Equisetin在制备用于防治和治疗代谢综合症药物方面的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药学领域，揭示了 Equisetin(尹奎色亭）在制备用于预防和治疗代谢 综合症药物中的新用途。
【背景技术】
[0002] 代谢综合症多由人体新陈代谢不正常引起，临床症状表现为高血压、高血糖、高血 月旨、动脉粥样硬化以及肥胖等。代谢综合症的病理基础为糖、脂肪和蛋白质代谢失常，虽然 不会直接危及生命，但却可以促使其它严重威胁生命安全的疾病产生。根据作用靶点的不 同，临床上用于治疗代谢综合症疾病的药物也分为很多种类，例如用于降压的ACE抑制剂 培哚普利，用于降脂的烟酸类药物烟酸肌醇酯及贝特类药物利贝特，用于减肥的5-羟色胺 再摄取抑制剂氟西汀等。我国代谢综合症疾病发病率高，严重危害人们的身体健康。随着 现代生活节奏的不断加快、生活压力的不断加大，饮食结构的不合理现象增多，以及食品安 全卫生等问题的日益严峻，代谢综合症疾病的发病几率呈现逐年递增的趋势，因此研制与 开发具有全新作用靶点的新型代谢综合症疾病治疗药物具有重要的意义。
[0003] Equisetin (尹奎色亭）最早发现于陆生真菌，具有抗菌、抗艾滋病、以及抗癌等诸 多活性。凭借特异的化学结构和显著的生物活性，Equisetin及其类似物引起了化学及医 药研究者的广泛关注，目前Equisetin主要被用作抗菌剂，抑制革兰氏阳性细菌。专利发明 者通过前期研究，发现了一种利用海洋真菌Fusarium equiseti大量、高效制备Equisetin 的方法，并通过体外药理活性筛选，首次发现Equisetin具有显著调节糖脂代谢活性。通过 动物体内降糖脂活性评价发现，该化合物降脂效果明显，具有进一步开发成新型降脂药物 的潜力。
【发明内容】
[0004] 本发的主要目的在于提供Equisetin及其药学上可接受的盐的新用途，用于制备 药物，所述药物用于预防或治疗代谢综合症。
[0005] 本发明中Equisetin的生物活性通过以下药学实验得到证明：
[0006] 1)建立脂质堆积细胞模型，评价Equisetin的降脂活性。
[0007] 2)建立高脂血症动物模型，评价Equisetin的降血脂活性。
【附图说明】
[0008] 图I. Equisetin对油酸刺激的肝HepG2细胞内中性脂质堆积的影响。HepG2细胞 用油酸刺激24h，同时给予不同浓度Equisetin和阳性药辛伐他汀（1 μ M)。细胞经固定、油 红〇染色后，测量358nm下的吸光度。数值用平均值土标准差表示。***Ρ < 0· 001，模型 组vs.空白对照；Μρ<〇.〇1,忖><〇.〇〇1，实验组vs.模型组。
[0009] 图2. Equisetin对肝HepG2细胞内胆固醇积累的影响。HepG2细胞用油酸刺激 24h，同时给予不同浓度Equisetin和阳性药辛伐他汀（1 μ Μ)。数值用平均值土标准差表 示。***Ρ〈0·001，模型组 vs.空白对照；V<0.05，ηΡ<0.01, mP<0.001，实验组 vs.模 型组。
[0010] 图3. Equisetin对肝!fepG2细胞内油酸刺激的甘油三酯积累的影响。！fepG2细胞 用油酸刺激24h，同时给予不同浓度Equisetin和阳性药辛伐他汀（1 μ M)。数值用平均值 土标准差表示。***Ρ〈〇· 001，模型组vs.空白对照办<〇.〇5，ηΡ<〇.〇1， tttP^OOl,实 验组vs.模型组。
[0011] 图4. Equisetin对高脂饲料喂养的昆明小鼠血清总胆固醇的影响。小鼠用不同 浓度Equisetin和5mg/kg辛伐他汀灌胃给药18天，血清总胆固醇使用总胆固醇定量试 剂盒测定。数值用平均值土标准差表示。*#Ρ〈〇.〇〇1，模型组vs.正常对照；Mpca 01, mP<0.001，实验组vs.模型组。
[0012] 图5. Equisetin对高脂饲料喂养的金黄地鼠血清总胆固醇（TC)、甘油三酯（TG)、 和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c)的影响。金黄地鼠用不同浓度Equisetin和5mg/kg辛 伐他汀灌胃给药21天，测量血清TC、TG和LDL-c的浓度。数值用平均值土标准差表示。 **?〈0.01，模型组".正常对照 ；￥<〇.〇5，丨￥<〇.〇1，实验组？8.模型组。 具体实施方案：
[0013] 本发明所公开的技术内容，是为了让本领域技术人员更好的理解本发明的实质， 下述实施方案仅作示例。
[0014] 实例 I :Equisetin 的制备
[0015] 利用固体培养基对Fusarium equiseti进行发酵，固体培养基的制备方法为： 将IOOmL人工海水与100g大米加入500mL三角瓶中，静置12h，后于121°C高压湿热灭菌 30min，放凉待用。菌株发酵方法为：在PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂）培养皿上挑取长有新鲜 Fusarium equiseti的琼脂片（1~2cm2)，接种于大米培养基上，培养30瓶，25°C下避光恒 温培养25d，得到发酵产物。
[0016] 发酵产物捣碎后用乙酸乙酯超声萃取3次，每次I. 5h，减压浓缩得粗浸膏 (51. 4g)。浸膏用等比例硅胶（160~200目）扮样，利用减压硅胶柱色谱以石油醚/丙酮 为流动相梯度洗脱。以石油醚/丙酮（20 : l，v/v)洗脱三个柱体积，后用石油醚/丙酮 (10 : l，v/v)洗脱，至洗脱液减压浓缩后无白色粉末析出为止，得到Equisetin(34g，纯度 >95% ) 〇
[0017] 实例2 =Equisetin的降脂活性评价：
[0018] 试验材料：精制Equisetin (纯度>99% )，油酸，油红0,试剂盒（总胆固醇、总甘 油三酯）
[0019] 细胞株：人肝癌细胞株IfepG2
[0020] 试验方法：
[0021] 发明中Equisetin的脂质调节作用
[0022] 取对数生长期肝癌HeG2细胞，消化、计数，以适宜浓度接种到已放入无菌盖玻片 的6孔板中，培养24h小时至细胞完全贴壁。细胞生长汇合至70 % -80 %时，用100 μ M 不饱和脂肪酸-油酸（OA)刺激细胞制成脂质堆积模型；给药组同时给予不同浓度的 Equisetin ;阳性药组给予辛伐他汀（1 μ M)。24h后，弃去培养基，用PBS洗2遍，加4%多 聚甲醛在4°C固定12h。每孔加油红O工作液20 μ L室温染色15min，PBS洗净油红工作液， 每孔加 DMS0150 μ L微升溶解附着脂质上染料，酶标仪358nm波长下测定OD值。
[0023] 实验结果：Equisetin在1-10 μ M的浓度下可以显著降低肝癌HeG2细胞中油酸导 致的脂质堆积，其作用强度与阳性药辛伐他汀相当（图1)。
[0024] 发明中Equisetin对脂质堆积模型细胞内TC、TG含量的影响
[0025] 1)细胞培养
[0026] 细胞分为空白组、模型组、给药组Equisetin(l μ mol/L)、阳性药组辛伐他汀 (1 μ mol/L)，除空白组外，其它组需添加油酸lOOmmol/L共孵育24h.。
[0027] 2)细胞内TC测量
[0028] 弃去培养液，用PBS洗2遍，收集细胞于管中；加200 μ L氯仿：异丙 醇：NP40(7 : 11 : 0. 1)，超声裂解细胞；13000r/min离心15min，取上清于新管中50°C烘 lh，以除去氯仿；将样品放于真空浓缩离心机中抽干，除去剩余有机溶剂。试剂盒测定样品 中 TC 含量，样品加 200 μ LAssay Buffer 溶解，具体操作见 Cholestero 1/Cholesteryl Ester QuantitationKit(BioVision)说明书。BCA试剂盒测定样品中蛋白含量。
[0029] 实验结果：Equisetin在1-10 μ M的浓度下可以显著降低肝癌HeG2细胞中胆固醇 的积累，10 μ M Equisetin的作用强度与1 μ M辛伐他汀的作用强度相当（图2)。
[0030] 3)细胞内TG含量测定
[0031] 收集细胞（约IO7个），加 300ul5% ΝΡ-40超声破碎细胞；将样品放到80-100°C 水浴中缓慢加热2~5min至样品变浑浊，冷却至室温，重复3次。12000r/min离心2min， 取上清于新管中，加适量去离子水稀释样品。试剂盒测定样品中TG含量，具体操作按 Triglyceride Quantification Kit (BioVision)说明书进行。BCA试剂盒测定样品蛋白含量。
[0032] 实验结果：Equisetin在1-10 μ M的浓度下可以显著降低油酸刺激的肝癌HeG2细 胞中甘油三酯的积累，Equisetin的作用强度强于辛伐他汀（图3)。
[0033] Equisetin降血脂活性实验（小鼠商脂血症I旲型）：
[0034] 试验材料：精制Equisetin(纯度>99% )，辛伐他汀，高脂饲料，试剂盒（总胆固 醇）
[0035] 试验动物：健康昆明种小鼠（18~20g)
[0036] 试验方法：取18~22g雄性昆明种小鼠60只，随机分成正常组、高血脂模型组及 Equisetin4 个剂量组（剂量分别为 2. 5g/kg，5g/kg，10g/kg，20g/kg)、5. Omg/kg 辛伐他汀 组，共7组（10只组），除正常组常规饲料喂养外，其他组均喂食高脂饲料，同时灌胃给予相 应药物，正常组和高血脂模型组灌胃等体积自来水。给药18d后，各组小鼠禁食不禁水12h， 摘眼球取血，3000r/min离心10min，取血清，用试剂盒按紫外分光光度法测定血清TC含量。 实验结果：用高血脂小鼠模型对Equisetin降血脂活性进行了研究，以辛伐他汀为阳性对 照药，结果发现Equisetin具有显著的降低模型小鼠血浆中总胆固醇（TC)活性，在低浓度 5g/kg时的降低血浆总胆固醇的活性已经十分显著（p〈0. 01)，且效果与辛伐他汀相当（图 4)。
[0037] Equisetin的降血脂活性实验（金黄地鼠高脂血症模型）：
[0038] 试验材料：精制Equisetin(纯度>99% )，小檗碱，高脂饲料，试剂盒包括总胆固醇 (TG)，总甘油三酯（TC)，低密度脂蛋白（LDL-C)。
[0039] 实验动物：健康金黄地鼠（130_160g)
[0040] 试验方法：取130~160g金黄地鼠60只，随机分成成正常组、高血脂模型组及 Equisetin3个剂量组（剂量分别为2. 5g/kg，5g/kg，10g/kg)、5. Omg/kg辛伐他汀组，共6 组（10只组），除正常组常规饲料喂养外，其他组均喂食高脂饲料（2%胆固醇、15%猪油、 0. 4%胆盐、82. 6%基础饲料），同时灌胃给予相应药物，正常组和高血脂模型组口服等体积 自来水。给药21d后，各组金黄地鼠禁食不禁水12h，摘眼球取血，3000r/min离心10min，取 血清，用试剂盒按紫外分光光度法测定血清TC、TG、LDL-C含量。
[0041] 实验结果：通过高脂饲料诱导建立高血脂症金黄地鼠模型，经给地鼠口服 Equisetin高、中、低剂量的有效部位及阳性药辛伐他汀，Equisetin降血脂作用显著，且降 低血清总胆固醇和低密度脂蛋白的效力与辛伐他汀在同等剂量下作用相当，而降低血清甘 油三酯的效力则优于辛伐他汀（图5)。
【主权项】
I. Equisetin (尹奎色亭）及其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备药物， 所述药物用于预防或治疗代谢综合症，所述的代谢综合症选自：高血脂、动脉粥样硬化或高 血压。
【专利摘要】本发明公开了Equisetin(尹奎色亭)在制备用于预防或治疗代谢综合症药物中的新用途。
【IPC分类】A61P9/12, A61P3/06, A61K36/06, A61P9/10
【公开号】CN105012352
【申请号】CN201410178897
【发明人】林文翰, 郭鹏, 刘 东, 吴崇明, 路萌
【申请人】北京大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月28日