马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制品加工技术领域，具体设及一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取 方法，W及该活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的，它是指细胞在致癌因素作用下，基因发生了 改变，失去对其生长的正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。2008年，WK)发 布的数据显示，中国已经成为世界第二大癌症高发国，中国每年新增220万名癌症患者，约 占全球癌症病人总数的20%，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成为主要的健康杀手。研究如何消灭 癌症、让癌症病人能生活地更好，是医药领域中的研究重点，因此寻找高效、低毒、选择性强 的有临床应用价值的理想的新型抗肿瘤药物是一项长期而艰巨的任务，从中药里寻找抗肿 瘤药物已成为抗肿瘤药物开发的重要方向与希望所在。
[0003] 马钱子为马钱科植物马钱St巧chos rux-vomicaL.的成熟种子，主产于印度、泰国 和我国云南等地，具有消肿散结、通络止痛之功效，擅于消疲除积、通资利络、杨旺血行。
[0004] 肿瘤是阴毒之邪疲结于内，马钱子为辛溫大毒之品，善入经络，有攻坚蚀疮、破疲 散结、消肿止痛之功，多用于攻毒桂邪之法。千百年来，马钱子一直作为毒攻毒"治疗恶 性肿瘤的常用药物，研究表明，马钱子对胃癌、食管癌、大肠癌效果显著。故本研究对马钱子 的抗肝癌、肺癌活性成分进行一定的研究。
[0005] 马钱子具有多种与抗肿瘤作用相关的活性物质，有些活性物质如番木整碱、马钱 子碱的药理作用已研究得比较深入；而其中一些生物碱如番木整碱氮氧化物、依卡精、克鲁 勃林、奴弗新的研究则较少。马钱子活性物质未能最大程度地得到开发与利用，所W研究具 有抗肿瘤作用的新的活性物质，不断开拓现有活性物质的新的生理活性和药理作用具有重 要意义，能为进一步研究和开发马钱子在医药方面的应用提供理论基础和产业化背景。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对W上现有背景，提供一种马钱子抗肿瘤活性组 分的提取方法，该方法W生物活性实验指导下，马钱子抗癌活性组分分离提取为基础，经乙 醇浸提后再用制备液相色谱技术活性导向分离出强活性抗肿瘤活性组分。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：
[0008] 一种马钱子抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法包括W下步骤：
[0009] (1)W马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙醇浸泡或者回流提取，过滤，所得 滤液进行旋转蒸发至干，用甲醇体积分数为50-70 %的甲醇-水二元混合溶剂溶解，得到固 含量50-200mg/mL的提取液；
[0010] (2)对得到的提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动 相为二元混合液相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为50-200mL/针；流动相流速为 100-100011117111^;检测器为紫外检测器，检测波长200-260皿；洗脱方式为6相浓度25%等 度洗脱1〇111111、6相浓度35%等度洗脱2〇111111、6相浓度100%等度洗脱1〇111111;根据紫外吸 收光谱收集15. 5-19. 5min洗脱液，旋转蒸发至干，得到一维液相组分；
[0011] (3)用甲醇体积分数为50-70 %的甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解 至固含量为50-100mg/mL;
[0012] (4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为二元混合液 相，其中A相为水、B相为甲醇；进样量为500-2000μL/针；流动相流速为10-30mL/min;检 测器为紫外检测器，检测波长200-260皿；洗脱方式为6相浓度32%等度洗脱30-40111^;根 据紫外吸收光谱收集20-31min洗脱液，旋转蒸发浓缩至干，得本发明抗肿瘤活性组分。
[0013] 所述步骤（1)中回流提取可重复进行1-3次，每次1-化。
[0014] 所述步骤（1)、（3)中甲醇-水二元混合溶剂含0. 1% (质量百分比）乙酸。 阳〇1引所述步骤似、（4)中二元混合液相的A相含0. 1 % (质量百分比）乙酸。
[0016] 所述步骤似中C18色谱柱具体为反相C18轴向加压色谱柱 Π50X250mm，1Ομηι，100A) >.使用时柱溫为室溫或 25-40 °C。
[0017] 所述步骤（4)中C18色谱柱具体为华谱C18色谱柱（20X250mm:，5μ猫，100A):， 使用时柱溫为室溫或25-40°C。
[0018] 本发明进一步提供上述提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分在制备抗肺癌药物中 的应用。该马钱子抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可 接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒 剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种 剂型。
[0019] 本发明还进一步提供上述提取得到的马钱子抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物 中的应用。该马钱子抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的 可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒 剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种 剂型。
[0020] 本发明选用二维高效液相色谱技术从天然产物马钱子子实体中提取抗肿瘤活性 组分，通过合理选择色谱柱、溶解液、流动相等，结合对流速、洗脱方式、收集区段等工艺条 件的摸索，使得整个分离纯化方法切实可行，操作简便，制备周期短，仪器自动化程度高，试 剂耗费量小，常溫常压下就可进行，制备量大，重复性高，得到的物质组分批次之间一致性 高，可操作性好，可控度高，可直接运用于工业生产。
[0021] 本发明得到的抗肿瘤活性组分性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在 体外的抗肿瘤作用，发现该化合物对肺癌A549细胞和肝癌化p-g2细胞具有强抑制作用，即 体外实验抗肿瘤作用明显，具有良好的抗癌药物开发潜力，可用于研发制备抗肿瘤药物中， 为抗癌天然药物的开发提供了新的原料来源和理论依据。
【附图说明】
[0022] 图1所示的是本发明马钱子抗肿瘤活性组分提取方法的一维色谱分离图；
[0023] 图2所示的是本发明马钱子抗肿瘤活性组分提取方法的二维色谱分离图；
[0024] 图3所示的是本发明得到的马钱子抗肿瘤活性组分抑制人肺癌A549细胞生长的 细胞实时检测图，其中M-Et-4-2为目的抗肿瘤活性组分，HLXA为环憐酷胺；
[00巧]图4所示的是本发明得到的马钱子抗肿瘤活性组分抑制人肝癌化P-G2细胞生长 的的细胞实时检测图，其中M-Et-4-2为目的抗肿瘤活性组分，HLXA为环憐酷胺。
【具体实施方式】
[00%] W下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，W下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。 阳〇27] 1、原料、材料：
[0028] 原料马钱子子实体采摘自河北并经过鉴定；A549细胞、胎P-G2细胞由中国医学科 学院血液病医院提供。
[0029] 2、试剂：
[0030] 色谱级甲醇、乙酸、乙醇购自天津市康科德科技有限公司；环憐酷胺购自天津金世 制药有限公司；DMS0购自Sigma公司；F-12K培养基购自LifeTechnologiesCo;rporation; MEM培养基购自LifeTechnologiesCo;rporation。
[0031] 3、仪器设备：
[0032] 超微粉碎机购自山东Ξ清不诱钢设备有限公司；台式冷冻离屯、机购自Thermo公 司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；反相C18轴向加压色谱柱(150x250mm，10|職， 100A)购自江苏汉邦科技有限公司；华谱C18色谱柱（孤巧沸掛m，5μηι，100A)购自上 海华谱技术服务中屯、；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；细胞实时监测 仪购自艾森生物（杭州）有限公司；细胞培养箱购自立德泰劇（上海）科学仪器有限公司。
[0033] 实施例1:抗肿瘤活性组分的提取
[0034] W马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙醇回流提取1.化，过滤，取沉淀重复 提取2次，合并所得滤液，旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取lOg，溶于lOOmL55 %的甲 醇-水（0. 1 %乙酸）溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为lOOmg/mU过0. 45μm微孔滤 膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用InnovelC18 150X250mm，10ym，iOOA，流 动相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水（含0. 1 %乙酸）、B相是甲醇，洗脱 方式：B相浓度25%等度lOmin、B相浓度35%等度20min、B相浓度100%等度lOmin。采 用紫外检测器，选择210nm吸收波长，制备溫度为室溫，进样量为150mL/针，流动相流速为 600血/min,收集15. 5-19. 5分钟（图1中4号峰）的馈分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一 维制备粗品。用50%的甲醇-水（0. 1%乙酸）溶液溶解一维制备粗品，浓度为50mg/血， 经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为华谱C18 20X250mm，5μm，10:0某，流动 相采用的为二元液相的混合，其中二元液相A相是水（0. 1 %乙酸）、B相是甲醇，采用32% B相等度洗脱35分钟。采用紫外检测器，选择210nm吸收波长，制备溫度为室溫，进样量为 2000μL/针，流动相流速为16mL/min，收集20-31分钟（图2中M-Et-4-2峰）的馈分，旋 转蒸发至干，得到目的组分。
[0035] 对得到的组分进行进行NMR氨谱、NMR碳谱、质谱等鉴定，结果显示M-Et-4-2组分 主要含有吗I噪生物碱及其他未知物。