况中，采 用OptiPRO SFM II培养基（英杰公司，USA，12309)将250 μ g的单克隆抗体编码DNA和 250 yg的Freestyle? Max试剂各稀释到4ml体积，然后轻柔搅拌。在搅拌操作后，立即 将含有Freestyle? Max的稀释溶液与含有DNA的稀释溶液混合，将混合溶液在室温下孵 育19分钟。在室温下孵育19分钟期间，采用新鲜的改良EX-CELL 293培养基将所接种的 F2N细胞稀释到0. 8 X IO6个细胞的细胞浓度。在孵育19分钟后，用含有DNA和Freestyle ? Max试剂的混合溶液对F2N细胞进行处理并转染。在转染当天，向转染细胞中加入相同量的 EX-CELL 293培养基，然后孵育7-8天，由此制备了单克隆抗体。
[0135] 实施例4 :针对病毒中和活件的体外测宙
[0136] 对本发明人筛选出的抗体进行微量中和（MN)测试，从而测定其对于多种流感病 毒的中和活性。
[0137] 实施例4-1 :MDCK细朐系的培养以及病毒浓度的测宙
[0138] 采用伦敦系（MDCK-L)作为马-达氏犬肾（MDCK)细胞系。采用含有10% FBS (阿 特拉斯生物制剂，美国（Atlas Biologicals，USA，F0500A))、1X青霉素/青霉素（Gibco,美 国，15140)、25mM HEPES (Gibco,美国，15630)和 2mM 的左旋谷氨酰胺（Gibco,美国，25030) 的DMEM培养基（Gibco,美国（Gibco, USA, 11965))，在37°C、5 %的CO2湿化孵育器中培养 MDCK细胞系。
[0139] 采用细胞基ELLISA法对病毒浓度进行定量并测定中值组织培养感染量（TCID5q)。 病毒浓度的测定按以下方式进行。首先，采用病毒稀释液[DMEM(Gibco,美国），3 % BSA(Gibco,美国，15260)、1X 青霉素/青霉素（Gibco,美国）和 25mM HEPES(Gibco,美国）] 对病毒原液作10倍连续稀释，将100 μ 1经稀释的病毒加入96孔板的各孔。采用不含病毒 的病毒稀释液作为阴性对照。然后，通过胰蛋白酶处理将培养的MDCK细胞系与培养孵育器 分离，然后用MDCK培养基处理以中和胰蛋白酶。然后，用磷酸盐缓冲盐水对细胞沉淀洗涤 两次，然后用病毒稀释剂稀释至细胞浓度为5X IO5个细胞/ml。向含有病毒的96孔板中加 入3-4μLΜ的TPCK-胰蛋白酶（西格马，美国），然后向板中各孔内立即加入100μ1的 MDCK细胞系并在37°C、5%的CO2湿化孵育器中孵育20小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤孵育 板一次，然后向板中各孔加入200 μ 1的冷丙酮：磷酸盐缓冲盐水（PBS) (80 :20)混合溶液。 然后，细胞固定8分钟，将板在室温下干燥20分钟。板中各孔用200 μ 1的磷酸盐缓冲盐水 洗涤2次。采用含有1% BSA的磷酸缓冲盐水（0. 1 %吐温20)稀释生物素化的抗核蛋白 (NP)单克隆抗体（密理博公司-Milipore，美国，ΜΑΒ8257Β))2000倍，然后向板中各孔加入 100 μ 1的稀释液并在室温下孵育1小时。用200 μ 1/孔的磷酸缓冲盐水对板进行洗涤三 次，然后向板中各孔加入100 μ 1用含1 % BSA的磷酸缓冲盐水配制的链霉亲和素-HRP偶联 抗体的20000倍稀释液，然后在室温下孵育1小时。在将板经磷酸盐缓冲盐水洗涤四次后， 向板中各孔加入100 μ 1的TMB溶液，将板置于室温下10分钟显色，并用硫酸处理以终止显 色，然后测定各孔的OD45。。基于所测定的OD 45。，米用Reed&Muench法（The American 1938) 对TCIDm进行计算。
[0140] 实施例4-2:MN试验
[0141] 采用病毒稀释液将各抗体稀释至10 μ g/ml的浓度。用病毒稀释液将将抗体稀释 液从该初始浓度开始连续稀释至2倍，然后取50 μ 1各稀释液加入96孔板的各孔。同样， 50 μ 1病毒按对应于IOOTCId5。的浓度加入各孔中，并于37°C、5% CO2湿化孵育器中孵育1 小时。然后，向各孔中加入3-4 μ g/ml的TPCK胰蛋白酶（西格马，美国，T1426)，并将100 μ I 经处理的MDCK细胞加入各孔，然后在37°C、5% CO2湿化孵育箱中孵育20小时。在孵育20 小时后，根据实施例4-1所述病毒定量方法相同的方法进行MN试验，从而测定各孔的OD 45q 值。比仅引入细胞的孔表现出更高0D450值的孔确认为感染了病毒。在未检测到病毒抗原 的各抗体OD45。中，抗体的最低浓度（μ g/ml)如下表1所示，抗体浓度越低意味着对病毒的 中和活性越高。
[0142] 甲型流感病毒Hl亚型的特异性抗体的中和能力如下表1所示，甲型流感病毒H3 亚型的特异性抗体的中和能力如下表2所示。在这些抗体中，利用不同群的甲流病毒，对效 果较佳的CT120和CT149进行微量中和试验。结果，CT120表现出针对群1甲流病毒的中 和效应，而CT149表现出针对部分群1病毒和群2甲流病毒的中和效应（表3)。
[0143] 表1 :采用抗体和甲流病毒Hl亚铟讲行的微量中和试验结果
[0145] * 单位：μ g/ml
[0146] 表2 :采用抗体和甲流病毒H3亚铟讲行的微量中和试验结果
[0148] * 单位：μ g/ml
[0149] 表3 :采用群1和群2流感病毒进行的微量中和试验结果
[0152] * 单位：μg/ml
[0153] 实施例5 :测宙抗体抑制病毒引起的血凝反应的能力
[0154] 由于本发明抗体为针对病毒HA的中和抗体，对本发明抗体对HA功能显示中和活 性的机制进行了研究。HA的功能之一是结合于细胞表面的受体使病毒能粘附于细胞。由 于该功能可通过血凝反应进行观察，就可研究抗体针对HA诱发的血凝反应的抑制效果。为 此，将抗体在V型底96孔板中连续2倍稀释，加入4倍HA单位的病毒并将其与抗体混合。 然后，将板在室温下孵育30分钟，然后向板中各孔加入1 %的禽红细胞。在观察不到血凝反 应时，将血凝反应抑制的结束点确定为最低抗体浓度。
[0155] 结果可见，即使在高浓度下（20 μ g/ml)，所有抗甲流病毒Hl亚型的抗体（表4)或 抗甲流病毒H3亚型的抗体（表5)均未抑制A/德克萨斯/05/2009和A/纽约/18/2009、 A/布里斯班/10/07的血凝反应，而针对它们的抗体在MN试验中表现出中和效应。
[0156] 表4 :采用抗体和甲流病毒Hl亚铟的血凝抑制实验结果
[0158] * 单位：μg/ml
[0159] 表5 :采用抗体和甲流病毒H3亚型的血凝抑制实验结果
[0162] * 单位：μg/ml
[0163] 实施例6 :抗体抑制腊融合的能力的研究
[0164] 为了研究中和抗体的作用机制，研究了抗体对HA另一功能（膜融合能力）的抑 制作用。当病毒通过内吞作用进入细胞后，HA暴露于低pH值环境，其作用是诱导核内体和 病毒包膜之间的膜融合，从而使病毒的基因组穿透细胞。为了在体外重现这种作用，建立 了表达 A/CA/04/09(HlNl)、A/ 日本/305/11957(H2N2)、A/布里斯班/10/07(H3N2)或 A/ 越南/1203/04(Η5Ν1)的HA的CHO细胞系并在试验中使用。当各细胞系暴露于低pH时， 细胞膜进行融合并形成合胞体。具体地，将各细胞系按IX IO5个细胞/孔的密度接种于6 孔板中，并向各孔中加入含10% FBS的DMEM/F12培养基，再于37°C、5% CO2湿化孵育器 中孵育2天。然后，用PBS洗涤细胞，然后在无 FBS的DMEM/F12培养基中孵育30分钟，再 用4 μ g/ml的TPCK-胰蛋白酶对细胞进行5分钟处理以活化HA。然后，将培养基替换为含 10 % FBS的DMEM/F12培养基，再孵育20分钟。用20 μ g/ml的各中和抗体对细胞进行处理， 然后在37°C、5% CO2的湿化孵育箱中孵育1小时。用PBS洗涤孵育的细胞，然后用低pH缓 冲液（150mM NaClUOmM H印es、pH 5. 0)处理6分钟。然后，将培养基换成含10% FBS的 DMEM/F12培养基，然后孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞，用甲醇固定，并用台盼蓝染色，用 显微镜观察细胞的膜融合程度。结果可见，CT120抑制了表达A/CA/04/09(HlNl)、A/日本 /305/11957(H2N2)或 A/越南 /1203/04(H5N1)HA 的 CHO 细胞系的膜融合，CT149 抑制了表 达 A/CA/04/09 (HlNl)、A/ 布里斯班 /10/07 (H3N2)或 A/ 越南 /1203/04 (H5N1) HA 的细胞系 的膜融合（图5a-5d)。
[0165] 因此，实施例5和6表明本发明抗体所表现出的针对病毒的中和效应是基于其与 HA结合而抑制其膜融合的机制。
[0166] 实施例7 :抗体的Fc功會κ介导抗病毒效应的研究
[0167] 实施例7-1 :体外ADCC实验
[0168] 为了测定抗体的抗体依赖性细胞毒性（ADCC)，采用了钙黄绿素-AM释放试验。
[0169] 将钙黄绿素-AM加入表达流感HlNl (A/加利福尼亚/04/2009)的HA的CHO Kl细 胞系以将改细胞系用作靶细胞。加入了钙黄绿素-AM的靶细胞经不同浓度的CT120和CT149 以及阴性对照CT-P6 (抗-Her2抗体）处理，然后用效应细胞处理。在将板进行37°C孵育4 小时后再进行离心，将上清液转移到不透明板中，然后测定其荧光。采用最大发射（MR)和 自发发射（SR)对各抗体浓度下的细胞毒性百分比（％)进行了计算。
[0170] 如图6a所示，在不同抗体浓度下，阴性对照未表现出细胞毒性，但CT120和CT149 在较高浓度下表现出较高的细胞毒性（例如，较高的ADCC)，且CT120所表现出的细胞毒性 高于CT149。
[0171] 实施例7-2 :体外⑶C实验
[0172] 采用细胞计数试剂盒-8 (CCT-8)检测补体依赖性细胞毒性（CDC)，其中吸光度与 活细胞数成比例。
[0173] 具体地，将表达流感HlNl (A/加利福尼亚/04/2009)的HA的CHO Kl细胞系附于 平板，用作靶细胞。所述靶细胞经不同浓度的CT120、CT149和阴性对照CT-P6处理，然后用 作为补体来源的人血清进行处理。将板在37°C下孵育2小时，然后用CCK-8处理并孵育过 夜，然后测定板的吸光度。采用试验系统中最大吸光度和最小吸光度对各抗体浓度下的细 胞毒性百分比（％)进行计算。
[0174] 如表6b可见，在不同的抗体浓度下，阴性对照未表现出细胞毒性，但CT120和 CT149在较高浓度下表现出较高的细胞毒性（例如，较高的ADCC)。
[0175] 实施例7-3 :具有小鼠 Fc的CT149抗体的制备
[0176] 为了使CT149抗体具有小鼠的Fc，将NCBI数据库中5个小鼠 IgGl序列 (GenBank 登录号· L27437. 1，L35037. 1，AB097849. 1，Q724328. 1 和 M745099. 1)进行了 互相比对，将与其它序列具有最高同一性的AB097849. 1的恒定区序列作为小鼠 IgGl恒 定区。任选序列X70423. 1的恒定区作为小鼠 IgG2a恒定区，因为即便NCBI数据库中两 个小鼠 IgG2a序列（GenBank登录号· X70423. 1和AB097847. 1)之间有Ibp的差异，二 者具有相同的氨基酸序列。此外，对NCBI数据库中四个小鼠 κ序列（GenBank登录号 U65535. 1，BC028540. 1，BC094013. 1 和 BC002112. 1)进行了互相比对，结果可见，κ 序列彼 此相同。
[0177] 合成所选小鼠的IgGl和IgG2a恒定区，通过与人CT149可变区的重叠 PCR，获得了 具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合IgGl重链。为了获得小鼠轻链，通过RT-PCR，从杂交瘤 细胞RNA获得κ恒定区，然后通过重叠 PCR获得了具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合轻链 (κ)。发现所获得的轻链和重链序列与NCBI数据库中的序列相同。
[0178] 将所制备的嵌合抗体基因克隆到表达载体中（由塞尔特龙公司构建），然后引 入CHO Kl细胞。将细胞在含有8μg/ml嘌呤霉素的SFM4CH0培养基（Hyclone，目录 号：SH30549. 02)中进行孵育，然后从细胞中选取稳定细胞系。对所选细胞系进行分批培养 来产生具有小鼠 Fc的IgGl形式和IgG2a形式抗体。
[0179] 实施例7-4 :利用含小鼠 Fc的CT149的动物实验
[0180] 对由5只小鼠组成的各小鼠组进行5LD5。的A/加利福尼亚/04/09病毒滴鼻感染。 在病毒感染后24小时，通过腹膜内注射，向每只小鼠施用3mg/kg的各抗体，然后测定小鼠 的生存率。实验中所采用的抗体具有CT149的抗原结合位点以及人Fc或小鼠 IgGl或IgG2a Fc。在用小鼠抗体的情况下，IgG2比IgGl具有更高的FcgR亲和性（Bruhns P，2012，B1〇 od，119(24) :5640-5649)。
[0181] 结果如图7所示，具有小鼠 IgG2a Fe的CT149比其它抗体表现出更高的生存率。 因此，可见即使在体内，本发明抗体也通过Fc表现出了它的效果。
[0182] 实施例8 :CT120和CT149抗体结合于H5和H3亚铟HA位点的测宙
[0183] 为了测定本发明抗体的HA结合位点，采用X射线晶体成像术（图8a和8b)对结 合于HA蛋白的抗体片段氨基酸序列进行了分析。结果可见，CT120表位的主要元件位于A/ 越南/1203/04(H5N1)的HA2亚单位的螺旋侧（图8a)。CT149位于A/爱知/1968(H3N2) HA2亚单位的螺旋侧，同时它结合HA2亚单位附近的其它单体，这意味着其确实结合单一 HA 三聚体中的三个亚单位（图8b)。
[0184] 实施例8-1 :重组HA蛋白的表汰
[0185] 为了生产用于X射线衍射分析的重组HA蛋白，将A/越南/1203/04 (H5N1)和A/爱 知/1968 (H3N2)各自的HA基因的胞外段克隆至杆状病毒载体pAcGP67-A (BD Pharmingen)。 用杆状病毒（构建自该载体）按5-10的MOI (感染复数）在28 °C下感染粉纹夜蛾 (Tricoplusia ni)(高5)细胞系（英杰公司）72小时。通过金属亲和色谱法和尺寸排阻 凝胶过滤层析（Superdex 200 16/60柱；GE医疗），从所收集的培养基中纯化表达并分泌的 HA蛋白。为进行结晶，将纯化的HA与3个单位的凝血酶在4°C下孵育，从而除去C-末端折 叠/组氨酸标签。
[0186] 实施例8-2 :抗体片段的纯化
[0187] 将CT120和CT120抗体各自与木瓜蛋白酶（罗氏（Roche)，REF#:10108014001)以 100:1的比例混合后在37°C下用木瓜蛋白酶处理1小时，然后加入20mM的IAA(西格马： A3221)，再于37°C下孵育45分钟。用HiPr印26/10脱盐柱（GE医疗，目录号17-5087-01) 将培养基换成含有20mM磷酸盐和25mM NaCl (pH7. 0)的缓冲液，然后将孵育材料上样至 Mabselect Sure柱（GE医疗，目录号17-5438-03)以去除Fc区，采用超滤过滤器单元 (Amicon ultra centrifugal filter unit (密理博公司，REF#:UFC901096))将 Fab 片段 浓缩至浓度为l〇mg/ml。经浓缩的Fab片段利用PBS缓冲液并通过尺寸排阻凝胶过滤层析 (Super