制备鲨烯的改良方法

制备鲨烯的改良方法
【专利说明】
[0001] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB2011/001397,国际申请日为2011年5月 12日，进入中国国家阶段的申请号为"201180023553. 3"，发明名称为"制备鲨烯的改良方 法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求美国临时申请61/395, 448(2010年5月12日提交）的优先权，其全部 内容通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明处于制造具有适于药学应用纯度的鲨烯的领域。 技术背景
[0004] 鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物（C3(]HM;[(CH 3)2C[= CHCH2CH2C(CH3)]2= CHCH 2-]2;2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳己 烯；CAS RN 7683-64-9)。已知鲨烯用于人类疫苗中的水包油乳液，例如用于佐剂化流感病 毒疫苗的MF59乳液。鲨烯还用于其他药物制品（如油膏、栓剂）和化妆品。
[0005] 目前鲨烯的来源主要是鱼油，尤其是鲨鱼肝油。使用提取自鲨鱼肝油的鲨烯可产 生相关问题，尤其是不能维持严格的制造标准时（如诺华公司（Novartis)生产MF59期间 所用的那些）。例如，鲨鱼可被对人也有感染性的病原体感染，或产生对人有害的物质，且可 能存在TSE或TSE样鲨鱼制剂[如参考文献1-3]。此外，鲨鱼可含有人类毒素如真鲨毒素 (carchatoxin)。另外，鲨鱼可含有人类对之过敏的蛋白。人类过敏的常见鱼蛋白是在鲨鱼 中发现的小清蛋白。因此鲨烯的廉价低级别来源不适于人类药学应用。在鲨烯是部分免疫 佐剂的情况中，其对人受体伤害的风险增加，这是由于根据定义，所述佐剂可诱导针对杂质 的强烈不利免疫应答。
[0006] 找到制备适于药学应用的鲨烯的其他和改良过程是有用的，即所述鲨烯是满足调 节标准且不含可伤害人类的污染物、病原体、病毒、人毒素或蛋白的产品。本发明过程特定 用于纯化源自鲨鱼肝油的鲨烯。

【发明内容】

[0007] 本发明提供从动物源含鲨烯组合物中制备鲨烯的方法，所述方法包括步骤：(a) 在温度！\进行纯化蒸馏；(b)在温度T 2进行变性蒸馏；其中步骤（a)和（b)可以任一顺序 进行；!\和T 2足以使鲨烯沸腾；T 2>1\;且T 2彡20(TC。所述动物来源通常是鱼类来源，如鲨 鱼肝油（或其提取物），即本发明提供从鲨鱼肝油或从鲨鱼肝油提取物中制备鲨烯的方法。
[0008] 本发明还提供从含鲨烯组合物中制备鲨烯的方法，所述方法包括步骤（a)在温度 !\进行纯化蒸馏；(b)在温度T 2进行变性蒸馏；其中步骤（a)和（b)可以任一顺序进行；T1和T2足以使鲨烯沸腾；T 'HOtC ;且T2>200°C。有用的所述含鲨烯组合物可为鲨鱼肝油或 其提取物。
[0009] 本发明还提供重蒸馏含至少99 %鲨烯的组合物的方法，所述重蒸馏是在T2的温度 下进行的变性蒸馏；其中τ2> 200。该重蒸馏可将组合物中的含水量降低到如〈0. 01%。
[0010] 本发明的方法可用于生产适于药学应用的产品。具体地，本发明方法可用于生产 纯化的鲨烯，其不含可伤害人类的污染物、病原体、病毒、人类毒素或蛋白，尤其是蛋白小清 蛋白。
[0011] 本发明还提供制造水包油乳液的方法，包括用上述方法准备的鲨烯制备乳液。
[0012] 本发明还提供制备疫苗组合物的方法，包括如上所述制备乳液，并将所述乳液与 抗原混合。
[0013] 本发明还提供制备疫苗药盒的方法，包括如上所述制备乳液并将乳液与抗原组分 一起包装到药盒中作为药盒组分。
[0014] 本发明还提供根据本发明方法制备的鲨烯。
[0015] 本发明还提供含本发明所述方法制备的鲨烯的水包油乳液。
[0016] 本发明还提供含本发明所述方法制备的鲨烯的疫苗。
[0017] 本发明还提供本发明方法所述制备的鲨烯在疫苗中的应用。
[0018] 纯化蒸馏
[0019] 含鲨烯组合物可源自任何来源，如黑液皂化物撇渣；妥尔油皂；粗制妥尔油；妥尔 油树脂；甘蔗油；油和脂肪的提取、脱胶和精炼的残余物；脂肪酸和酯类的蒸馏残余物；植 物油的脱臭馏出物；橄榄油；大豆油；米糠油；鲨鱼肝油；牛脂；.咖啡油；鱼油；鳕鱼肝油； 麦胚芽油；玉米胚芽油；棕榈油；酸渣树油（andiroba oil);和番茄残余物的油。具体地，含 鲨烯的化合物可源自鲨鱼肝油。
[0020] 所述纯化蒸馏从含鲨烯组合物中移除杂质，产生纯化组合物。含鲨烯组合物通常 是液体。纯化蒸馏前，含鲨烯组合物可含有杂质如角鲨胺、烷基甘油、脂肪酸（如Ω-3-脂 肪酸）、维生素 A和D、姥鲛烷（pristine)、甘油三酸酯、甘油醚和脂肪醇。
[0021] 所述纯化蒸馏在温度T1进行，其中T 以使鲨烯沸腾，即T i可大于或等于鲨烯的 沸点。760mm Hg(即1个大气压）时鲨烯的沸点为429-430°C。
[0022] 液体的沸点表示该化合物液相的蒸气压等于作用于该液体表面上的外部压力的 温度。因此，鲨烯的沸点，也即T1的下限取决于施加于含鲨烯组合物的表面的外部压力。该 现象为本领域熟知，且技术人员能计算所用给定蒸馏压力下观察到的鲨烯沸点。或者，技术 人员能基于所需观察到的鲨烯沸点来计算所需的蒸馏压力。所述计算可用列线图进行。
[0023] 在一个实施方式中，所述纯化蒸馏可在至少70°C的温度进行，如至少75 °C或至少 80°C。在另一实施方式中，所述纯化蒸馏可在低于140°C的温度进行，如低于130°C、低于 120°C、低于110°C、低于100°C、低于95°C、低于90°C或低于85°C。
[0024] 在一个实施方式中，所述纯化蒸馏可在接近真空下进行。具体地，所述纯化蒸馏可 在至少0. 5 μ m Hg的压力下进行，如至少0. 75 μ m Hg或至少1 μ m Hg。所述纯化蒸馏可在 低于5 μπι Hg的压力下进行，如低于2. 5 μπι Hg或低于2 μπι Hg。
[0025] 本发明的其他实施方式包括上述引用的最小和最大温度以及最小和最大压力的 组合。
[0026] 所述纯化蒸馏可产生含至少95 %鲨烯的组合物，如至少96 %鲨烯、至少97 %鲨 烯、至少98 %鲨烯、至少99 %鲨烯、至少99. 5 %鲨烯、至少99. 8 %鲨烯、至少99. 9 %鲨烯或 甚至100%鲨烯。
[0027] 本文所引全部百分比是重量百分比且可用气相色谱（GC)测量。GC技术可通过 将溶于己烷的鲨烯样品注射到配有火焰离子检测器（FID)的气相色谱上来进行。分析可 在30m X 0.32mm X 0.50mm毛细管柱上进行，维持于200°C持续2分钟，然后以每分钟提高 12°C升到310°C，在此维持9分钟。注射孔和FID分别维持于300°C和320°C。鲨烯峰值的 鉴定用GC/MS(用质量选择检测器的气相色谱）建立。纯度报告为鲨烯峰面积占色谱中所 有峰面积之和的百分比。
[0028] 所述纯化蒸馏可在所述变性蒸馏之前进行，产生纯化的组合物。或者，所述纯化蒸 馏可在所述变性蒸馏之后进行，产生变性的纯化组合物。
[0029] 变性蒸馏
[0030] 鲨鱼和因而源自鲨鱼肝油的鲨烯可含有人类过敏的蛋白。人类可能过敏的常见鱼 蛋白是在鲨鱼中发现的小清蛋白。此外，污染蛋白或材料可在例如纯化蒸馏之后或作为鲨 烯的降解产物而被引入鲨烯组合物中。可能的污染蛋白或材料包括丙酮、乙醛、甲醛和水。 优选地，变性蒸馏步骤使含鲨烯组合物变性和/或从中移除蛋白，尤其是小清蛋白和任何 污染蛋白，从而提供变性的组合物。本发明方法的另一优点是变性蒸馏可保证含鲨烯组合 物中存在的任何潜在病毒失活和/或从纯化的组合物中移除。因此所述变性组合物用于人 类应用比非变性组合物安全。
[0031] 不希望被理论所限制，鲨烯的沸点取决于施加在含鲨烯组合物表面的外部压力。 然而，含鲨烯组合物中存在的任何蛋白会变性的温度通常独立于施加在含鲨烯组合物表面 的外部压力。因此，变性蒸馏可在特定温度下进行，而不考虑进行蒸馏的压力。具体地，所 述变性蒸馏可在T2的温度下进行，其中T2可大于或等于200°C，如大于或等于205°C、大于 或等于210°C、大于或等于215°C、大于或等于220°C、大于或等于230°C、大于或等于240°C、 大于或等于250°C、大于或等于260°C。
[0032] 所述变性蒸馏可在低于500 °C的温度下进行如低于480 °C、低于450 °C、低于 420°C、低于 400°C、低于 350°C或低于 300°C。
[0033] 变性蒸馏可在接近真空下进行。具体地，所述变性蒸馏可在至少0. 5mm Hg的压力 下进行，如至少0.6mm Hg、至少0.7mm Hg或至少0.8mm Hg。所述变性蒸馈可在低于5mm Hg 的压力下进行，如低于4mm Hg、低于3mm Hg、低于2mm Hg、低于1.5mm Hg、低于Imm Hg或低 于 0· 9mm Hg〇
[0034] 本发明的其他实施方式包括上述引用的最小和最大温度以及最小和最大压力的 组合。
[0035] 为了在该高温下进行变性蒸馏，优选使用将含鲨烯组合物与热表面接触的设备。 热表面可维持在如上所定义的温度T2，所述热表面周围的压力可为上述定义的压力以用于 变性蒸馏。所述热表面周围的压力可选择成确保观察到的鲨烯沸点是T2或更小。随着含鲨 烯组合物与所述热表面接触，在所述热表面周围压力下沸点低于T2的那些组合物成分（包 括鲨烯）会蒸发。未蒸发组分如蛋白保持在热表面上，且可变性并从鲨烯中分离。
[0036] 变性蒸馏前，含鲨烯组合物可包括85% -99. 9%的鲨烯，如95% -99. 5%的鲨烯、 95% -99. 5%的鲨烯或97% -99. 5%的鲨烯。
[0037] 所述变性蒸馏可产生具有较高鲨烯百分比的鲨烯组合物。具体地，所述变性蒸馏 可产生至少含95%鲨烯的变性组合物，如至少99%鲨烯、至少99. 5%鲨烯、至少99. 9%鲨 稀或甚至100%藍稀。
[0038] 变性蒸馏可产生含少于0. 5%蛋白的变性组合物，如少于0. 1 %蛋白、少于0. 01% 蛋白或〇%蛋白。因此，本发明提供含少于0.5%蛋白的鲨烯，如少于0. 1 %蛋白、少于 0. 01%蛋白或0%蛋白。
[0039] 在一个实施方式中，所述变性蒸馏可在所述纯化蒸馏之后进行，产生纯化的