悬液，以中间层凹土悬液量的15%的量继续 加入上述去离子水，同样操作，重复3次，于120°C烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土 备用； 第二步多孔淀粉的选择：多孔淀粉是由生淀粉酶在低于糊化温度下作用于生淀粉而 形成的多孔性蜂窝状变性淀粉，其小孔直径为1 μ m，孔的容积占颗粒体积的50%，吸油率为 lg/g ; 第三步多孔淀粉与凹土的复合：多孔淀粉与凹土以8:1混合； 第四步益生菌菌悬液的制备：将地衣芽孢杆菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用 无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为9的缓冲体系中，并将浓度调节至IOltlCFU/ ml备用；其中，地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO42g，蒸馏水1000ml，pH 0 ;37°C振荡培养40h，摇床转速为180rpm ; 第五步吸附益生菌：将500g多孔淀粉与凹土的复合物，悬浮至IOL的菌悬液中，于 35°C震荡吸附35分钟，震荡速度为150rpm ; 第六步真空冷冻干燥：步骤五的混合物经真空冷冻干燥法获得凹土为载体的益生菌活 菌制剂，真空冷冻干燥法条件为：步骤五的混合物于-75°C预冻3小时，移入冷冻干燥机冷 冻干燥28小时，使制剂含水量< 2%，检测活菌剂中活菌数为109CFU/g。
[0028] 实施例9 :依以下步骤制备益生菌制剂 第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5 μ s/cm的去离子水浸泡25h，搅拌器以 1500rpm转速搅拌25h，静置分层，取中间层凹土悬液，以中间层凹土悬液量的20%的量继续 加入上述去离子水，同样操作，重复2次，于120°C烘干，研磨，过筛，取200目至140目细土 备用； 第二步多孔淀粉的选择：多孔淀粉是由生淀粉酶在低于糊化温度下作用于生淀粉而 形成的多孔性蜂窝状变性淀粉，其小孔直径为1 μ m，孔的容积占颗粒体积的50%，吸油率为 2g/g ； 第三步多孔淀粉与凹土的复合：多孔淀粉与凹土以1:1混合； 第四步益生菌菌悬液的制备：将酵母菌培养至对数生长期后期，收集菌体，采用无菌生 理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于pH为5的缓冲体系中，并将浓度调节至IO9CFUAiI备 用；其中，酵母菌培养条件是：培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然； 28°C振荡培养18h，摇床转速为150rpm ; 第五步吸附益生菌：将1000 g多孔淀粉与凹土的复合物，悬浮至IOL的菌悬液中，于 20°C震荡吸附60分钟，震荡速度为200rpm ; 第六步真空冷冻干燥：步骤五的混合物经真空冷冻干燥法获得凹土为载体的益生菌活 菌制剂，真空冷冻干燥法条件为：步骤五的混合物于~_55°C预冻3小时，移入冷冻干燥机冷 冻干燥25小时，使制剂含水量< 2%，检测活菌剂中活菌数为1012CFU/g。
[0029] 上述实施例的部分实验数据如表1、表2和图1所示。
[0030] 表1由保护剂制得的益生菌制剂存活率比较
【主权项】
1. 多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其特征是：该益生菌制剂的 制备方法首先是纯化凹土，然后将凹土与多孔淀粉混合，再将制备好的益生菌菌悬液在一 定的条件下吸附至多孔淀粉和凹土表面，最后采用真空冷冻干燥法制备益生菌制剂。
2. 根据权利要求1所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是该益生菌制剂制备方法包括以下步骤： 第一步凹土的纯化：将凹土采用电导率低于5 y s/cm的去离子水浸泡20~28h，搅拌器 以1000~1500rpm转速搅拌20~28h，静置分层，取中间层凹土悬液，以中间层凹土悬液量的 5~20%的量继续加入上述去离子水，同样操作，重复2~3次，于105~120°C烘干，研磨，过筛， 取200目至140目细土备用； 第二步多孔淀粉的选择：多孔淀粉是由生淀粉酶在低于糊化温度下作用于生淀粉而 形成的多孔性蜂窝状变性淀粉，其小孔直径为I U m，孔的容积占颗粒体积的50%，吸油率为 l~2g/g； 第三步多孔淀粉与凹土的复合：多孔淀粉与凹土以1:1〇~1〇:1混合； 第四步益生菌菌悬液的制备：将枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保 加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌或酵母菌培养至对数生长期后期， 收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤去培养基，将菌体悬浮于PH为2~9的缓冲体系中，并将浓 度调节至l〇 9~l〇lclCFU/ml备用； 第五步吸附益生菌：将l〇〇~l〇〇〇g多孔淀粉与凹土的复合物，悬浮至IOL的菌悬液中， 于15~35°C震荡吸附10~60分钟，震荡速度为90~200rpm ; 第六步真空冷冻干燥：步骤五的混合物经真空冷冻干燥法获得凹土为载体的益生菌活 菌制剂，真空冷冻干燥法条件为：步骤五的混合物于-40~-75°C预冻2~3小时，移入冷冻干 燥机冷冻干燥20~28小时，使制剂含水量< 2%，检测活菌剂中活菌数为109~1012CFU/g。
3. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述枯草芽孢杆菌培养条件是：培养基：葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠 5g，蒸馏水1000ml，pH7. 2 ;35°C振荡培养18h，摇床转速为180rpm。
4. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述双歧杆菌培养条件是：培养基：蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g， NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸馏水 1000ml，pH7 ;35°C静置培养 22 小时。
5. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述嗜酸乳杆菌培养条件是：培养基：蛋白胨l〇g，牛肉膏l〇g，酵母膏5g，柠檬酸氢 二铵 2g，葡萄糖 20g，吐温-80 lml，CH3COONaCH2O 5g，K2HPO4CH2O 2g，MgSO4WH2O 0.58g， MnSCVH2O 0? 25g，蒸馏水 1000ml，调 pH6. 2-6. 4 ;37°C静置培养 20 小时。
6. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述嗜热链球菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌，40°C静置培养20小时；所述保 加利亚乳杆菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌，37°C静置培养20小时；所述鼠李糖乳杆 菌培养条件是：培养基同嗜酸乳杆菌，37°C静置培养20小时。
7. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述粪链球菌培养条件是：培养基：蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸馏水1000ml， pH6. 8 ;37°C振荡培养6h，摇床转速为lOOrpm。
8. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述地衣芽孢杆菌培养条件是：培养基：葡萄糖5g，蛋白胨5g，K 2HPO4 2g，MgSO4 2g， 蒸馏水1000ml，pH 7. 0 ;37°C振荡培养40h，摇床转速为180rpm。
9. 根据权利要求2所述的多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，其 特征是所述酵母菌培养条件是：培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自 然；28°C振荡培养18h，摇床转速为150rpm。
【专利摘要】本发明公开了多孔淀粉复合凹土作为保护剂制备益生菌制剂的方法，该益生菌制剂的制备方法首先是纯化凹土，然后将凹土与多孔淀粉混合，再将制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下吸附至多孔淀粉和凹土表面，最后采用真空冷冻干燥法制备益生菌制剂。本发明采用多孔淀粉复合凹土作为保护剂，制得的益生菌制剂在真空冷冻过程中和在人工模拟胃环境中的存活率高，人工肠环境中较长时间地维持高活菌水平。
【IPC分类】A61K35-744, A61K35-742, A61K47-36, A61K35-745, A61K36-06, A61P1-00, A61K47-02, A61K35-741, A61K35-747
【公开号】CN104857519
【申请号】CN201510207271
【发明人】赵玉萍, 游庆红, 蒋长兴
【申请人】淮阴工学院
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月28日