用于活性自体免疫疗法的高纯度卵巢癌干细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉参考 本申请根据35 U. S.C. § 119(e)要求2013年3月12日提交的美国临时专利申请 61/778,225的权益。本申请也是2013年8月6日提交的国际申请PCT/US2013/053850的 部分继续申请，所述国际申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2012年8月15日提交的美国 临时专利申请61/683, 477和2012年10月25日提交的美国临时专利申请61/718, 643的 权益。所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及卵巢癌干细胞、源自所述干细胞的免疫原性组合物以及制造和使用所 述干细胞的方法。
【背景技术】
[0003] 卵巢癌被认为来源于位于卵巢内层的上皮中，并且因此具有腺癌组织学特征。卵 巢癌干细胞先前已经被描述成选自SK0V3和A224细胞系中主群（main population ;MP)的 "亚群"或"侧群"（side population ;SP)，其表达干细胞标记基因（0ct4和Nanog)、转运体 基因（ABCG2、ABCC4、ABCB1)以及CD标记（0)44、0)24、0)177)，具有分化成癌症的可能性，具 有不同组织结构，表明干细胞的多能特征。这类细胞的分离使用荧光DNA结合染料Hoechst 33342的排除来实现。
[0004] 特定癌症干细胞群体可能是赘瘤来源，并且可能是已经治疗的癌症复发的来源。 另外，癌症干细胞在组织中的亚群当暴露于某些信号中时可能重新启动生长周期并且产生 可以重建肿瘤的细胞。癌症干细胞小生境（niche)是休眠的，直到正确的信号传导触发再 进入增殖周期。再进入信号可以来源于局部事件，如外伤、细胞损伤、微生物攻击(病毒、细 菌或真菌)，或由局部生长因子、细胞因子或细胞间通信来介导。另外，激素可以调节组织特 异性小生境中的干细胞。干细胞小生境的缺陷或突变可能导致上文功能的扰动。赘瘤可能 由这类扰动产生，并且这些扰动包括影响对细胞周期的控制的随机突变。导致癌症的突变 在个体之间变化。在患有一种类型的癌症的那些人之间（如一个乳癌患者对比另一个乳癌 患者）以及在不同类型的癌症之间(如卵巢癌对比黑色素瘤）观察到这类变化性。在卵巢癌 中，在大部分情况中已经识别出对TP53基因的损伤，然而这种突变并未始终反映在肿瘤细 胞表型中。
[0005] 也在各种比例中使不一致的标记与肿瘤细胞相关联，并且大体上成功地将其用 于触发免疫反应。这类使用肿瘤相关抗原的疗法采用各种蛋白质或肽，如CA125、Her-2、 Muc-I、Neu、NY-ES0-1或源自肿瘤的热激蛋白（HSP)。
[0006] 自体免疫疗法采用患者自身的肿瘤组织以使免疫系统敏感并附接癌细胞。单独或 与佐剂一起给予裂解物或全细胞方法，已经用于增强对肿瘤的免疫反应。
【发明内容】
[0007] 本文公开卵巢癌（OV)癌症干细胞（csc)、ov-csc细胞系以及用于治疗卵巢癌的包 含OV-CSC负载型树突状细胞的免疫原性组合物。
[0008] 本文具体提供一种免疫原性组合物，其包含由源自本文所公开的经纯化卵巢癌 (OV)癌症干细胞（CSC)群体的肿瘤抗原离体活化的树突状细胞。在一个实施方案中，所述 肿瘤抗原包含所述OV-CSC的细胞提取物。在另一个实施方案中，所述肿瘤抗原包含所述 OV-CSC的裂解物。在另一个实施方案中，所述肿瘤抗原包含完整ον-csc。在另一个实施方 案中，所述肿瘤抗原包含离体转染到所述树突状细胞中的信使RNA。
[0009] 在另一个实施方案中，所述完整OV-CSC被赋予非增殖性。在另一个实施方案中， 所述完整OV-CSC通过辐射而被赋予非增殖性。在又另一个实施方案中，所述完整OV-CSC 通过将所述OV-CSC暴露于核交联剂或蛋白质交联剂中而被赋予非增殖性。
[0010] 在一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的载体和/或 赋形剂。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。在另一个实施方案 中，所述佐剂是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
[0011] 在又另一个实施方案中，免疫原性组合物包含被活化的树突状细胞和0V-CSC。在 另一个实施方案中，所述OV-CSC呈OV-CSC球状体、早期0V-CSC、混合OV-CSC或EMT-OV-CSC 形式。
[0012] 还提供一种在有需要的受试者中治疗卵巢癌的方法，其包含向所述受试者给予本 文所公开的免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物以多个剂量形式给 予，每一个剂量包含约5-20 X IO6个细胞。在另一个实施方案中，所述剂量包含约10 X IO6个细胞。在另一个实施方案中，所述剂量每周给予一次，持续2-5个剂量，接着每月给予 一次，持续3-6个剂量。在又另一个实施方案中，所述受试者接受6-10个剂量的免疫原性 组合物。
[0013] 还提供本文所公开的免疫原性组合物、本文所公开的OV-CSC或本文所公开的 OV-CSC细胞系在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。
[0014] 还提供本文所公开的免疫原性组合物、本文所公开的OV-CSC或本文所公开的 OV-CSC细胞系用于治疗卵巢癌的用途。
[0015] 本文进一步提供用于制备卵巢癌（OV)癌症干细胞（CSC)的群体的方法，所述方法 包含：获取OV样本；使所述样本的细胞解离以及在非粘附性底物上在成分确定的培养基中 体外培养所述解离的细胞，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有至少一种经 由促分裂原活化蛋白激酶(MPK)路径起作用的生长因子，由此形成OV-CSC球状体；其中 所述OV-CSC球状体群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：EpCAM、 CA-125、MUC-1、CD117、He-4、ALDH、CD133、CD24 以及 Ki-67。在另一个实施方案中，所述 OV-CSC球状体群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个；CA19-9、 HER2/neu、NCAM、神经节苷脂CD2、雌激素受体α、波形蛋白、CK8、CK18、AFP、睾酮、TGFP R、 EGFR、TAG-72、CD46、CD44、ABCG2、Slug/Snail、巢蛋白（nestin)以及 ΤΡ53。在另一个实施 方案中，所述OV-CSC球状体群体中至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个： EpCAM、CA-125、MUC-1、CD117、He-4、ALDH、CD133、CD24 以及 Ki-67。
[0016] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述OV-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有至少一种 经由所述MPK路径起作用的生长因子，由此形成早期OV-CSC的群体，其中所述早期OV-CSC 群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：EpCAM、⑶133、⑶44、Nanog、 Sox2、0ct3/4、CD17以及Ki-67。在另一个实施方案中，所述早期OV-CSC群体中至少80%的 细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个 ：CA-125、MUC-l、TGFβR以及⑶24。在又另 一个实施方案中，所述早期OV-CSC群体中至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更 多个：EpCAM、CD133、CD44、Nanog、Sox2、0ct3/4、CD17 以及 Ki-67。
[0017] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述OV-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清，由此形成混合OV-CSC的 群体，其中所述混合OV-CSC群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个： EpCAM、CA-125、MUC-l、CD117、CK8、CK18以及Ki-67。在另一个实施方案中，所述成分确定 的培养基进一步包含至少一种经由所述MPK路径起作用的生长因子。在又另一个实施方 案中，所述成分确定的培养基是低钙的成分确定的培养基。在另一个实施方案中，所述混合 OV-CSC群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CA19-9、HER2/ neu、NCAM、神经节苷脂 CD2、雌激素受体 α、睾酮、TGF β R、EGFR、TAG-72、CD46、He-4、ALDH、 ⑶133、⑶44、ABCG2、巢蛋白以及TP53。在又另一个实施方案中，所述混合OV-CSC群体中 至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：EpCAM、CA-125、MUC-1、CD117、CK8、 CK18 以及 Ki-67。
[0018] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培 养基中培养所述OV-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清并且补充有至少 一种经由所述MPK路径起作用的生长因子，由此形成上皮细胞向间充质细胞转变的 (EMT)-OV-CSC的群体，其中所述EMT-OV-CSC群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的 两个或更多个：NCAM、Slug/SnaiI、CD24以及Twist。在另一个实施方案中，所述EMT-OV-CSC 群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CA-125、MUC-1、⑶133、 Nanog、⑶117、N-钙粘素、⑶44以及波形蛋白。在另一个实施方案中，所述EMT-OV-CSC群 体中至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：NCAM、Slug/Snail、⑶24以及 Twist0
[0019] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养 基中培养所述OV-CSC球状体、所述混合OV-CSC或EMT-0V-CSC，其中所述成分确定的培养 基是无血清的并且补充有至少一种经由所述MPK路径起作用的生长因子，由此形成早期 OV-CSC的群体，其中所述早期OV-CSC群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两个 或更多个：EpCAM、CD133、CD44、Nanog、Sox2、0ct3/4、CD17 以及 Ki-67。在另一个实施方 案中，所述早期OV-CSC群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个： CA-125、MUC-I、TGF β R以及CD24。在又另一个实施方案中，所述早期OV-CSC群体中至少90% 的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：EpCAM、⑶133、⑶44、Nanog、Sox2、0ct3/4、 CD17 以及 Ki-67。
[0020] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述OV-CSC球状体、所述早期OV-CSC或EMT-0V-CSC，其中所述成分确定的培养基含 有血清并且补充有至少一种经由所述MPK路径起作用的生长因子，由此形成混合OV-CSC 的群体，其中所述混合OV-CSC群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多 个：AFP、CK7、CK19、EpCAM、E-钙粘素、Nanog、FoxA2 HNF4a 以及 ABCG2。在另一个实施方 案中，所述成分确定的培养基进一步包含至少一种经由所述MPK路径起作用的生长因子。 在又另一个实施方案中，所述成分确定的培养基是低钙的成分确定的培养基。在另一个实 施方案中，所述混合OV-CSC群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多 个：CA19-9、HER2/neu、NCAM、神经节苷脂 CD2、雌激素受体 α、睾酮、TGFP R、EGFR、TAG-72、 CD46、He-4、ALDH、CD133、CD44、ABCG2、巢蛋白以及ΤΡ53。在又另一个实施方案中，所述混 合OV-CSC群体中至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：EpCAM、CA-125、 MUC-1、CD117、CK8、CK18 以及 Ki-67。
[0021] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养 基中培养所述OV-CSC球状体、所述早期OV-CSC或混合0V-CSC，其中所述成分确定的培 养基含有血清来源并且补充有至少一种经由所述MPK路径起作用的生长因子，由此形成 EMT-OV-CSC的群体，其中所述EMT-OV-CSC群体中至少80%的细胞表达以下生物标记中的两 个或更多个：NCAM、Slug/Snail、CD24以及Twist。在另一个实施方案中，所述EMT-OV-CSC 群体中至少80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CA-125、MUC-1、⑶133、 Nanog、⑶117、N-钙粘素 、⑶44以及波形蛋白。在另一个实施方案中，所述EMT-OV-CSC群 体中至少90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：NCAM、Slug/Snail、⑶24以及 Twist0
[0022] 在一个实施方案中，所述成分确定的培养基是表2中所描述的任何培养基；来自 于表2和表3的组合的任何培养基；来自于表2、表3和表4的组合的任何培养基；或来自 于表2和表4的组合的任何培养基。
[0023] 在一个实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子（FGF)、表皮生长因子 (EGF)或活化素 A中的一个或多个。在另一个实施方案中，所述FGF是碱性FGF(bFGF)。在 另一个实施方案中，所述成分确定的培养基并未补充有活化素 A。在又另一个实施方案中， 所述成分确定的培养基以有效防止OV干细胞自发分化的量补充有活化素 A的激动剂。在 另一个实施方案中，所述培养基包含活化素 A的拮抗剂，并且所述拮抗剂是卵泡抑素或与 活化素 A特异性结合的抗体。
[0024] 在另一个实施方案中，所述培养基并未补充有抗氧化剂。在另一个实施方案中，所 述抗氧化剂是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、腐胺或巯基乙醇。在又另一个 实施方案中，所述培养基补充有谷胱甘肽。
[0025] 在另一个实施方案中，所述粘附性底物被配置成用于粘附于锚着依赖性细胞 (anchorage dependent cell)(如成纤维细胞）上并且任选地收集所述细胞。在另一个实 施方案中，所述非粘附性底物是超低粘附性聚苯乙烯表面。在又另一个实施方案中，所述粘 附性底物包含涂布有富含RGD三肽基序的蛋白质的表面。
[0026] 还提供一种经纯化的OV-CSC细胞的群体，其通过本文所公开的方法中的任一种 来制备。在某些实施方案中，所述OV-CSC是OV-CSC球状体、早期0V-CSC、混合OV-CSC或 EMT-OV-CSC。
[0027] 还提供一种OV-CSC细胞系，其通过本文所公开的方法中的任一种来制备。在某些 实施方案中，所述OV-CSC是OV-CSC球状体、早期0V-CSC、混合OV-CSC或EMT-0V-CSC。
[0028] 还提供在有需要的受试者中刺激针对卵巢癌的免疫反应的方法，其包含给予本文 所公开的免疫原性组合物、本文所公开的OV-CSC细胞或本文所公开的OV-CSC细胞系。
[0029] 还提供本文所公开的OV-CSC细胞或本文所公开的OV-CSC细胞系在制备用于治疗 卵巢癌的药物中的用途。
[0030] 还提供本文所公开的OV-CSC细胞或本文所公开的OV-CSC细胞系用于治疗卵巢癌 的用途。
【附图说明】
[0031] 图1是从切除的肿瘤中（实线方框和箭头)或从如针头活检体或腹膜灌洗物的小样 本(虚线方框和箭头）中将卵巢癌（OV)癌症干细胞（OV-CSC)分离、扩增以及采集成球状体 的过程的流程图。在生成球状体之后，产生OV-CSC亚群的路径是常见路径。
[0032] 图2描绘在非粘附性条件中产生不规则细胞聚结物的确立的肿瘤细胞系 (0VCAR3)，因此表明较高分化程度(相差20X )。
[0033] 图3描绘在非粘附性条件中产生典型球体的源自患者的卵巢癌干细胞，因此表明 癌症干细胞的存在和扩增。
[0034] 图4A-D描绘针对癌症干细胞生物标记EpCAM和NCAM进行标识的源自患者的卵巢 癌干细胞培养物（图4A)。将细胞接种在含有5%血清的培养基、10 ng/mL bFGF以及10 ng/ mL EGF中。图4B描绘图4A细胞的红色通道图像，反映NCAM阳性细胞。图4C描绘图4A细 胞的绿色通道图像，表明EpCAM在与细胞的上皮细胞向间充质细胞转变（EMT)相关联的现 象中的缺失。图4D描绘用于双苯甲亚胺（bisbenzimide)核染色的蓝色通道图像。
[0035] 图5A-D描绘针对EMT生物标记Slug/Snail和⑶117进行标识的源自患者的卵巢 干癌细胞培养物（图5A)。将细胞接种在含有5%血清的培养基、10 ng/mL bFGF以及10 ng/ mL EGF中。图5B描绘红色通道图像，其指示图5A细胞的大部分对Slug/Snail呈阳性。图 5C描绘绿色通道图像，其指示图5A细胞对⑶117呈阳性。图f5D描绘用于双苯甲亚胺核染 色的蓝色通道图像。
[0036] 图6A-C描绘针对癌症干细胞生物标记巢蛋白进行标识的源自患者的卵巢癌干细 胞培养物（图6A)。将细胞接种在含有5%血清的培养基、10 ng/mL bFGF以及10 ng/mL EGF 中。图6B描绘红色通道图像，其指示大部分细胞对巢蛋白呈阳性。这种现象与EMT相关联。 图6C描绘用于双苯甲亚胺核染色的蓝色通道图像。
[0037] 图7描绘在明胶上在含有5% FBS的培养基中的源自患者的卵巢癌干细胞培养物 (相差，IOX )。
[0038] 图8描绘在明胶上在含有5% FBS、10 ng/mL bFGF以及10 ng/mL EGF的培养基中 的源自患者的卵巢癌干细胞培养物(相差，10X )。
[0039] 图9描绘在明胶上在无血清培养基中的源自患者的卵巢癌干细胞培养物(相差， IOX )〇
[0040] 图10描绘在明胶上在含有10 ng/mL bFGF和10 ng/mL EGF的无血清培养基中的 源自患者的卵巢癌干细胞培养物(相差，10X )。
[0041] 图11描绘在含有10 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF以及5 ng/mL活化素 A的无血 清培养基中的源自患者的卵巢癌干细胞小集落(相差，40X)。可以在致密集落中观察到 代表约90%细胞大小的具有大核的小细胞，表明极早期癌症干细胞(胚胎干细胞样，"早 期 " OV-CSC )。
[0042] 图12A-D描绘针对卵巢癌生物标记CA125和MUC-I进行标识的源自患者的卵巢癌 干细胞培养物（图12A)。将细胞接种在含有10 ng/mL bFGF和10 ng/mL EGF的无血清培 养基中。图12B描绘图12A细胞的红色通道图像，其展示超过90%的细胞对CA125呈阳性。 图12C描绘图12A细胞的绿色通道图像，其指示大部分细胞以各种强度对MUC-I呈阳性。图 12D描绘用于双苯甲亚胺核染色的蓝色通道图像。
[0043] 图13A-D描绘对卵巢癌生物标记CK8和增殖标记Ki67进行标识的源自患者的卵 巢癌干细胞培养物（图13A)。将细胞接种在含有10 ng/mL bFGF和10 ng/mL EGF的无血 清培养基中。图13B描绘图13A细胞的红色通道图像，表明密集的增殖(对Ki67标记呈阳 性)。图13C描绘图13A细胞的绿色通道图像，其展示大部分细胞对CK8呈阳性。图13D描 绘用于双苯甲亚胺核染色的蓝色通道图像。
[0044] 图14A-D描绘针对癌症干细胞生物标记EpCAM和NCAM进行标识的源自患者的 卵巢癌干细胞培养物。将细胞接种在含有10 ng/mL bFGF和10 ng/mL EGF的无血清培 养基