包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体涉及包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 自10多年前RNA干扰（RNA interference，RNAi)技术发现以来，RNAi已经成为 细胞遗传的关键调节器和阐明机体生长、发病机制和衰老的有力工具。siRNA与相关的蛋 白质结合成RNA。RISC通过siRNA的引导识别并降解靶基因的信使RNA (messenger RNA， mRNA)，使特定蛋白的表达受到抑制，进而特异性导致基因沉默。RNAi成功的关键在于是否 能将siRNA完整地转染入靶细胞，与靶基因mRNA结合，其中siRNA在体内的稳定性具有重 要意义。研宄表明：通过对siRNA结构进行化学修饰和对siRNA骨架进行载体修饰是提高 siRNA体内传递稳定性的2个重要途径。
[0003] siRNA发挥作用时具有高度的序列特异性和很强的靶向性。RNAi具有级联放大效 应，极少量的双链核糖核酸（double-stranded RNA，dsRNA)便可降解比自身浓度大得多的 mRNA，，但体内注射siRNA后，复合物必须经过全身循环系统，尽可能避免肾脏肾小球的滤 过，吞噬细胞的吞，血清蛋白吸附和内源性核酸酶的降解，以及网状内皮系统（RES)的滞 留才能到达靶细胞。siRNA在血清中的稳定性较差，容易被核酸酶RNase降解。静脉注射 siRNA后，siRNA通过血液循环分布到各大器官，同时经历消除。siRNA经血管进入组织间质 (外渗），然后横跨间质到达靶细胞，到达靶细胞后通过内吞摄取。在此过程中，siRNA被内 涵体启动的内吞小囊泡包埋，必须从内涵体逃逸，释放到细胞质中，并加载至RISC方能发 挥作用。siRNA的外渗和穿透能力取决于靶组织的物理结构，而它的胞内摄取量还与siRNA 与载体的表面性质有关。将siRNA传递到靶部位的最大障碍是内涵体对siRNA和载体的包 埋和溶酶体对siRNA和载体的降解。
[0004] 裸SiRNA自身带负电，分子量大，极性强，很难穿过细胞膜、血管内皮，容易在脾脏 滞留，在生物体内容易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低，甚至会产生强烈的炎症反应 等。因此，siRNA的体内稳定性对其疗效的发挥至关重要。利用各种载体的协助，将siRNA 通过不同的手段高效地递送到靶细胞是当前研宄的重点。
【发明内容】
[0005] 本发明一个技术方案是提供一种包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征 在于，组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物。
[0006] 优选地，所述组合物还包含磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组 合。
[0007] 优选地，所述组合物中按照质量份数计算，所述的SiRNA 1-5份和大环酯类化合 物化合物2-5份。
[0008] 优选地，所述组合物中所述的s iRNA序列为HBV s iRNA :
[0009]正义链：[mC] CG [mU] GUG [mC] ACUUCGCUU [mC] A [dT] [dT];
[0010]反义链：UGAAGCGAA⑶G[mC]A[mC]ACG⑶C。
[0011] 优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNA序列1-5份、大环酯类化 合物化合物1_5份，磷脂0_3和脂质-聚乙二醇1_10。
[0012] 优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNAl份、大环酯类化合物化 合物2份，磷脂0. 5份和脂质-聚乙二醇3份。
[0013] 优选地，所述组合物中，所述磷脂选自0??￡、0??(：、0??6、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂，磷 脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种；
[0014] 所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1，2-二 亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇 中的一种或几种。
[0015] 所述T2C1化合物的结构式如下：
[0017]所述T2C1化合物是由1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷和环氧化合物在90°C反应得 到；反应时置于玻璃容器内，持续搅拌，反应摩尔比为1:4,反应时长为24-72小时，优选为 28-65小时。环氧化合物优选环氧烷基缩水甘油醚（烷基C 12-C14)。
[0018] 优选地，所述T2C1化合物是称量1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷与C12-14-烷基缩水 甘油醚mg混合，然后在92°C搅拌下孵育43小时合成T2C1。
[0019] 本发明另一个技术方案是提供包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤：
[0020] (1)将所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
[0021] (2)称取T2C1化合物、磷脂、胆固醇或/和脂质-聚乙二醇，并将这些组分溶解于 溶剂中得溶液二；
[0022] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的溶剂逐 渐蒸发；
[0023] (4)待大部分的溶剂蒸发后，进行均质，得到悬浮液；
[0024] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述包含大环酯类化合物 和siRNA的组合物。
[0025] 优选地，组合物的制备方法，所述溶液一与溶液二的体积比为1: (0. 25-0. 8)。
[0026] 优选地，组合物的制备方法，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一 种或两种以上的组合。
[0027] 所述步骤（4)中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为40_240nm。
[0028] 本发明的可包含大环酯类化合物和siRNA的组合物可提高siRNA治疗的药动学特 征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1合成化合物T2C1化合物
[0030] 称量lOOmgl，4, 7, 10-四氮杂环十二烷与C12-14-烷基缩水甘油醚726. 8mg混合， 然后在92°C搅拌下孵育43小时合成T2C1。
[0031] 实施例2
[0032]制剂配方 siRNA(siRNA+T2Cl+ 胆固醇-聚乙二醇 +DPPE 1:1:1:1)
[0033] 制备制剂：称量一定量的lOOmgT2C1，阳粒子脂质D0TMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚乙 二醇胆固醇聚乙二醇，在玻璃容器内混合溶于三氯甲烷，在真空下除去三氯甲烷。然后加上 300ml水，旋涡震荡溶于水中，经均质处理，均质条件是1000巴，两次循环（ATS均质机）。
[0034] 实施例3
[0035] siRNA:T2Cl 胆固醇-聚乙二醇：DPPE 为 1:0. 3:0. 3:0. 4。
[0036] 制备制剂：称量一定量的lOOmg T2C1，阳粒子脂质D0TMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚 乙二醇，在玻璃容器内混合溶于乙醇，在真空下除去乙醇。然后