0009] 所述质粒载体中含有GM-CSF对应的全部基因序列。
[0010] 所述质粒载体中含有Fc融合蛋白对应的全部基因序列。
[0011] 所述质粒载体pUCM-T，也可用其他的真核表达质粒载体pcDNA3. 0、pcDNA3. 1等。
[0012] 还提供一种制备上述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述 步骤： 1) 分别根据GenBank的Trp2、GM-CSF、Fc的功能编码区的序列，采用相关计算机软件进 行引物设计，人外周白细胞或淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成，以反转录出的各自第一条 cDNA为模板，用PCR扩增Trp2、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收； 2) 目的基因片段（Trp2、GM-CSF、Fc)分别与T载体（pGEM-T Vector)连接，转化并酶切 鉴定筛选；构建的三种目的基因质粒及PEGFP-N2质粒的扩增、抽提，并分别进行双酶切，使 得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切位点，在1'印2两端引入Bgl II、Sal I酶切位点， 在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点； 3) 目的片段（!'印2、61^5?、？。36??)与用了4 0嫩连接酶？此1-1'￥6(^〇1'载体连接； 4) 将连接产物转化化学感受态细胞中，在合适温度下的培养基中培养扩增；经过筛选 和质粒抽提试剂盒抽提获得DNA质粒疫苗PEGFP-Trp 2-GM-CSF-Fc。
[0013] 上述抗黑色素 DNA质粒疫苗的制备方法，将上述DNA质粒疫苗溶于纯水中，并以阳 离子聚合物PEI (MW 25 KDa)为免疫佐剂和给药载体，制备得到含有阳离子聚合物的DNA 质粒疫苗。
[0014] 本发明将编码细胞因子、靶向膜表面Fc受体、肿瘤特异性抗原蛋白的基因构建在 同一质粒中以增强疫苗的免疫诱导作用。本部分以构建黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp 2)、细 胞因子（GM-CSF)、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件，以构成一种多元、祀向、高效的复合 型DNA疫苗。利用DCs膜表面的Fc受体能改变DCs的表型和功能，通过激活或抑制DC上 Fc受体，决定DC产生免疫反应或免疫耐受，将表达Fc融合蛋白的基因重组于治疗性DNA疫 苗中可使其进入体内后实现DCs靶向。
[0015] 本发明选择聚乙烯亚胺（PEI)作为载体材料，通过静电吸附制备免疫纳米粒，该载 体材料存在以下2个优点：① PEI分子富含氨基，在生理pH条件下仅部分氨基质子化，富含 阳离子，有较强的结合DNA和粘附细胞的能力；②PEI具有较强压缩DNA的作用，其转染效 率很高，在胞内体、溶酶体酸性囊泡中有"质子海绵"的作用，因此能使胞内体裂解，溶酶体 肿胀，破裂以避免对DNA的降解。
[0016] 本发明将PEI/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc通过微针或局部注射对荷黑色素瘤小鼠给 药，能大量刺激产生IL-12和IFN-γ等细胞因子的分泌表达，延长荷瘤小鼠的生存周期，明 显抑制肿瘤部位细胞的炎症，结果表明对黑色素瘤有很好的治疗效果。
【附图说明】
[0017] 图I. pEGFP-N2质粒载体构建图。
[0018] 图2. pEGFP-N2载体质粒酶切鉴定结果。
[0019] 图3. PCR扩增后Trp2目的基因片段的琼脂糖电泳图。
[0020] 图4. PCR扩增后GM-CSF目的基因片段的琼脂糖电泳图。
[0021] 图5. PCR扩增后Fe目的基因片段的琼脂糖电泳图。
[0022] 图6. EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc重组质粒的酶切鉴定结果。
[0023] 图7. PEI25k/DNA体外对B16细胞的毒性结果。
[0024] 图8. PEI25k/DNA对荷瘤小鼠抗肿瘤效果。
[0025] 图9. PEI25k/DNA对荷瘤小鼠生存率情况。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0027] 抗黑色素瘤DNA质粒的构建与纯化：1)目的基因获得：采用Primer Premier 6. 0和Beacon designer软件进行引物的设计，分离人外周白细胞，提取总RNA，逆转录 合成cDNA，以上反转录出的各自第一条cDNA为模板，用Platinum PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen)扩增Trp2、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收。回收得到的目的 基因片段分别连接到pGEM-T Vector，感受态DH5 α转化，扩增，抽提并鉴别。三种目的基 因质粒以及PEGFP-N2质粒分别进行双酶切，使得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切 位点，并在1'印2两端引入Bgl II、Sal I酶切位点，在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位 点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点。结果如图2、3、4、5所示。2)目的基因片 段（Trp2、GM-CSF、Fc)用T4DNA连接酶分别与pCUM-T Vector连接、转化，将连接产物涂布到 含卡那霉素抗性固体培养基平皿转化，挑取若干单克隆菌落，接种到含卡那霉素抗性液体 培养基中，摇床中37°C 300 rpm振荡培养过夜。将重组质粒酶切鉴定，结果如图5所示， 测序鉴定为： KQkTCTATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGTTCCA TTCAGAGCCGA TACA TCAGCA TGAGTGTGTGGACAAGCC CACGGAGACTTGTGGAGCTGGCAGGGCAGAGCCTGCTGAAGGATGAGGCCCTGGCCATTGCCGCCCTGGAGTTGCTG CCCAGGGAGCTCTTCCCGCCACTCTTCATGGCAGCCTTTGACGGGAGACACAGCCAGACCCTGAAGGCAATGGTGCA GGCCTGGCCCTTCACCTGCCTCCCTCTGGGAGTGCTGATGAAGGGACAACATCTTCACCTGGAGACCTTCAAAGCTG TGCTTGA TGGACTTGA TGTGCTCCTTGCCCAGGAGGTTCGCCCCAGGAGGTGGAAACTTCAAGTGCTGGA TTTACGG AAGAACTCTCA TCAGGACTTCTGGACTGTA TGGTCTGGAAACAGGGCCAGTCTGTACTCA TTTCCAGAGCCAGAAGC AGCTCAGCCCA TGACAAAGAAGCGAAAAGTAGA TGGTTTGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCTTCA TTCCAGTAGAGG TGCTCGTAGACCTGTTCCTCAAGGAAGGTGCCTGTGA TGAA TTGTTCTCCTACCTCA TTGAGAAAGTGAAGCGAAAG AAAAA TGTACTACGCCTGTGCTGTAAGAAGCTGAAGA TTTTTGCAA TGCCCA TGCAGGA TA TCAAGA TGA TCCTGAA AA TGGTGCAGCTGGACTCTA TTGAAGA TTTGGAAGTGACTTGTACCTGGAAGCTACCCACCTTGGCGAAA TTTTCTC CTTACCTGGGCCAGA TGA TTAA TCTGCGTAGACTCCTCCTCTCCCACA TCCA TGCA TCTTCCTACA TTTCCCCGGAG AAGGAAGAGCAGTA TA TCGCCCAGTTCACCTCTCAGTTCCTCAGTCTGCAGTGCCTGCAGGCTCTCTA TGTGGACTC TTTA TTTTTCCTTAGAGGCCGCCTGGA TCAGTTGCTCAGGCACGTGA TGAACCCCTTGGAAACCCTCTCAA TAACTA ACTGCCGGCTTTCGGAAGGGGA TGTGA TGCA TCTGTCCCAGAGTCCCAGCGTCAGTCAGCTAAGTGTCCTGAGTCTA AGTG