[022引实施例6、式1-17所示化合物的体外抑制蛋白酪氨酸憐酸酶IB(PTP-IB)活性试验
[0229] 对硝基苯基憐酸二钢盐（pNP巧是碱性憐酸酶的可溶性底物，在蛋白酪氨酸憐酸 酶1B的催化下，它脱去一个憐酸根，生成黄色可溶产物对硝基苯酪，该产物在405nm处有 光吸收，W阳性药物抓酸钢为对照，加入系列浓度的提取物，利用酶标仪检测405皿处光吸 收的降低可W检测该化合物对蛋白酪氨酸憐酸酶1B活性的抑制。buffer为抑8.0,50mM Tris, 150mM氯化钢。
[0230] 实施例3所述的17个化合物，准确称取各化合物，用DMS0配制成20mM，供活性 测试（终浓度分别为25. 0yM、12. 5yM、6. 3yM、3. 1yM、1. 6yM、0. 8yM，配制时溶于少量 DMSO后，用蒸馈水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积分数<0. 1% );阿伐他下作为阳 性对照（终浓度分别为4000yM、1000yM、250yM、62. 5yM，配制时溶于少量DMS0后，用蒸 馈水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积分数<0. 1% )。
[0231] 实验步骤：在96孔板中依次加入W下试剂，不同组别的配比如下：
[0232] 测试组：50ul化合物溶液巧Oul浓度170ug/ml的PTP-1B溶液
[0233] 阳性对照组：50ul抓酸钢溶液巧Oul浓度170ug/ml的PTP-1B溶液
[0234]空白组：50ul buffer+50ul浓度170ug/ml的PTP-1B溶液
[0235] 背景组：50ul化合物溶液+100U1buffer
[0236] 将加完试剂的96孔板在室溫放置lOmin使化合物和酶充分反应，之后加入 SOullmMpNPP溶液作为底物，在37°C恒溫箱中反应30分钟，在每孔加入50ul 3M化0H终 止反应，测定各孔在405nm的光密度。
[0237]对实验数据统计分析，计算各供试样品的ICw值结果如表9所示。可见，所示化合 物均有一定的PTP-1B酶抑制活性，可W制备蛋白酪氨酸憐酸酶1B抑制剂，用于治疗和/或 预防II型糖尿病。
[0238] 表9式1-17所示化合物的PTP-1B酶抑制活性检测结果
[0239]
[0241] 实施例7、式1-17所示化合物对喂食高脂饲料大鼠的血脂影响
[0242] 材料：被测样品溶液为实施例3所述的17个化合物（式1-17)。准确称取各样品， 用0. 5%CMC-Na配制成lOmg/ml溶液，供活性测试。大鼠购自北京维通利华实验动物技术 有限公司，溫度20-24摄氏度，恒湿50-60%，光照12小时（8:00-20:00)，隔音，自由摄食、 饮水，适应环境一周后进行实验。血清总胆固醇TC试剂盒（批号20131112)，低密度脂蛋 白LDkC试剂盒（批号20140114)，高密度脂蛋白皿心(：试剂盒（批号20140413)，甘油S 醋TG试剂盒（批号20131226)，超氧化物歧化酶SOD试剂盒（批号20140213)，谷草转氨酶 AST试剂盒（批号20131006)购自南京建成生物工程研究所。
[0243] 方法：取雄性健康SD大鼠，200±20g，大鼠适应性饲养一周后进行实验，随机分为 19组，每组8只。对照组给予普通饲料，其他组给予高脂饲料（高脂饲料为普通饲料中加入 1%胆固醇、0.2%猪胆盐、10%猪油、10%蛋黄粉）。饲养3周后，各组大鼠分别灌胃给与1ml 的lOmg/ml提取物溶液（相当于50mg/kg)，连续10天，对照组和模型组给予等量的生理盐 水。末次给药后，取血，4摄氏度3000巧m离屯、，测定血清总胆固醇TC，低密度脂蛋白LDkC， 甘油S醋TG。
[0244] 结果：与对照组和模型组比较，运些化合物可W显著改善大鼠血脂情况，对大鼠血 清ALT也有很好的逆转作用，提示可W保护高血脂造成的肝损伤和脂肪肝，推测是通过提 高机体SOD酶来实现的，结果见表10。
[0245] 表10式1-17所示化合物对喂食高脂饲料大鼠的血脂影响
[0246]
[024引实施例8、式1-17所示化合物对正常小鼠血糖的活性研究[0249] 材料：被测样品溶液为实施例3所述的17个化合物（1-17)。准确称取各样品，用 0. 5%CMC-Na配制成配制lOmg/ml溶液，供活性测试。SPF小鼠购自北京维通利华实验动物 技术有限公司，溫度20-24摄氏度，恒湿50-60%，光照12小时（8:00-20:00)，隔音，自由摄 食、饮水，适应环境一周后进行实验。血糖测定试剂盒（批号20140403)购自南京建成生物 工程研究所。
[0巧0] 方法：取雄性SPF级昆明种小鼠，20±2g，适应性饲养一周后进行实验，随机分为 18组，每组12只。各组分别灌胃给与0. 1ml的lOmg/ml提取物溶液（相当于50mg/kg)，连 续10天，对照组给予等量的生理盐水。末次给药后禁食10小时，眼眶取血，按血糖测定试 剂盒操作测定血糖。
[0巧1] 结果：与对照组比较，17个化合物组小鼠的血糖值没有统计学差异，说明运17个 化合物对正常小鼠血糖没有影响，见表11。
[0巧2] 表11式1-17所示化合物的对正常小鼠血糖的影响
[0巧3]
[0巧4]
[0巧5] 实施例9、式1-17所示化合物对四氧喀晚性高血糖小鼠血糖的活性研究
[0巧6] 材料：被测样品溶液为实施例3所述的17个化合物（1-17)。准确称取各样品，用 0. 5%CMC-Na配制lOmg/ml溶液，供活性测试。SPF小鼠购自北京维通利华实验动物技术有 限公司，溫度20-24摄氏度，恒湿50-60 %，光照12小时（8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮 水，适应环境一周后进行实验。血糖测定试剂盒（批号20140403)购自南京建成生物工程 研究所。
[0巧7] 方法：取250只雄性SPF级昆明种小鼠，20 ± 2g，适应性饲养一周后进行实验。随机 取出10只作为对照组，其他240只按照体重220mg/kg腹腔注射四氧喀晚造模，72小时后， 眼眶取血测定血糖，选择血糖在8. 8-20mmol/L的小鼠进行后续试验。本实验中入选的小鼠 有172只，按血糖水平随机分为模型组和给药组。各给药组分别灌胃给与0. 1ml的lOmg/ml 提取物溶液（相当于50mg/kg)，连续10天，对照组和模型组给予等量的生理盐水。末次给 药后禁食10小时，眼眶取血，按血糖测定试剂盒操作测定血糖。
[025引结果：表12可W看出，给药前除正常对照组外，其他小鼠血糖值大幅上升，提示四 氧喀晚造模成功。给药后，各组均有所降低，说明对苯二酪法尼基类化合物能够显著降低高 血糖小鼠的血糖值，可用于治疗糖尿病和糖尿病并发症。
[0巧9] 表12式1-17所示化合物对四氧喀晚性高血糖小鼠血糖的影响[0260]
[0261] 实施例10、式3和式4所示化合物对高血糖小鼠KKAy血糖
[0262] 材料：被测样品溶液为实施例2所述的化合物3和化合物4。准确称取化合物3和 4,用0. 5%CMC-Na配制5mg/ml溶液，供活性测试。KKAy小鼠购自中国医学科学院北京协 和医学院动物研究所，溫度20-24摄氏度，恒湿50-60%，光照12小时（8:00-20:00)，隔音， 自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。血糖仪为德国罗氏公司产品。
[0263] 方法：雄性C57小鼠6-8周，体重20-22g，10只，作为正常对照组（1)，雄性KKAy小 鼠6-8周，体重28-32g，测定空腹血糖，依据血糖值和体重情况平均分组：（2)模型对照组， (3)化合物3给药Img/kg，（4)化合物3给药5mg/kg(5)化合物3给药lOmg/kg，（6)化合 物3给药20mg/kg，（7)化合物4给药Img/kg，（8)化合物4给药5mg/kg(9)化合物4给药 lOmg/kg，（10)化合物 4 给药 20mg/kg，（11)二甲双脈 8g/kg; (12)化合物 32. 5mg/kg+ 二甲 双脈4g/kg(13)化合物35mg/kg+二甲双脈4g/kg，（14)化合物42. 5mg/kg+二甲双脈4g/ kg(15)化合物45mg/kg+二甲双脈4g/kg，每组8只，连续给药3周。模型对照组给予等量 的 0. 5%CMC-Na。
[0264] 二甲双脈是目前临床上首选的降糖药物，主要通过降低肝糖输出，减少肠道对糖 的吸收，增加外周血糖的摄取和利用，达到提高膜岛素的敏感性的作用，但二甲双脈对肝、 肾都具有损伤作用；而本发明的化合物3在实施例5中可W看到，对PTP1-B具有较强的抑 制作用而引起的膜岛素增敏，因此我们考虑将两种药物合用，提高膜岛素增敏作用，另外还 能保护肝、肾等不受损伤。
[0265] 测定指标：1)药物对血糖的影响：给3药第1天：动物禁食2小时后取血（0时）， 测空腹血糖值，灌胃给予化合物，给药后30min尾尖取血测血糖值。
[026引。对体重和血糖的影响：给药第2天、5天、8天、11天、14天、17天、20天称量体 重并记录，给药后尾尖取血测血糖值（见表13)。
[0267] 3)葡萄糖耐量实验（0GTT):给药第12天测葡萄糖耐量：动物禁食12小时取血（0 时）给药，给药并口服葡萄糖（2.Og/kg)，分别30,60,120分钟尾尖取血测血糖值（见表 14) 〇
[0268] 4)末次给药后，麻醉处死，取血，4摄氏度3000rpm离屯、，测定血清总胆固醇TC，低 密度脂蛋白LDkC，甘油S醋TG。
[0269] 5)末次给药后，取肝脏，并于福尔马林中固定，组织切片观察。
[0270] 实验结果表明式3和式4所示化合物对高血糖小鼠的血糖有显著作用，对体重影 响不大，对于糖负荷小鼠也有显著降低作用（表13和表14)。与二甲双脈联用后，效果更 为显著，且可W对二甲双脈的肝损伤有报告作用，可W用于制备治疗II型糖尿病的药物或 与二甲双脈合用治疗II型糖尿病或在治疗过程中/后起辅助作用。
[0271] 表13式3和式4所示化合物对高血糖小鼠KKAy血糖的影响
[0272]
[0274] 表14式3和式4所示化合物对高血糖小鼠KKAy糖耐量的影响
[0275]
[0276]
[0277] 与对照组和模型组比较，运些化合物可W显著改善大鼠血脂情况，对大鼠血清ALT 也有很好的逆转作用，提示可W保护高血脂造成的肝损伤，推测是通过提高机体SOD酶来 实现的，结果见表15。
[027引表15式3和式4所示化合物对高血糖小鼠KKAy的血脂和肝功能影响[0279]
[0280] 图1显示，结合解剖时对肝脏大体的肉眼观察和组织病理切片的肥染色发现，模 型组小鼠肝细胞内均有大量大小不等的脂肪空泡，形成脂肪肝。而化合物3和化合物4组 小鼠肝细胞内的脂肪空泡基本消失，结果表明化合物3和4的不同剂量组均可W有效治疗 由于糖尿病并发的非酒精性脂肪肝症状。
[0281] 实施例11、式3和式4所示化合物对非酒精性脂肪肝的影响
[0282] 材料：准确称取实施例2所制备的式3和式4所示的两个化合物，用0. 5%CMC-Na 配制5mg/ml溶液，供活性测试。雄性SPF级Wister大鼠60只，体重180-220g，购自维通利 华实验动物中屯、。溫度20-24摄氏度，恒湿50-60%，光照12小时（8:00-20:00)，隔音，自 由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。血清总胆固醇TC试剂盒（批号20131112)，低密 度脂蛋白LDkC试剂盒（批号20140114)，高密度脂蛋白皿心(：试剂盒（批号20140413)， 甘油S醋TG试剂盒（批号20131226)，谷草转氨酶ALT试剂盒（批号20131006)购自南京 建成生物工程研究所。
[028引方法：雄性SPF级Wister大鼠随机分组：（1)正常组似模型对照组做式3所 示化合物给药lOmg/kg，（4)式3所示化合物给药20mg/kg(5)式4所示化合物给药lOmg/ kg，（6)式4所示化合物给药20mg/kg每组10只。正常组大鼠标准饲料喂养，其余组大鼠 每天喂食胆碱缺乏饲料（高脂饲料），检测大鼠摄食量及体重。胆碱缺乏饲料喂养会诱发肝 脏细胞变性、肝炎及肝损伤，同时血脂水平升高并诱发膜岛素抵抗，是常用的晒齿类动物脂 肪肝的造模方法。
[0284] 高脂饮食喂养8周后，给药组开始给药，连续给药4周。正常组和模型对照组给予 等量的0. 5 %CMC-Na。给药四周后，麻醉处死大鼠，取肝组织和血。
[0285] 测定指标：1)肝脏指数。
[0286] 2)测定血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及甘油=醋含量。
[0287] 3)巧憶谷丙转氨酶含量。
[028引4)肝脏组织切片：末次给药后，麻醉处死，冰上取肝脏，并迅速放入福尔马林中固 定，准备组织切片。
[0289] 实验结果，与正常对照组比较，模型组肝指数显著升高，给予化合物3和4后能显 著降低脂肪肝大鼠的肝指数。同时模型组的TC、LDkC、TG均显著升高，皿心(：显著降低，提 示本模型造成明显的血脂素乱，与模型组相比，给予化合物3和4后可降低非酒精性脂肪肝 大鼠的血脂，同时还能改善肝功能，降低血浆