_，使针尖位于中间的玻璃体，将药物轻轻注入玻璃体腔；重复注射时，每次移动一个钟点。
[0035]实施例2
[0036](一)体外试验
[0037]一、实验目的
[0038]通过体外实验，分析青蒿素(Q)及其衍生物(青蒿琥酯(ART)、双氢青蒿素(DI)和蒿甲醚(J))对HUVEC和RF/6A的影响，即分析青蒿素及其衍生物抑制HUVEC和RF/6A增殖，诱导HUVEC和RF/6A凋亡的情况，以进一步筛选最有效的青蒿素衍生物单体，计算IC50，以寻找适宜作用浓度。
[0039]二、实验方法
[0040](I)提取人胳静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)进行原代培养，第2-4代细胞供用。
[0041](2)青蒿素及其衍生物单体诱导HUVEC凋亡实验
[0042]实验对象:HUVEC，恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞(RF/6A)；
[0043]实验方法如下，凋亡试验(MTT)，重复3次。
[0044]具体实验步骤:
[0045]1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至50000个/ml，每孔加入10ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。(边缘孔用无菌PBS填充)。
[0046]2、于5%C02，37°C孵育，至细胞生长至80%融合(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，每孔10ul，每一浓度设5个复孔。
[0047]3、5%C02，37°C孵育24小时，倒置显微镜下观察。
[0048]4、吸净孔内处理液，每孔加入200 μ IMTT溶液(0.5mg/ml),继续培养4h。
[0049]5、终止培养，小心吸去孔内MTT溶液。
[0050]6、每孔加入150 μ I 二甲基亚砜(DMS0)，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值。
[0051]三、实验结果
[0052]青蒿琥酯(Artesunate,ART)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DI)、青蒿素(artemisinin,)和蒿甲醚(artemether, J)诱导HUVEC和RF/6A凋亡效果，结果参见图1和图2。
[0053]从图1 可知:青蒿琥酯(ART) IC50:28.7±2.53μ g/ml,双氢青蒿素(DI) IC50:2.1 + 0.37 μ g/ml，青蒿琥酯和双氢青蒿素在本实验所用浓度时即可明显抑制HUVEC增殖，诱导HUVEC凋亡，其中双氢青蒿素抑制HUVEC增殖作用优于青蒿琥酯，青蒿素和蒿甲醚在本实验所用浓度时无明显抑制HUVEC增殖作用。
[0054]经试验表明:青蒿素在500 μ g/ml以上浓度时可出现诱导HUVEC凋亡的作用，而蒿甲醚需高于lmg/ml的油溶液才有诱导凋亡的作用。
[0055]从图2可知:青蒿素及其衍生物在诱导RF/6A凋亡方面，表现出与HUVEC相同的趋势。
[0056]另外，由于青蒿琥酯为水溶性，且在体内的代谢产物为双氢青蒿素，因此后续动物体内试验采用青蒿琥酯进行。
[0057](二)体内试验
[0058]一、实验目的
[0059]通过体外试验，分析青蒿琥酯对视网膜脉络膜新生血管的影响。
[0060]二、实验方法
[0061](I)创建兔眼视网膜新生血管的模型:兔右眼玻璃体腔注射2μgVEGF溶液40μl。
[0062](2)治疗方案:造模成功后依照以下实验分组进行治疗:
[0063]模型组:玻璃体腔注射生理盐水100 μ I ;
[0064]青蒿琥酯治疗组:玻璃体腔注射青蒿琥酯溶液0.1-0.5ml (实施例1所制得的)；
[0065]阿瓦斯汀治疗组:玻璃体腔注射125 μ g/ml阿瓦斯汀溶液0.15ml (参考临床用量);
[0066]正常对照组:所有兔的左眼；
[0067](3)术后评价指标:
[0068]眼底照相，时间点:I周，2周，4周；
[0069]眼底突光造影，时间点:2周,4周；
[0070]三、实验结果
[0071]结果参见图3和图4。
[0072]从图3和图4可知:视网膜脉络膜新生血管模型:经注射2 μ g VEGF溶液40 μ 1，兔眼视网膜血管扩张迂曲，视盘周围出现新生血管，荧光素血管造影显示视网膜脉络膜明显渗漏和视盘周围新生血管。
[0073]治疗效果分析:未经治疗的模型组兔眼视网膜血管扩张迂曲及视网膜脉络膜渗漏持续加重，4周后B超出现牵拉性视网膜脱离。通过玻璃体腔注射青蒿琥酯注射液治疗，可明显抑制兔眼视网膜脉络膜渗漏和新生血管形成，视网膜血管迂曲扩张明显减轻，血管渗出及视盘周围新生血管也明显减轻，至治疗4周后视网膜仍平复，未见视网膜牵拉性脱离；阿瓦斯汀玻璃体腔内注射后2周以内，具有明显的抑制视网膜脉络膜血管渗出、水肿和新生血管形成的作用，但其注射2周后作用开始减弱，视网膜脉络膜再次出现血管渗出、水肿和新生血管形成现象。该结果表明青蒿琥酯可以明显的抑制视网膜脉络膜血管渗出、水肿和新生血管形成，并且其抑制血管渗出、水肿和新生血管形成的作用较阿瓦斯汀更为持久；由于其作用持久，因此，可显著减少眼内注射的次数，也减少了并发症的发生。
[0074]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.青蒿素及其衍生物在制备抑制眼部血管内皮细胞增殖或防治眼部血管系统渗出、水肿、新生血管形成、增殖的相关疾病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治眼部血管系统渗出、水肿、新生血管形成、增殖的相关疾病为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜疾病、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、早产儿视网膜病、视网膜毛细血管扩张症、黄斑水肿、视网膜静脉周围炎、息肉状脉络膜血管病变、新生血管性青光眼、角膜新生血管、虹膜新生血管、脉络膜新生血管、视网膜新生血管、眼及眶部肿瘤、炎性假瘤、甲状腺相关眼病、甲状腺相关免疫眼眶病变、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、高度近视引起的新生血管及出血、葡萄膜炎、增生性玻璃体视网膜病变、外伤性增生性玻璃体视网膜病变、视网膜血管瘤或镰状细胞视网膜疾病。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新生血管形成相关疾病为视网膜脉络膜新生血管性疾病。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用其特征在于，所述青蒿素衍生物为双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚或青蒿酮。5.一种用于抑制眼部血管内皮细胞增殖或防治眼部血管系统渗出、水肿、新生血管形成、增殖的相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分为青蒿素及其衍生物。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的载药方式为:采用缓释技术将青蒿素及其衍生物制成纳米微粒、纳米胶束、纳米微管或树枝状大分子；或将青蒿素及其衍生物溶于0.9%氯化钠溶液或药品上可接受的促溶增溶剂中。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述促溶增溶剂为:碳酸氢钠溶液、二甲基亚砜、乙醇、卵磷脂、乳酸、甘油、硬脂酸聚乙烯、聚乙烯醇、大豆磷脂或泊洛沙姆中的至少一种。8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为滴眼液或注射液。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述注射液的给药途径为:球外注射、植入治疗或眼内注射；所述球外注射为结膜下注射、球周注射、球后注射或筛板周围注射；所述眼内注射为前房及玻璃体腔注射。10.根据权利要求5-9任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述青蒿素衍生物为双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚或青蒿酮。
【专利摘要】本发明公开了一种青蒿素及其衍生物在制备抑制眼部血管内皮细胞增殖或防治眼部血管系统渗出、水肿、新生血管形成、增殖的相关疾病的药物中的应用，和含有青蒿素及其衍生物的药物组合物。本发明所述青蒿素及其衍生物可用于防治眼部血管相关性疾病，如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞等。
【IPC分类】A61K31/357, A61P27/02, A61P29/00, A61P27/06, A61P35/00, A61K31/541
【公开号】CN104906084
【申请号】CN201410088930
【发明人】高前应, 宗瑶
【申请人】中山大学中山眼科中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月11日
【公告号】WO2015135306A1