到硝酸纤维素膜上。接着，将硝酸纤维素膜放置在含有5%脱脂牛奶TBST中室温孵育lh，然后一抗孵育过夜(β -actin(l/10000, B1world), POMC(1:10000，ABGENT), M0R(1/10000, Epitomics),NKl 受体(1/500，Proteintech) DOR (1/500, B1world))。在这之后，二抗室温孵育 2h(β -actin、DOR、MOR 和 TACRl 的二抗是 HRP-羊抗兔 IgG (1/5000，B1world)，POMC 二抗是HRP-兔抗羊IgG (1/5000, B1world))。最后在化学发光成像仪(Sage Creat1n)上显色。蛋白分子量大小与预染蛋白marker (Fermentas)进行对比。
[0072]为了分析western bloing数据，对照的灰度被定义为100%,其数值由QuantityOne软件(B1-world)测定。样品的灰度根据对照灰度被以百分比的形式输出。所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。
[0073]数据分析
[0074]所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。数据以平均值土SEM形式表示。所有的数据用SPSS软件(SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)分析。P值< 0.05被认为具有显著性差异。
[0075]结果
[0076]1、给小鼠侧室注射寡肽Asqffglm-NH2后，其在脑中的分布位点
[0077]在荧光显微镜下，fluo-寡肽ASQFFGLM-NH2肽在蓝光激发下显示绿光。给侧脑室注射药物1min后，fluo-寡肽ASQFFGLM_NH2主要分布在脑室以及几个与脑室相邻的结构。然而，fluo-寡肽Asqffglm-NH2和fiuo-r/mHK-1主要的不同分布位点是,在fluo-寡肽Asqffglm-Nh2处理组中，没有在导水管灰质(pag)和e/ov发现绿色荧光。
[0078]2、编码NKl受体和不同的前速激肽原在mRNA水平的表达特征
[0079]我们采用实时定量RT-PCR的方法比较研究了 NKl受体和前速激肽原在mRNA水平的表达变化(图1)。其中管家基因GAPDH用来做内参。在实时定量PCR实验中，2-δδμ方法被用于分析基因表达的相对变化。与对照组相比(生理盐水，标准化为1)，侧脑室注射寡肽 AsqFFGLM-NH2 后 5min、10min 和 20min 的 NKl 受体的 mRNA 值分别是 0.91 ±0.05，0.93±0.04and0.87±0.06 (图 la，A)。5min、1min 和 20min 的 PPT-A mRNA 值分别是0.99±0.06、0.93±0.17 和 0.96±0.09 (图1a,B) ? 5min、1min 和 20min 的 PPT-C mRNA 值分别是0.96±0.08、1.10±0.11和0.96±0.03 (图la,C)0数据分析表明对照和所有寡肽Asqffglm-NH2处理组的寡肽asqffglm-nh2无显著性差异，这表明在小鼠中，nki受体和前速激肽原的mRNA表达水平不受侧脑室注射寡肽Asqffglm-NH2的影响。
[0080]3、编码内源性阿片受体和阿片肽的mRNA的表达特征
[0081]利用实时定量rt-pcr技术，我们发现，与对照相比，寡肽Asqffglm-NH2处理组的DOR在mRNA水平上发生显著增强。侧脑室注射寡肽ASQFFGLM_NH2后5、10和20min时间点的值分别是 601.7±137.0,386.1 + 83.1 和 254.3 + 68.7 (图 2e，E)。然而，DOR 的内源性配体PENK在mRNA水平没有发生显著变化，在侧脑室注射药物后，5、10和20min时间点的值分别是 1.08±0.11,0.94±0.10 和 0.97±0.08 (图 2d，B)。MOR (图 2a,A),POMC(M0R 的一个内源性配体，图2b，B)，KOR (图2c，C)和PDYN(K0R的一个内源性配体，图2d，D)在药物处理后在mRNA的表达水平均未发生显著变化。
[0082]4、小鼠侧脑室注射寡肽Asqffglm-NH2后导致dor受体蛋白的表达显著增高
[0083]最后，我们检测了由侧脑室注射寡肽Asqffglm-Nh2引起的dor转录本的上调是否与dor蛋白的表达增加相关。在图3D中可以看到，与对照组相比，经寡肽Asqffglm-NH2处理后，DOR蛋白的表达发生了显著上调。在5、10和20min时间点，DOR蛋白的表达量分别是 1.78±0.28，3.26±0.50 和 5.29±0.86 (图 3D)。此外，我们也检测了 NKl 受体、MOR 和POMC的转录表达与它们各自的蛋白表达的相关性，由图3A-C的结果可见这几种蛋白在对照组与hHK-Ι的之间没有发生显著变化。
[0084]实施例2
[0085]材料和方法
[0086]动物
[0087]雄性和雌性的ICR小鼠(20±1.0g)由杭州师范大学动物中心(中国杭州)随机提供。所有动物实验程序由浙江理工大学动物饲养和使用委员会批准，并且符合1986年11月24号欧共体委员会指令(86/609/EEC)。所有的动物饲养在12小时光/暗周期的23 °C -25 °C环境中，并且在实验开展前提供标准的食物和水。所有实验过程中尽可能减少小鼠所受到的伤害和痛苦。
[0088]多肽
[0089]寡肽Asqffglm-NH2多肽由中肽公司(中国杭州)使用固相多肽合成法合成，并且使用高效液相(HPLC)纯化，其纯度达到98%。寡肽Asqffglm-NH2溶解在生理盐水中，工作液浓度是1.5mM。
[0090]侧脑室注射和甩尾实验
[0091]侧脑室注射按照Haley和McCormick描述的在清醒小鼠中的操作方法进行操作。每只小鼠注射的寡肽Asqffglm-NH2最终剂量是6nmoi，注射体积是4 μ I。在侧脑室注射人HK-1 (4-11)后，马上皮下注射2mg/kg的吗啡，然后用温浴甩尾实验检测联合注射这两种药物对小鼠急性疼痛的影响。在温浴甩尾实验中，每只小鼠只用一次。将小鼠尾部1/3浸入48.5°C的恒温水浴中，从浸入开始到小鼠自发将尾部甩出水浴的时间间隔定义为甩尾潜伏期。每只小鼠在实验前先检测甩尾潜伏期，并筛选甩尾潜伏期在2.5-4.5s的小鼠进行实验研究，过于迟钝和过于敏感的小鼠都弃去不用。为了避免小鼠尾部被烫伤，小鼠甩尾潜伏期的最大值为15s。每只小鼠每次测甩尾潜伏期的时间间隔为10s，最后四次的甩尾潜伏期的平均值作为用药处理前的甩尾潜伏期，且这四次甩尾潜伏期的变异不能超过10%。联合注射人HK-1 (4-11)和吗啡后，检测药物注射后10，20，30，40，50和60分钟各自的甩尾潜伏期。
[0092]镇痛作用用下列公式进行计算:
[0093]甩尾潜伏期的变化百分率=[(用药后的甩尾潜伏期-用药前的基础甩尾潜伏期)/用药前的基础甩尾潜伏期]*100%
[0094]数据分析
[0095]所有的数据来源于至少独立的三次重复实验。数据以平均值土SEM形式表示。所有的数据用SPSS软件(SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)分析。P值< 0.05被认为具有显著性差异。
[0096]结果
[0097]侧脑室注射人HK-1 (4-11)联合皮下注射吗啡后的协同镇痛效果
[0098]从图4可以看出，侧脑室注射人HK-1 (4-11)能显著增强皮下注射的吗啡的镇痛效果，在注射后一小时的时间内，每个10分钟检测到的镇痛增强的幅度大约是原来吗啡镇痛效果的两倍。由此可见，侧脑室注射人HK-1 (4-11)联合皮下注射吗啡具有强效的协同镇痛效果。
[0099]本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
【主权项】
1.寡肽Asqffglm-NH2和吗啡联合在制备用于在受试者中治疗或缓解癌痛的制剂中的用途。
2.根据权利要求1中所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的哺乳动物为人。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的制剂为药物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述的寡肽被PEG化修饰。
6.寡肽Asqffglm-NH2在制备用于增强吗啡在受试者中治疗或缓解癌痛效果的制剂中的用途。
7.根据权利要求6中所述的用途，其中所述的受试者为哺乳动物。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的哺乳动物为人。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述的制剂为药物。
10.治疗或缓解癌痛的药物或试剂盒，其包含有效量的寡肽Asqffglm-NH2和吗啡。
【专利摘要】本发明涉及一种用于癌痛治疗的寡肽联合或与吗啡组合的产品以及对抗癌痛的药物以及寡肽联合或与吗啡的组合在制备用于癌痛的药物中的用途。具体而言，本发明的寡肽ASQFFGLM-NH2在提高受试者中提高δ阿片受体的转录和/或表达水平，并进而能够提高吗啡的对抗癌痛的效果。
【IPC分类】A61P29-00, A61K31-485, A61K38-08, A61P35-00
【公开号】CN104800832
【申请号】CN201410033394
【发明人】付彩云, 项春生, 戴玲华
【申请人】浙江省易文赛细胞药物和制品研究院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月23日