菌体抗体、双体、三体、四体、多肽（含有至少一个 足以使得特异性抗原结合于该多肽的免疫球蛋白片段）等。上述片段可经合成、或酶法、或 通过对完整免疫球蛋白的化学剪切而制备，或通过重组DNA技术的基因工程而得。其生产 的方法在本领域中众所周知。
[0108] 如本文所用，术语"药学上可接受的赋形剂"指的是任何惰性物质，其与活性分子 (例如药物、试剂、或结合分子）组合用于制备适用的或便捷的剂型。所述药学上可接受的 赋形剂是一种在所用剂量和浓度下对受者无毒的赋形剂，其能与制剂的其它成分（包括药 物、试剂或结合分子）相容。
[0109] 如本文所用，术语"治疗有效量"指的是可有效预防或治疗由甲型流感病毒引起的 情况的结合分子用量。
[0110] 含有本发明结合分子的组合物可被制成口服剂型，包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊 剂、混悬剂、乳剂、糖浆和喷雾剂，也可制成外用制剂、栓剂、无菌注射溶液、注射器预装溶液 或冻干制剂。具体地，本发明组合物可与常用稀释剂或赋形剂，例如填充剂、扩充剂、粘结 剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制成制剂。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、 颗粒剂、胶囊剂等，且所述固体制剂除了所述组合物以外还含有，至少一种赋形剂，例如，淀 粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶。除了简单的赋形剂以外，还可采用如硬脂酸镁或滑石粉等润 滑剂。口服施用的液体制剂还可包括混悬剂、溶液、乳剂和糖浆，且除了水和液体石蜡这种 常用的简单的稀释剂以外，还可含有多种赋形剂，例如润湿剂、调味剂、芳香剂和防腐剂。胃 肠外施用的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂以及栓剂。可采用 丙二醇、聚乙二醇、植物油（例如橄榄油）、可注射酯类（如油酸乙酯）等作为非水性溶剂 或悬浮剂。可采用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油、月桂酯、甘油明胶等作为栓剂的基 质。
[0111] 优选对用于本发明的诊断组合物的结合分子进行可检测标记。生物分子标记 可采用多种本领域技术人员熟知的技术，应理解其落在本发明范围内。这些技术有，例 如，Ti jssen所述"酶联免疫测定操作与理论"（Practice and theory of enzyme immuno assays)，Burden, RH 和 von Knippenburg (Eds)，卷 15 (1985)"分子生物学基础方法"(Basic methods in molecular biology), Davis LG, Dibmer MD ；Battey Elsevier(1990), Mayer 等，（Eds) "细胞及分子生物学中的免疫化学方法"(Immunochemical methods in cell and molecular biology)，学术出版社，伦敦（Academic Press, London (1987))，"酶学方法"，学 术出版社公司（Academic Press, Inc)。
[0112] 本领域普通技术人员熟知的不同标记和标记方法有很多。常用的标记还包括，荧 光染料（例如荧光黄、若丹明、德州红等），酶（如辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、碱性磷 酸酶）、放射性同位素（如32P或125I)，生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物性发光化合物 (例如二氧杂环丁烷、发光氨或吖啶黄）。标记方法，例如将酶或生物素基团进行共价连接、 碘化反应、磷酸化作用、生物素酰化等，均为现有技术熟知。
[0113] 检测方法包括（但不限于）：放射自显影技术、荧光显微镜、直接或间接酶反应等。 常用的检测试验包括放射性同位素或非放射性同位素法。其还尤其包括：RIA(放射性同 位素试验）和IRMA (免疫放射性免疫试验）、EIA (酶免疫试验）、ELISA (酶联免疫试验）、 FIA (荧光免疫试验）和CLIA (化学发光免疫试验）。
[0114] 本发明抗体还可用于抗体-药物偶联物的形式。由于给予未偶联的药物会导致无 法接受程度的对正常细胞的毒性，利用抗体-药物偶联物（ADC)(例如免疫偶联物）进行局 部药物递送，能够使药物祀向递送至感染细胞。通过提高多克隆和单克隆抗体（mAB)的选 择性以及药物连接和药物释放特性，能够使ADC达到最大的效应以及最小的毒性。
[0115] 将药物部分附着于抗体的常用方法（例如通过共价键连接）通常形成分子的非均 质混合物，其中药物部分附着于抗体的多个位点。例如，通常将细胞毒性药物通过抗体上常 见的赖氨酸残基与抗体偶联，从而形成抗体-药物非均质偶联混合物。基于反应条件，所述 非均质混合物通常含有附着于药物部分的约〇到约8或更多个抗体的分布。此外，具有特 定整数比（药物部分和抗体）的偶联物的各亚组可能是非均质混合物，其中药物部分附着 于抗体的不同位点。抗体为较大的、复杂且结构多异的生物分子，常具有多个反应性功能基 团。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如PH、浓度、盐浓度和共溶剂等因 素。
[0116] 在本发明中，鸡尾酒组合物（通过将申请专利保护的抗体（韩国专利申请 10-2011-0020061和韩国专利申请10-2012-0107512)和系统发育群1和2的病毒亚型进行 混合而获得）的反应性通过微量中和试验（下文称为"MN试验"）进行测定。其中，将对群 1具有特异性中和活性的CT120和对群1的部分病毒及群2病毒表现出中和活性的CT149 进行混合，并对CT120和CT149混合之前和之后的结合亲和力以及中和活性进行了分析。申 请人所提交的韩国专利申请10-2011-0020061和韩国专利申请10-2012-0107512在此作为 参考纳入引用。
[0117] 利用表达Hl、H3或H5的细胞系，通过表面等离子体共振法和CELISA (细胞酶联免 疫吸收试验）试验对抗体的结合活性进行了测试。结果为，CT120和CT149分别结合于表 达Hl和H5HA的细胞系，且CT120和CT149的混合物显示出与CT120和CT149各自相似的 结合亲和力。当采用表达H3HA的细胞系时，在CELISA试验中CT149表现出结合亲和力，但 CT120则未表现出结合亲和力。当采用CELISA试验分析CT120和CT149的混合物时，可发 现CT120不会干扰CT149的结合。
[0118] CT120和CT149混合之前和之后的中和活性经由微量中和试验测定。结果可见， CT120和CT149各自表现出原始的中和活性，而其间并无干扰，这表明CT120和CT149展示 出对群1和群2得到所有甲型流感病毒的中和活性。
[0119] 为了检测体内的中和活性，在小鼠感染甲型流感病毒之前和之后向小鼠施用 CT120和CT149或CT120和CT149的混合物。结果可见，施用抗体混合物（在此记为CT-P27) 反映出抗体各自的效果，或显示出所抗体的联合效应，且抗体之间并无相互干扰。
[0120] 将CT120和CT149以混合物施用或与化学化合物联合施用时，其表现出增强的中 和效应。帕拉米韦是一种抵御甲型流感病毒的神经氨酸酶抑制剂。当小鼠感染了甲型流感 病毒，向小鼠联合施用难以表现出中和效应的用量的CT120或CT149和低浓度帕拉米韦，则 表现出比单独施用CT120或CT149有所增强的效果。
[0121] 因此，在本发明中，将对群1甲型流感病毒有效的抗体（CT104、CT120和CT123) (由CT120表示）以及对群2甲型流感病毒有效的抗体（CT147、CT149、CT164和CT166)(由 CT149表示）进行相互混合并进行施用。结果可见，所述抗体的混合物表现出针对群1和 2的所有甲型流感病毒的中和效果。此外，还发现，当所述抗体各自与化学治疗剂联合施用 时，可表现出增强的中和效果。
[0122] 自此，本发明将参考实施例进行具体描述。然而应理解，这些用于说明目的的实施 例并不作为对本发明范围的限制。本发明引用的参考文献在此纳入作为参考。 实施例
[0123] 实施例1 :从流感疮愈患者血内分离PBMC
[0124] 一组由确诊新流感感染后2-4周的患者志愿者组成的患者组。志愿者经确认血液 中无流感病毒（HlNl)并具有针对新流感病毒的抗体。该研究经过机构审查委员会（IRB) 审批后进行。该患者组具有以下特征：（1)这些患者并未接种季节性流感疫苗；（2)这些患 者的其它传染性病毒（即HBsAg)阴性，且抗HCV抗体和抗HIV抗体阴性；（3)这些患者血 浆的流感病毒HlNl亚型呈RT-PCR反应阴性；（4)在甲型流感病毒HlNl亚型的HA(HlNl) 的ELISA试验中，这些患者的血清显示滴度为1:160或更高。从志愿者中采集100mL的全 血，采用Lymphoprep?(Axis-Shield，挪威（1114545)，1114545)，从所采集的血液中分离外 周血单核细胞（PBMC)。所分离的PBMC用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，以2X IO7个细胞/ml 悬浮于KM库II(KM banker II)冷冻剂（Cosmobio,日本，K0J-16092010)，并在液氮柜中保 存。
[0125] 实施例2 :单克降抗体的初步筛诜
[0126] 采用 Jin 等所述的方法（Jin A.等·，2009. Nat. Med. 15, 1088-1092)，筛选分泌抗 原特异性抗体的B细胞。简而言之，将实施例1中分离的PBMC按一个细胞/孔的密度加入 准备好的微阵列芯片的各个孔中。从单个细胞中分泌的抗体经预包被的抗人IgG抗体确 认。利用经标记的HA抗体，采用ELISP0T (酶联免疫斑点试验：塞奇威克（enzyme linked immunospot assay :Sedgwick J.D·，2005, Methods Mol Biol.卷 302, 314 页））对所筛选 的抗体分泌细胞是否分泌HA结合抗体进行分析。通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR)获得 来源于各个抗体分泌细胞的重链和轻链基因完整序列。将所获得的重链和轻链DNA插入 pcDNA 3. 1(+)表达载体（英杰公司，美国（InVitr〇gen，USA，V790-20))以制备产生各抗体 重链和轻链的表达载体。将所制备的表达载体转染至CHO细胞。然后，利用所转染的CHO 细胞中产生的抗体，通过下述实施例3中的HA-ELISA法对结合于HA的抗体进行初步选择。 在此，在未连续稀释抗体样本的情况下将所有显示出HA反应性的抗体进行了初步筛选。
[0127] 实施例3 :单克降抗体的二次筛诜及抗体牛产产物
[0128] 为了从初次筛选的抗体中进行单克隆抗体的二次筛选（其对HlNl流感病毒HA 具有高结合能力），利用HA单体和HA三聚体进行HA ELISA。重组的甲型流感病毒HAl 单体购自中国北京义翘神州生物技术有限公司（Sino Biological Inc. China)。所购A/ CA/04/09(HlNl)的 HA 单体（11055-V08H)由 HA 胞外区（metl-gln529)构成，其在 C 末端含 有10个多组氨酸残基，A/布里斯班/10/07(H3N2)的重组HAl亚单位（11056-V08H1)由HA N末端的片段（Metl-Arg345)构成，其在C末端含有多组氨酸残基并在转染的人细胞中生 产。A/CA/04/09(HlNl)和 A/布里斯班/10/07(H3N2)的重组 HA 三聚体（FR-180 和 FR-61) 由IRR提供（流感试剂资源，美国（Influenza Reagent Resource, USA))。各HA三聚体在 C末端含有凝血酶剪切位点、三聚体区（折叠）和六个组氨酸残基，并采用杆状病毒体系制 备。
[0129] 对HA抗原的抗体反应活性通过采用HA和所述抗体的ELISA测定。具体地，各取 50 μ 1的HA抗原单体和HA抗原三聚体（250ng/ml)并吸附于96孔微量滴定板（Nunc，丹 麦（Nunc, Denmark, 449824))的各孔内。用含有1%小牛血清蛋白（BSA)的磷酸盐缓冲盐 水（Teknova，美国，D5120)封闭滴定板，并向滴定板的各孔内加入3倍连续稀释的抗体样 本（起始浓度：1 μ g/ml)。然后，将滴定板在室温下孵育1小时，再用过氧化物酶标记的山 羊抗人γ抗体（Zymed，美国，62. 8420)进行处理。在室温下孵育1小时后，将滴定板与四 甲基联苯胺（TMB ;西格马-奥德里奇（Sigma-Aldrich)，美国，T0440)共孵育，然后加入IN HCl终止孵育。采用滴定板读数器测定450/570nm下的吸光度（Spectramax plus 384,分 子器件（Molecular Device))，并采用医学图表绘制程序（Graphpad prism program)(图表 绘制软件公司，美国，（GraphPad Software Inc. USA))将抗原-抗体反应以图表形式示出。
[0130] 如图1所示，CT104、CT120和CT123抗体对A/CA/04/09(HlNl)HA三聚体表现出高 反应性，但对HA单体则表现出较少或未表现出反应性。
[0131] 如图2所述，CT147、CT149、CT164和CT166抗体轻易地结合于A/布里斯班 /10/07 (H3N2)的HA三聚体，但未结合于HAl亚单位。这提示，所筛选出的抗体并不结合于 已知的HAl表位，但具有仅结合HAl和HA2区段之间交界处或具有正常构象的HA2或HA的 能力。
[0132] 基于图1和2所示的结果，从初次筛选的抗体中二次筛选得到与HA三聚体表现出 高结合亲和力的抗体。为了提高二次筛选抗体的表达水平，按以下方式将这些抗体的基因 从pcDNA载体中再次克隆到MarEx表达载体（由塞尔特龙（Celltrion)公司构建并获专利） 中。再次克隆后，利用含有抗体基因的MarEx表达载体来制备微量中和法（MN试验）和血 球凝集素抑制实验（HI试验）所需的抗体。
[0133] 采用限制性酶NheI和PmeI处理含有二次筛选抗体各重链基因和轻链基因的原始 pcDNA载体从而获得重链基因和轻链基因。将所获重链基因和轻链基因分别插入到经相同 限制性酶处理的PCT145载体和pCT147载体中。pCT145和pCT147载体由塞尔特龙公司构 建，用于分别克隆各抗体的重链和轻链（图3)。然后，为了构建同时含有重链转录单元（启 动子-重链基因-多聚A)和轻链转录单元（启动子-重链基因-多聚A)的表达载体，将含 有重链基因的PCT145载体经限制性酶PacI和AscI处理并获得重链转录单元，然后将含有 轻链基因的PCT147载体经相同的限制性酶处理，再插入重链转录单元。再利用限制性酶筛 选出同时含有重链转录单元和轻链转录单元的载体（图4)。所筛选的载体利用Endofree 质粒试剂盒（凯杰（QIAGEN)，德国，12362)进行提取，对提取的DNA样本的部分核苷酸序列 进行分析，从而确定抗体的核苷酸序列。
[0134] 随后，将所提取抗体的DNA转染到F2N细胞系（见韩国专利10-1005967)(由韩 国塞尔特龙公司制备）的悬浮培养物中，从而制备产生单克隆抗体的瞬时细胞系。转染 按以下方式进行。按生产商说明书，采用阳离子聚合物Fr eeStyle?MaX(英杰公司，美国 (Invitrogen，USA，16447-100))进行细胞瞬时转染。在转染前一天，将培养于EX-CELL 293 无血清培养基（SAFC，LIK，14571C ;自此称为"EX-CELL 293培养基"）中的F2N细胞进行 离心并按IX IO6个细胞/ml的细胞浓度悬浮于改良的EX-CELL 293培养基中（SAFC，LIK， 65237 ;定制），取80ml细胞悬浮液接种至250ml锥形烧瓶，或取200ml的细胞悬浮液接种 于IL锥形烧瓶。在转染当天，在接种了 80ml的细胞悬浮液情况中，采用OptiPRO SFM II 培养基（英杰公司，USA，12309)将100 μ g的单克隆抗体编码DNA和100 μ 1的Freestyle? Max试剂各稀释到1.6ml体积，然后轻柔搅拌。在接种了 200ml的细胞悬浮液情