酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至7. 4,无菌条件下通过 0. 22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[0030] 实施例2 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液（由氯化钠6g， 氯化钾0. 05g，磷酸氢二钠 lg，磷酸二氢钾0. 05g，氯化钙0. 05g，含6个结晶水的氯化镁 〇. 〇5g溶于1000 ml双蒸水中得到)中含有：氨基酸组合4g(其中蛋氨酸0. 5g、赖氨酸0. 8g、色 氨酸0. 4g、谷氨酸0. 8g、甘氨酸0. 9g和丙氨酸0. 6g)、维生素组合8g(其中维生素 A I. 4g、 维生素 D 2. 4g和维生素 E 1.6g、维生素 K 2. 6g)、复方中药多糖15g(由云芝20份、角叉藻 10份、天麻10份、苟药5份和桃仁5份提取得到)、亚硒酸钠5mg，该辅助液pH为7. 5。
[0031] 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的制备方法，其步骤同实施例1。
[0032] 实施例3 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液（由氯化钠10g， 氯化钾0. 5g，磷酸氢二钠 I. 2g，磷酸二氢钾0. 5g，氯化钙0. 2g，含6个结晶水的氯化镁0. 2g 溶于1000ml双蒸水中得到)中含有：氨基酸组合5g (其中蛋氨酸0. 6g、赖氨酸I. 2g、色氨 酸0. 8g、谷氨酸0. 6g、甘氨酸0. 6g和丙氨酸I. 2g)、维生素组合IOg (其中维生素 A I. 0g、 维生素 D 3. 0g、维生素 E 2. 8g、维生素 K 3. 2g)、复方中药多糖30g、亚硒酸钠10mg，该辅助 液pH为7. 6。
[0033] 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的制备方法，其步骤同实施例1。
[0034] 实施例4 :一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的使用方法 1)接种家兔用猪瘟病毒辅助液及其配制，方法同实施例1。
[0035] 2)猪瘟病毒家兔接种与病毒收获 (1)接种家兔的选择 选择生长状况良好、体重I. 5_3kg的家兔100只。
[0036] (2)接种 取生产用毒种，用上述病毒辅助液作适当稀释(如ΚΓ1·5或10 _2)，每只家兔耳静脉接种 lml。接种后家兔正常饲养。
[0037] (3)测温观察 家兔接种后，上、下午各测体温一次，24小时后，每隔6小时测体温一次。测温至72小 时。
[0038] (4)收获 选择定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾 脏。
[0039] (5)病毒悬液检验 在无菌操作下剔除脂肪组织。将脾脏组织称重、剪碎，于同一容器内混合研磨，然后滤 过，测定病毒含量，脾毒对家兔的最小感染量应< KTVml。
[0040] 比较例1 :采用上述稀释液稀释病毒接种家兔与常用稀释液稀释病毒接种家兔各 项指标的比较。
[0041] 1)本发明接种家兔用病毒辅助液及其配制，方法同实施例1。
[0042] 2)常用病毒稀释液及其配制，即生理盐水，按常规技术进行配制。
[0043] 3)猪瘟病毒家兔接种与病毒收获 (1)接种家兔的选择 选择生长状况良好、体重I. 5-3kg的家兔200只。
[0044] (2)接种 将200只家兔分两组，一组取生产用毒种，用本发明辅助液作适当稀释(如KT15或 1〇_2)，每只家兔耳静脉接种Iml ;另一组采用常规稀释液将种毒做同样倍数稀释，每只家兔 耳静脉接种lml，接种后家兔正常饲养。
[0045] (3)测温观察 家兔接种后，上、下午各测体温一次，24小时后，每隔6小时测体温一次。测温至72小 时。
[0046] (4)收获 选择定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾 脏和淋巴结。两个实验组分别收获。
[0047] (5)病毒悬液检验 在无菌操作下剔除脂肪组织。将脾脏组织称重、剪碎，于同一容器内混合研磨，然后滤 过，测定病毒含量，脾毒对家兔的最小感染量应< KTVml。
[0048] 4)两组组方法接种家兔后热反应数据表，见表1。
【主权项】
1. 一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于每1000 ml磷酸缓冲液中含有以下重 量配比的组分：维生素组合6~10g、氨基酸组合3~5g、复方中药多糖10~30g、亚硒酸 钠0~IOmg ; 所述的氨基酸组合包括蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸； 所述的维生素组合包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K ; 所述的复方中药多糖由云芝、角叉藻、天麻、芍药、桃仁提取得到。
2. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于该辅助液的pH为 7. 2 ~7. 6。
3. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的磷酸缓冲 液由氯化钠6~10g，氯化钾0? 05~0? 5g，磷酸氢二钠1~I. 2g，磷酸二氢钾0? 05~0? 5g， 氯化钙0. 05~0. 2g，含6个结晶水的氯化镁0. 05~0. 2g溶于1000ml双蒸水中得到。
4. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的每1000 ml 磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：维生素组合7~9g、氨基酸组合3. 5~4. 5g、复方 中药多糖15~25g、亚硒酸钠2~8mg。
5. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的氨基酸组 合中含有：蛋氨酸10~15%、赖氨酸20~30%、色氨酸5~20%、谷氨酸10~30%、甘氨酸 5~30%和丙氨酸5~30%。
6. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的氨基酸组 合中含有：蛋氨酸12~14%、赖氨酸22~26%、色氨酸10~15%、谷氨酸15~25%、甘氨酸 10~20%和丙氨酸15~25%。
7. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的维生素组 合中含有：维生素A 10~20%、维生素D 15~30%和维生素E 15~45%、维生素K 25~ 60% 〇
8. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的维生素组 合中含有：维生素A 12~18%、维生素D 20~25%和维生素E 20~35%、维生素K 30~ 40% 〇
9. 如权利要求1所述的一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液，其特征在于所述的复方中药 多糖按以下步骤制得： a、 按云芝20~40份、角叉藻10~30份、天麻10~30份、苟药5~20份和桃仁5~ 20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上 清； c、 将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液； e、 将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白； f、 将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖。
10. -种接种家兔用猪瘟病毒辅助液的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤： 1) 磷酸缓冲溶液的配制：称取氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钙，含6 个结晶水的氯化镁溶于双蒸水中，无菌条件下通过0. 22 y m滤膜，过滤除菌备用； 2) 复方中药多糖的制备 a、 称取云芝份、角叉藻份、天麻份、芍药份和桃仁份，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再 加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10 分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上 清； c、 将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； d、 用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液； e、 将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白； f、 将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得复方中药多糖； 3) 接种家兔用病毒辅助液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和 亚硒酸钠，溶解于步骤1)制得的磷酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节pH至7. 2~7. 6 之间，无菌条件下通过0. 22 y m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
【专利摘要】一种接种家兔用猪瘟病毒辅助液及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。该辅助液中每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分：维生素组合6～10g、氨基酸组合3～5g、复方中药多糖10～30g、亚硒酸钠0～10mg。本发明具有积极有益的效果：在接种家兔时能够将病毒送至易感器官，减少接种损失，提高接种成功率；可提高家兔感染的稳定性，减少了批次间差异，确保成品疫苗批次间稳定性，提高了疫苗质量；可特异性的提高猪瘟病毒在家兔体内的增殖密度，比现有技术相比提高了病毒滴度5～10倍；接种家兔后发现所收获的脾脏重量稍有增加，与现有技术相比，所获得的脾脏重量增加了15%～40%。
【IPC分类】A61K31-59, A61K31-715, A61K31-198, A61P37-04, A61K36-8988, A61K31-355, A61K39-39, A61P31-14, A61K31-07, A61K31-405, A61K31-05
【公开号】CN104873796
【申请号】CN201510311129
【发明人】沈建军, 张秀文, 李阳
【申请人】浙江美保龙生物技术有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月9日