0nM)之外，每个测定 包括特定浓度（浓度为〇. 007-10nM)下的配体，在4°C -37°C下的温育周期为15分钟到6 小时。特异性结合受体被定义为总结合和非特异性结合之间的差，在过量的未标记的CFMQ 的存在下确定。分别确定导致对照特异性结合的半最大抑制的浓度（IC 5。值）和抑制常数 0Q，并且每个参照化合物在历史平均值的所接受的限值内（±0. 5对数单位）。
[0249] 发现CFMQ结合少量的脱靶（非缓激肽2)受体（IC5。值小于10 y M)(表4)。其中 脱靶受体被结合的水平比影响功效所需的浓度高十倍。CFMQ (HGT3711)显示在其结合B2-缓 激肽受体方面是选择性的，并具有对B2-缓激肽受体的强结合亲和力。
[0250] 表4彡50 %的受体被10 y M的CFMQ抑制
[0251]
[0252] 在竞争测定中，用温育缓冲液（含有2nM[3H]缓激肽）配制CFMQ，并制成0? 001、 0? 003、0. 01、0. 03、0. 1、0. 3、L 0和3. OyM的浓度。为了确定非特异性结合，将1. 25yL的 10禮缓激肽邮）溶液加入到248.8 1^温育缓冲液（含2恤[3扣81()中。为了确定总结合， 不加入CFMQ。以相同的方法制备适当的对照。
[0253] 人类胚胎肾（HEK) 293细胞稳定地表达重组人类B2-缓激肽受体（10pm〇l/mg蛋白 质）并加入到96孔培养托盘中并培养1-3天，随后采用100 y L的含[3H]BK缓激肽的各种 温育缓冲液温育。经过90分钟温育时间和洗涤（4XPBS (磷酸盐缓冲盐水））之后，将细胞 混合物的上清液转移至闪烁小瓶中并测定以计数计的[3h]bk。将对于非特异性结合的 每分钟（cpm)的计数结果从总cpm中减去并被用于曲线拟合和IC5。计算。
[0254] 结果表明CFMQ(HGT3711)结合并竞争远离缓激肽（IC5。为3. 3nM)。参照化合物 Firazyrw (艾替班特）表现出类似的针对B2-缓激肽受体的亲和力（IC5。为2nM)。
[0255] 这些研究的结果表明CFMQ (HGT3711)具有对B2-缓激肽受体的选择性和强结合亲 和力。
[0256] 钙动员测宙
[0257] CFMQ对钙动员（B2-缓激肽受体结合的标志）的抑制的活性的特点在于细胞测 定。CFMQ被配制成在100% DMS0中的5nM储备溶液并依次稀释至0. 04、0. 12、0. 37、1. 11、 3. 33、10和30nM。使表达人类B2R的人类成纤维（HF15)细胞装载有含2. 5mM丙磺舒 (probenicide)的100 y L的钙染料溶液且然后与CFMQ -起在25°C预温育25分钟。CFMQ 对缓激肽介导的钙动员的抑制效应在这个系统中通过发射荧光信号进行测试，使用所得峰 值超过基线值的高度（相对荧光单位[RFU]最大值-最小值）。对于每个浓度的百分数抑 制用于曲线拟合和IC 5。计算。
[0258] 发现CFMQ对人类B2-缓激肽受体具有强效力，其中它抑制具有2. 97nM的IC5。的 缓激肽诱导的钙动员。在先前的研究中，参照化合物Firazyr_?i (艾替班特）表现出4. OnM 的IC5。。（数据未示出）。
[0259] 脐静脉收缩测宙
[0260] 在人类脐静脉收缩的离体功能性测定中检查CFMQ对缓激肽诱导钙动员的抑制效 应，其被认为是缓激肽活性测量的黄金标准。人类脐带制备包括对照条件（无缓激肽激动 剂）、在10、30、100和300nM浓度下的CFMQ和参照已知的B2R拮抗剂（艾替班特；Firazyr輕 )的阳性对照组。在温育30分钟之后，以累积方式（10 iiM的最终浓度）开始BK-诱导的静 脉收缩，然后是通过10yM 5-羟色胺的最大校准收缩诱导。相对于对5-羟色胺的（最大） 响应计算对于每个剂量响应的张力增加，绘制成剂量-响应曲线，并用于计算在50% (EC5。） 值下的有效浓度（图6)。
[0261] 在此功能性脐静脉测定中，对于CFMQ7. 3nM的EC5。（图6)被发现与具有2. 5nM的 EC5。的Firazyr? (艾替班特）是相当的。
[0262] 滲诱率
[0263] 为了确定双向渗透率，在采用人类小肠黏膜（Caco-2细胞）的体外温育测定中检 查CFMQ。将5 yM CFMQ给药至顶面上（A至B)或基底外侧面（B至A)上的细胞单层并在 37°C下采用5% C02温育120分钟。测量荧光黄（500 yM)的渗透率，以确保在CFMQ流通期 间没有对细胞单层造成损伤。所有样品通过使用电喷雾离子化的LC-MS/MS进行测定。
[0264]结果是分别为34至38cm/s的渗透率系数（A至B ;B至A)，这被认为是高度可渗 透的，在Caco-2细胞并无显著性外流。没有预料到人类中的这种吸收是渗透率有限的，并 且是关于口服施用分子的快速吸收和作用生效时间的有利预测因子。
[0265] 实施例33小鼠、大鼠、犬、猴和微尤卡坦小铟猪中的CFMQ的药代动力学
[0266] 小鼠中的吸收
[0267] 通过以喷雾干燥的分散体制剂（下面讨论）的5mL/kg的剂量体积的100、250和 450mg/kg的单次口服管饲将CFMQ(HGT3711)施用至禁食的雌性⑶-1小鼠（n = 18/剂量 组）。在施用之前以及在给药之后10、30、60(1小时）、120(2小时）、240(4小时）和480(8 小时）分钟时经由心脏穿刺或腹部静脉采取血样。通过LC-MS/MS(液相色谱质谱）确定 CFMQ(HGT3711)的血浆浓度，并将低于定量限（3ng/mL)的浓度指定药代动力学分析的零 值。在所有的计算中使用标称给药浓度。
[0268] 图7举例说明了在每个剂量水平的时间浓度曲线，且表5总结了在小鼠中口服施 用之后的CFMQ(HGT3711)的血浆浓度（ng/mL)和PK(药代动力学）性质。
[0269] 表5在⑶-1小鼠中的IV施用之后的CFMQ(HGT3711)的平均血浆浓度（ng/mL)和 PK性质
[0270]
[0271] ND :未被确定的；1外推至t = 0 ;*n =每个时间点2只动物
[0272] 在CFMQ(HGT3711)的口服施用之后，在小鼠的暴露曲线图中存在剂量成比例的增 加。吸收随在或接近第一时间点采集的最大血浆浓度的值的时间（Tgf)是迅速的。当剂量 变得越来越大时，看到峰值血清浓度（Cgt)压缩，然而暴露（浓度曲线下方的面积；AUO 持续按比例地增加。这可以反映在此制剂的高于250mg/kg的剂量下的吸收速率的最大值。
[0273] 大鼠中的吸收
[0274] 在2种不同类型的大鼠模型中采用CFMQ(HGT3711)的2种不同制剂评估药代动力 学和性别差异。在单次口服管饲研究中调查了这些属性。雄性和雌性Wistar大鼠（n = 3/ 剂量组）接受15、7575、和或15〇11^/1^的0?]^〇?13711)。雄性3?抑8116-〇3￥167(5-〇)大 鼠（n = 3/剂量组）接受75mg/kg的单次剂量。评估的两种媒介物制剂分别为制剂1 :10% N-甲基吡咯烷酮（NMP) :10%乙醇：30%聚乙二醇（PEG400) :50%GELUCIRE(月桂酰聚氧甘 油酯）；和制剂2 :10% NMP :0% PEG400 :20% CREM0PH0R EL(聚乙二醇甘油蓖麻醇酸酯）： 25% GELUCIRE 44/14(月桂酰聚氧甘油酯）：25% CAPR0Y0L 90(聚丙二醇辛酸酯）。
[0275] 在施用之前和给药后0? 25(15分钟）、0? 50(30分钟）、1、2、4、8和24小时时经由 心脏穿刺采取血样。CFMQ (HGT3711)的血浆浓度通过LC-MS/MS确定且标称给药浓度用于所 有计算中。
[0276] 在本研究中，在任何大鼠都没有观察到不良反应。图8示出了在每个物种的两个 性别中的两种制剂的时间-浓度曲线。
[0277] 基于平均剂量，相比于两个物种的雄性大鼠，雌性大鼠中的归一化的AUC值和类 似的剂量浓度、对CFMQ(HGT3711)的口服暴露的高20-40倍（表6)。在S-D和Wistar大 鼠中观察到这种性别差异。在Wistar大鼠的两种剂量制剂中，平均AUC值随剂量增加而减 少，这表明CFMQ(HGT3711)暴露并不是与剂量成比例的；然而，这很可能是由于该分子在较 高浓度下的沉淀引起。
[0278] 表6在雄性和雌性Wistar和Sprague Dawley大鼠中口服施用2种制剂之后的 CFMQ(HGT3711)的平均药代动力学性质
[0279]
[0281] 在两种制剂中，CFMQ(HGT3711)在两个性别之间展示出大的暴露差异，其中相比于 雄性，雌性呈现出暴露的大于5倍的增加。在研究中使用的媒介物制剂是复合有50%的醋 酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯（HPMCAS)的CFMQ(HGT3711)的喷雾干燥的分散体制剂（下 面讨论）。
[0282] 微尤卡坦小铟猪中的吸收
[0283] 以5. Omg/mL的剂量体积通过10mg/kg (浓度2mg/mL)的单次口服管饲 将CFMQ(HGT3711)施用到雌性尤卡坦小型猪（迷你猪；n = 3)。这项研究利用了 CFMQ(HGT3711)的喷雾干燥的分散体（SDD) (50:50的聚合物：HPMCAS)制剂（参见下文）。 施用之前和给药后〇? 083 (5分钟）、0? 25 (15分钟）、0? 50 (30分钟）、1、2、4、8、12和24小时 时经由颈静脉或其他适合的静脉穿刺采取血样。通过LC-MS/MS确定CFMQ(HGT3711)的血 浆浓度。
[0284] 在本研究过程期间，还没有涉及死亡率/患病率的测试样品并且没有注意到异常 的临床观察。
[0285] 平均血浆浓度时间曲线示于图9中并且CFMQ(HGT3711)的药代动力学性质和血浆 浓度总结于表7中。
[0286] 表7在雌性尤卡坦迷你猪中的10mg/kg的P0施用之后的CFMQ(HGT3711)的平均 血浆浓度（ng/mL)和PK曲线
[0287]
[0288] 在迷你猪中的口服施用之后，CFMQ(HGT3711)的平均血浆水平具有57小时的半衰 期和11115小时? ng/mL的推算的AUC。
[0289] 在小鼠中的静脉内暴露之后的血浆动力学
[0290] 通过1.Omg/kg的单次静脉内注射（在100% PEG200中配制的）将CFMQ(HGT3711) 施用到禁食的雌性⑶-1小鼠。在施用之前和给药后0. 083 (5分钟）、0. 25 (15分 钟）、0. 50(30分钟）、1、2、4和8小时时经由心脏穿刺采取血样。通过LC-MS/MS确定 CFMQ(HGT3711)的血浆浓度且低于定量限的浓度（BLOQ =〈lng/ml)被指定为药代动力学分 析的零值。标称给药浓度用于所有的计算中。
[0291] 在IV(静脉内）施用CFMQ(HGT3711)之后，没有观察到不良反应。表8总结了在小 鼠中的CFMQ的平均血浆浓度以及计算的药代动力学性质。在给药4小时后，CFMQ (HGT3711) 血浆浓度低于BL0Q。
[0292] 表8在雌性⑶-1小鼠中的lmg/kg的IV施用之后的CFMQ (HGT3711)的平均血浆 浓度（ng/mL)和PK性质
[0293]
[0294] ND :未被确定的；1外推至t = 0。
[0295] 在IV施用之后，CFMQ(HGT3711)的平均血浆水平具有0. 56小时的半衰期（t1/2)和 14. 1L/小时/kg的清除（CL)速率，这大于典型小鼠中的肝血流（5. 40L/小时/kg)。（Davies 和Morris,Physiological parameters in laboratory animals and humans'Tharm Res， 1993年7月；10(7) :1093-5。）分布的平均体积（Vss)为6. 3L/kg，这大于小鼠中的总水平 (0? 73L/kg)。这表明CFMQ(HGT3711)广泛分布于小鼠中。
[0296] 在大鼠中的静脉内暴露之后的血浆动力学
[0297] 通过1. 0mg/kg的单次静脉内注射（在100% PEG200中配制的）将CFMQ(HGT3711) 施用到禁食的雌性Sprague-Dawley小鼠（表2. 6. 5. X，研究10SHIRUSP11)。在施用之前和 给药后〇? 083 (5分钟）、0? 25 (15分钟）、0? 50 (30分钟）、1、2、4和8小时时经由颈静脉插管 采取血样。通过LC-MS/MS确定CFMQ(HGT3711)的血浆浓度且低于定量限的浓度（lng/mL) 被指定为药代动力学分析的零值。标称给药浓度用于所有的计算中。
[0298] 在静脉内施用CFMQ(HGT3711)之后，没有观察到不良反应。表9总结了在大鼠中 的CFMQ的平均血浆浓度以及计算的药代动力学性质。
[0299] 表9在雌性Sprague-Dawley大鼠中的lmg/kg的IV施用之后的CFMQ(HGT3711) 的平均血浆浓度（ng/mL)和PK性质
[0300]
[0302] 在大鼠中的IV施用之后，CFMQ(HGT3711)的平均血浆水平具有2. 86±2. 54小时 的半衰期和〇. 95±0. 68L/小时/kg的清除速率，这是大鼠中的肝血流（3. 3L/小时/kg) (Davies和Morris，1993)的约30%。分布的平均体积为2. 6± 1. lL/kg，这大于大鼠中的全 身水（0. 7L/kg) (Davies和Morris，1993)。这表明CFMQ广泛分布于大鼠中。
[0303] 在犬中的静脉内暴露之后的血浆动力学
[0304] 通过1. 0mg/kg的单次静脉内注射（在100% PEG200中配制）将CFMQ(HGT3711) 施用到禁食的雌性比格犬（表10)。在施用之前和给药后0.083(5分钟）、0. 25(15分 钟）、0. 50 (30分钟）、1、4、8和24小时经由颈静脉穿刺采取血样。通过LC-MS/MS确定 CFMQ(HGT3711)的血浆浓度且低于定量限（1.0ng/mL)的浓度被指定为药代动力学分析的 零值。标称给药浓度用于所有的计算中。
[0305] 表10在雌性比格犬中的lmg/kg的IV施用之后的CFMQ (HGT3711)的平均血浆浓 度（ng/mL)和药代动力学性质
[0306]
[0307] ND :未被确定的；1外推至t=0。
[0308] 在犬中的IV施用之后，CFMQ(HGT3711)的平均血浆水平具有2. 69小时的半衰期 和0.25L/小时/kg的清除速率，这是犬中的肝血流（1.85L/小时/kg)的约14% (Davies 和Morris，1993)。分布的平均体积为0.75L/kg，这与犬中的全身水（0.6L/kg) (Davies和 Morris，1993)类似。这表明CFMQ未广泛分布于犬中。
[0309] 在猴中的静脉内暴露之后的血浆动力学
[0310] 交叉PK(药代动力学）分析在食蟹猴进行。两只禁食的雄性猴在每个剂量组中通 过IV(静脉内）或P0(口服）施用接受CFMQ(HGT3711)的单次l.Omg/kg剂量，每个剂量之 间有7天的清除期。剂量浓度是为1. OmL/kg，剂量体积为1. Omg/mL。在给药后0, 083 (5分 钟）、0. 25(15分钟）、0. 5(30分钟）、1、1. 5、2、3、4、6、8、18和24小时时经由股静脉采取血 样。通过LC-MS/MS确定CFMQ(HGT3711)的血浆浓度且低于定量限（2. 5ng/mL)的浓度被指 定为药代动力学分析的零值。在口服施用CFMQ(lmg/kg)之后，在每个取样时间点CFMQ在 血浆中的浓度低于定量限（BLQ =〈2. 5ng/ml)，防止在本研究中于猴中的口服施用之后的 CFMQ的药代动力学性质的评估。表11总结了对于IV和P0给药组的平均PK性质。
[0311] 表11在IV和口服施用之后在雄性食蟹猴中的CFMQ(HGT3711)的所选药代动力学 性质
[0312]
[0313] N/A=不适用的
[0314] N/C =未计算的；在所有时间点样品的HGT3711的血浆浓度低于检测的限值
[0315] 在猴中的IV(静脉内）施用之后，CFMQ(HGT3711)的平均血浆水平展示出 1. 51 ± 0. 41L/小时/kg的全身清除率（CL)，这相当于猴肝脏血流（2. 62L/小时/kg) 的57.63 %伽"68和11(^18 1993)。平均半衰期匕/2)、（：最大和41](：〇]")的值分别为 1. 40±0. 24 小时、410±107. 14y g/L 和 693. 99±151. 48 小时? y g/L。静脉内施用的 CFMQ 广泛分布在猴的组织中，具有2. 98±0. 55L/kg的在终末期的分布的平均体积（Vz)，这相当 于猴中的全身水（CL69L/kg)的 4. 32 倍。（Davies 和 Morris 1993)
[0316] 在静脉内注射之后，在2号和4号猴中观察到延迟的Tgp这可能是由于采用50% PEG200 (其具有延缓响应效果）所致的，并且可以使溶液变粘，限制了注射部位处的溶液并 减缓了血液传播。
[0317] 在lmg/kg的CFMQ(HGT3711)的口服施用之后，在猴中不存在生物利用度，原因 是CFMQ的血浆浓度均低于定量限（BLQ)。然而，在测试的所有其他物种中观察到口服给药 CFMQ之后的生物利用度。
[0318] 基于体外代谢跨物种的研究，猴中的暴露不足可能是由于低代谢稳定性和/或预 计不存在于其他物种中的灵长类动物（包括人类）中的独特的清除或运输机制。当通过静 脉内途径将CFMQ给药到猴子时，它展示出中到高的清除值，这可能表示生物利用度的缺乏 可能部分地因缺乏吸收引起。低吸收可以是与肝或肠中的限制CFMQ在猴中的全身暴露的 转运蛋白相互作用的结果。
[0319] 歷
[0320] 探讨了肝微粒体和原代肝细胞中的CFMQ的代谢途径（HGT3711)，以及体内的迷你 猪生物分布的研究。
[0321] 体外代谢研究
[0322] 在⑶-1小鼠、Sprague-Dawley大鼠、尤卡坦迷你猪和人类肝细胞中实施体外代谢 物鉴定。通过与合成的参照标准品进行比较来确认观察到的代谢物。
[0323] 实施体外代谢稳定性研究，以确定体内肝稳定性。在来自小鼠、大鼠、犬、迷你猪和 人类的肝微粒体制剂、以及关于猴和人类的另外的研究中温育CFMQ。采用0. 3mg/mL