加上300ml水，旋涡震荡溶 于水中，经均质处理，均质条件是1000巴，两次循环（ATS均质机）。
[0037] 实施例4
[0038] siRNA:T2Cl:胆固醇-聚乙二醇：DPPE 为 1:0. 5:0. 1:0. 4
[0039] 称量一定量的lOOmg T2C1，阳粒子脂质D0TMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚乙二醇胆固 醇聚乙二醇，在玻璃容器内混合溶于乙醇，在真空下除去乙醇。然后加上300ml水，旋涡震 荡溶于水中，经均质处理，均质条件是1000巴，两次循环（ATS均质机）。
[0040] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以 限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术 方案的范围内。
[0041] 实施例5
[0042] HBV siRNA ：
[0043]正义链：[mC] CG [mU] GUG [mC] ACUUCGCUU [mC] A [dT] [dT];
[0044]反义链：UGAAGCGAAGUG[mC]A[mC]ACGGUC。
[0045] 制剂制备方法参照实施例2。
[0046] 细胞转染：IfepG2. 2. 15细胞接种于96孔板中，在0)2中（5% C02)，37°C培养箱中 培养过夜。第二天早晨细胞覆盖到40 %的孔板面积。用10 y L DMEM培养液稀释0. 5 y L siRNA (1 y M储备溶液)。用10 y L的DMEM培养液稀释0. 4 y L转染制剂(其配方如表一， 部分转染制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果如表二)。并在室温下保持5分钟。混合 稀释的siRNA和稀释的转染制剂，涡旋震荡10秒，并保持在室温下20分钟。加20 y L转染 复合体于含80ULDMEM培养液的孔中。在0)2中（5% C02)，37°C培养箱中继续培养。
[0047] mRNA的分离：转染后两天，将细胞用100 y L PBS洗一次，然后加入 100 y L (Turbocapture试剂盒，Qiagen公司制）裂解缓冲液。溶解的细胞产物（80 y L)转 移到一个96孔的mRNA的捕捉板，在室温下孵育1小时。用100 y L洗涤缓冲液洗涤三次， 然后80 y L的洗脱缓冲液加入到各孔中，在65°C下温育5分钟。洗脱溶液（含有mRNA的） 被转移到一个新的96孔清晰板。
[0048]实时 RT-PCR :3 y L 分离的 mRNA 用来实时 RT-PCR。RT-PCR方法采用 SYBR Green - 步实时 RT-PCR 试剂盒（SensiMix -步 SYBR Green 试剂盒，BI0LINE)。混合 11 y L master mix(含逆转录酶），lyL的正向和反向引物（6yM)，0. 3yL 50X的SYBR Green和2. 7yL 水。反转录反应的温度在42°C，30分钟后，之后95°C，15分钟用于激活Tag聚合酶；PCR循 环的温度和时间是95 °C，15秒，60 °C，30秒，72 °C，20秒。用A A CT方法分析基因表达的变 化。
[0049] 表1:制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果。转染制剂转染siRNA至H印G2. 2. 15 细胞，48小时后取材，用实时RT-PCR方法分析基因表达变化。
[0052] 表2:制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果。转染制剂转染siRNA至H印G2. 2. 15 细胞，48小时后取材，用实时RT-PCR方法分析基因表达变化。
[0053]
【主权项】
1. 一种包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，组合物包含siRNA序列和 大环酯类化合物。2. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，还包含磷 脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。3. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，按照质量 份数计算，所述的siRNAl-5份和大环醋类化合物化合物2-5份。4. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，所述的 siRNA 序列为 HBV siRNA: 正义链：[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT] [dT]; 反义链：UGAAGCGAA⑶G [mC] A [mC] ACG⑶C。5. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，按照质量 份数计算，所述的siRNA序列1-5份、大环酯类化合物化合物1-5份，磷脂0-3和脂质-聚 乙二醇1-10。6. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，按照质量 份数计算，所述的SiRNAl份、大环酯类化合物化合物2份，磷脂0. 5份和脂质-聚乙二醇3 份。7. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于， 所述大环酯类化合物为T2C1化合物，所述磷脂选自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂，磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种； 所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1，2-二亚油 酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇中的 一种或几种。8. 如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 将所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一； (2) 称取大环酯类化合物、磷脂、胆固醇或/和脂质-聚乙二醇，并将这些组分溶解于溶 剂中得溶液二； (3) 将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的溶剂逐渐蒸 发； (4) 待大部分的溶剂蒸发后，进行均质，得到悬浮液； (5) 再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述包含大环酯类化合物和 siRNA的组合物。9. 如权利要求8所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物的制备方法，其特征 在于，所述溶液一与溶液二的体积比为1: (〇. 25-0. 8)。10. 如权利要求8所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在 于，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙醋中的一种或两种以上的组合。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法。所述的组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物，还包含阳离子脂质、磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。本发明的可包含大环酯类化合物和siRNA的组合物可提高siRNA治疗的药动学特征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。
【IPC分类】A61K48/00, A61P1/16, A61K47/22, A61P31/20
【公开号】CN104940952
【申请号】CN201510287200
【发明人】崔坤元, 梁东, 陈波
【申请人】厦门成坤生物技术有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月29日