施用时，则表现出高达80%的生存 率。单独施用抗体或帕拉米韦表现出的死亡率较高，因为抗体或帕拉米韦的浓度并非为最 优浓度，而抗体和帕拉米韦的联合使用则表现出了协同效应。
[0260] 实施例15 :抗体混合物对神经氨酸酶抑制剂耐药的H7N9突夺株R292K的中和效
[0261] 对于A/上海/2/2013病毒和A/安徽/1/2013病毒，采用体外中和试验分析 CT149(CT-P23)和CT-P27对病毒感染的性能。按实施例4所述进行分析，分析结果如图15 所述。CT149和CT-P27表现出中和病毒的能力，其IC50值如图15所示。
[0262] 对于A/上海/1/2013(野生型）病毒及其突变型（R292K)，也同样通过体外中和试 验分析了抗体的病毒中和能力。按实施例4所述进行分析，分析的结果如图16a和16b所 示。CT149和CT-P27均表现出中和病毒的能力，其IC50值如下表20所示。
[0263] 表20:CT149和CT-P27对A/ h海/1/2013(野牛铟）及其突夺株的中和能力 (IC50)
[0265] * 单位：μ g/mL
[0266] 实施例16 :抗体混合物对神经氨酸酶抑制剂耐药件HlNl突夺株H275Y的中和效 应
[0267] CT120 (CT-P22)和CT149 (CT-P23)按1:1比例相互混合，将混合物命名为 "CT-P27"。按实施例4所述的微量中和试验，测定CT120和CT-P27对神经氨酸酶抑制剂 耐药性HlNl突变株H275Y的EC50值。为了测定EC 5。值，将抗体调整为初始浓度：CT120 : 800 μ g/ml，CT-P27 :400 μ g/ml，然后作4倍连续稀释。检测各孔OD45。下的吸光度，确定仅 引入培养基的孔获得的基础值，此后，采用西格马作图程序绘制与浓度呈函数关系的4参 数图，计算对应于50% OD45。下最大吸光度的浓度，从而确定了 EC5。值。
[0268] EC5。为抗体对病毒表现出50%最大中和活性的浓度，EC5。值越低表示抗体的中和 活性越尚。
[0269] 结果如图17a和17b所示，CT120和CT-P27表现出对神经氨酸酶抑制剂耐受性 HlNl突变株H275Y病毒的中和能力，尤其是两种抗体的混合物（CT-P27)显示出了对突变病 毒的中和能力，而两种抗体间没有干扰。
[0270] 实施例17 :抗体混合物对HA突夺株的结合亲和力
[0271] 如文献中报道，与CT149相似，对群2的流感病毒表现出中和效应的CR8020抗 体对天然存在的HA D19N突变株表现出较低的结合亲和力（Ekiert DC.等2011，Science 333(6044):843-50)。因此，将D19N突变人工引入A/威斯康辛/67/05(H3N2)和/安徽 /1/2013 (H7N9)的各HA (CT149具有结合活性的），从而制备表达HA的CHO细胞系。采用 CT149对细胞系作免疫荧光染色。
[0272] 结果，无结合活性的CT120未染色CHO细胞，而CT149不但轻易染色了野生型CHO 细胞，还染色了引入了 D19N突变的表达HA的CHO细胞（图18a和18b)。
【主权项】
1. 一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感病毒血球凝集素（HA)蛋白干区表位 的甲型流感病毒中和结合分子，所述组合物含有： i) 第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和H9 ; 和 ii) 第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：111、!13、!15、!17和 H9〇2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子的表位可含有HA1多肽 第18、38、40、291、292和318位的氨基酸残基，且含有HA2多肽第18、19、20、21、41、42、45、 48、49、52和53位的氨基酸残基。3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的表位可含有HA1多肽 第278和318位的氨基酸残基，且含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52和53的氨基 酸残基。4. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的表位可含有HA第一 单体的HA1多肽和HA2多肽诸位置的氨基酸残基，还可含有邻近HA第一单体的HA第二单 体的HA1多肽第25、32和33位的氨基酸残基。5. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的表位还含有HA2多肽 第58和99位的氨基酸残基。6. 如权利要求4所述的组合物，其特征在于，第二结合分子的表位还含有邻近该第一 HA单体的第二单体的HA1多肽第27位的氨基酸残基。7. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的表位还含有HA1多肽 第54、55和291位的氨基酸残基，且含有HA2多肽第19、20、21、46、56、57和60位的氨基酸 残基。8. 如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的表位还含有邻近该 HA第一单体的HA第二单体的HA1多肽第310、311和312位的氨基酸残基。9. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物能中和H1N1突变体，所述 H1N1突变体在神经氨酸酶多肽第275位具有组氨酸（His)到酪氨酸（Tyr)的替换。10. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物能中和H7N9突变体，所述 H7N9突变体在神经氨酸酶多肽第292位具有精氨酸（Arg)到赖氨酸（Lys)的替换。11. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述结合分子抑制病毒和靶细胞之间的 膜融合。12. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子的结合亲和力（KD)低 于 1X10sM〇13. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的结合亲和力（KD)低 于 1X10 6m〇14. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子对HI亚型的EC5。值为 2. 0μg/ml或更低，对H2亚型的EC5。值为7. 0μg/ml或更低，对H5亚型的EC5。值为7. 0μg/ ml或更低，或对H9亚型的EC5。值为4. 0μg/ml或更低。15. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子对H3亚型的EC5。值 为40. 0μg/ml或更低，对H5亚型的EC5。值为212. 0μg/ml或更低，对H7亚型的EC5。值为8·Ομg/ml或更低，或对H9亚型的EC5。值为8·Ομg/ml或更低。16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物对HI亚型的EC5。值为 3.Ομg/ml或更低，对H2亚型的EC5。值为13.Ομg/ml或更低，对H3亚型的EC5。值为 70.Ομg/ml或更低，对H5亚型的EC5。值为9.Ομg/ml或更低，对H7亚型的EC5。值为 14.Ομg/ml或更低，或对H9亚型的EC5。值为6.Ομg/ml或更低。17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子含有选自下组的任一 多肽： i) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 1所示⑶R1区、 SEQIDNO. :2所示CDR2区和SEQIDNO. :3所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat 法确定的SEQIDNO. :4所示CDR1区、SEQIDNO. :5所示CDR2区、和SEQIDNO. :6所示 CDR3区； ii) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 7所示⑶R1区、 SEQIDNO. :8所示CDR2区和SEQIDNO. :9所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat 法确定的SEQIDNO. : 10所示CDR1区、SEQIDNO. : 11所示CDR2区和SEQIDNO. : 12所 示CDR3区；和 iii) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 13所示⑶R1 区、SEQIDNO. : 14所示CDR2区和SEQIDNO. : 15所示CDR3区；和重链可变区，包括根据 Kabat法确定的SEQIDNO. :16所示CDR1区、SEQIDNO. :17所示CDR2区和SEQIDNO. :18 所示CDR3区。18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子含有选自下组的任一 多肽： i) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 19所示⑶R1区、 SEQIDNO. :20所示CDR2区和SEQIDNO. :21所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat 法确定的SEQIDNO. : 22所示CDR1区、SEQIDNO. : 23所示CDR2区和SEQIDNO. : 24所 示CDR3区； ii) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. :25所示⑶R1区、 SEQIDNO. :26所示CDR2区和SEQIDNO. :27所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat 法确定的SEQIDNO. : 28所示CDR1区、SEQIDNO. : 29所示CDR2区和SEQIDNO. : 30所 示CDR3区； iii) 一多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 31所示⑶R1 区、SEQIDNO. :32所示CDR2区和SEQIDNO. :33所示CDR3区；和重链可变区，包括根据 Kabat法确定的SEQIDNO. :34所示CDR1区、SEQIDNO. :35所示CDR2区和SEQIDNO. :36 所示CDR3区；和 iv)-多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. :37所示⑶R1区、 SEQIDNO. :38所示CDR2区和SEQIDNO. :39所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat 法确定的SEQIDNO. :40所示CDR1区、SEQIDNO. :41所示CDR2区和SEQIDNO. :42所 示CDR3区。19.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子含有选自下组的任一 所述多肽： 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :43所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 44所示的多肽序列； 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 46所示的多肽序列；和 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :47所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 48所示的多肽序列。20. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子含有选自下组的任一 所述多肽： 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :49所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 50所示的多肽序列； 一多肽，其含有一轻链区包括SEQIDNO. :51所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 52所示的多肽序列； 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :53所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 54所示的多肽序列；和 一多肽，其含有一轻链区，包括SEQIDNO. :55所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. : 56所示的多肽序列。21. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于， 所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. :7所示CDR1区、SEQIDNO. :8所示CDR2区和SEQIDNO. :9所示CDR3区；和重链可变区，包括 根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 10 所示CDR1 区、SEQIDNO. : 11 所示CDR2 区和SEQID NO. : 12所示CDR3区；和 所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQIDNO. : 25所示CDR1区、SEQIDNO. :26所示CDR2区和SEQIDNO. :27所示CDR3区；和重链可变区，包括 根据Kabat法确定的SEQIDNO. :28 所示CDR1 区、SEQIDNO. :29 所示CDR2 区和SEQID NO. : 30 所示CDR3 区。22. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子含有一轻链区，其包 括SEQIDNO. :45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQIDNO. :46所示的多肽序列； 和 所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQIDNO. :51所示的多肽序列，以及一重链 区，其包括SEQIDNO. : 52所示的多肽序列。23. 如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述结合分子是抗体或其 抗原结合片段。24. 如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述抗体上还连接有抗病毒药物。25. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物可用于诊断、预防或治疗由 流感病毒引起的疾病。26. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物是无菌注射溶液、冻干制剂、 注射器预装溶液、口服剂型、外用制剂、或栓剂的形式。27. -种诊断、预防或治疗由流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：向患有 所述疾病的对象施用治疗有效量的如权利要求1-22中任一所述组合物。28. -种诊断、预防或治疗由流感病毒引起的疾病的方法包括步骤： i) 向患有所述疾病的对象同时施用治疗有效量的权利要求1所述的第一结合分子和 第二结合分子； ii) 向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的权利要求1所述的第一结合分子，然后 向所述对象施用治疗有效量的权利要求1所述的第二结合分子；或 iii) 向患有所述疾病的患者施用治疗有效量的权利要求1所述的第二结合分子，然后 向所述对象施用治疗有效量的权利要求1所述的第一结合分子。29. 如权利要求27或28所述的方法，还包括步骤：施用抗病毒药物、病毒进入抑制剂 或病毒附着抑制剂。30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述抗病毒药物是神经氨酸酶抑制剂、血 球凝集素（HA)抑制剂、唾液酸抑制剂、M2离子通道抑制剂或RNA聚合酶抑制剂。31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述神经氨酸酶抑制剂是帕拉米韦、扎那 米韦或奥司他韦。32. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述M2离子通道抑制剂可以是金刚烷胺 或金刚烷乙胺。33. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶抑制剂是法匹拉韦。34. -种诊断患者感染流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： i) 将权利要求1-22任一所述组合物与样品接触；和 ii) 检测所述组合物和所述样品之间的反应。35. -种诊断流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有： i) 权利要求25所述的用于诊断流感病毒的组合物；和 ii) 一容器。
【专利摘要】本发明提供了一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感病毒血球凝集素(HA)蛋白干区表位的甲型流感病毒中和结合分子，所述组合物含有：i)第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和H9；和ii)第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5、H7和H9。本发明的混合组合物可有效中和系统发育群1和系统发育群2的多种流感亚型，并能与化学化合物联用；因此，本发明组合物在预防和治疗流感病毒所引起的疾病中非常有效。
【IPC分类】A61K39/395, A61K38/17, A61K38/16, A61K47/48
【公开号】CN105338994
【申请号】CN201480018932
【发明人】洪承绪, 张宸在, 权起圣, 李癸淑, 金成桓, 李殷范, 李在元, 李昭贞, 辛知泳, 曹明三
【申请人】赛特瑞恩股份有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年3月28日
【公告号】CA2902147A1, EP3011968A1, US20160052997, WO2014158001A1