形成细胞的损 伤。因此，该提取物方法制得的积实提取物能够用于制备抗衰老的产品。所述抗衰老的产品 指包含本发明提供方法制得的积实提取物的食品、药品、保健品或化妆品。在本发明中，所 述抗衰老的产品优选为化妆品。所述抗衰老化妆品的功效主要为:去除皱纹、淡化细纹、改 善松弛，增加弹性。
[0061] 本发明中提供的提取方法针对抗衰老效果改善提取工艺参数，所制得的积实提取 物能够显著降低紫外对成纤维细胞和角质形成细胞的伤害，促进成纤维细胞中I型胶原蛋 白表达，抑制MMP-I的表达，发挥延缓皮肤衰老的功效。本发明中的积实提取物从表皮和真 皮双管齐下达到延缓皮肤衰老的目的，弥补了对积实保健功效的研究不足。为抗衰老食品、 保健品、化妆品的开发，提供有力的支持。
【具体实施方式】
[0062] 本发明提供了一种积实提取物及其制备方法与在延缓皮肤衰老中应用，本领域技 术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围 内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0063] 本发明采用的材料、试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0064] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[00化]实施例1
[0066] 取积实饮片，粉碎，过2号筛网，得到24目粒度原料。称取上述积实粉末加入5倍的 30%乙醇水溶液，于20°C水浴提取化，过滤，得到滤液。滤液于20°C真空薄膜浓缩，得到提取 物。册LC检测积实提取物中的抽皮巧和新澄皮巧的含量分别为20.78%和13.83%，辛弗林 的含量为2.12%。
[0067] 实施例2
[006引取积实饮片，粉碎，过3号筛网，得到50目粒度原料。称取上述积实粉末加入20倍的 90%乙醇水溶液，于70°C水浴提取化，过滤，得到滤液。滤液于60°C真空薄膜浓缩，得到提取 物。册LC检测积实提取物中的抽皮巧和新澄皮巧的含量分别为17.35%和22.65%，辛弗林 的含量为1.69 %。
[0069] 实施例3
[0070] 取积实饮片，粉碎，过4号筛网，得到60目粒度原料。称取上述积实粉末加入15倍的 60%乙醇水溶液，于50°C水浴提取化，过滤，得到滤液。滤液于45°C真空薄膜浓缩，得到提取 物。册LC检测积实提取物中的抽皮巧和新澄皮巧的含量分别为29.27%和26.82%，辛弗林 的含量为3.03 %。
[0071] 实施例4成纤维细胞I型胶原蛋白表达和基质金属蛋白酶(MMP-I)表达
[0072] 用出生后1天的Sprague-Dawl巧大鼠乳鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。 置舰伏溶液中处死。无菌条件下，取背部全层皮肤。修剪皮下组织、脂肪、血管等。将皮肤剪 成0.5cm*2cm的条状。用含10%胎牛血清的DMEM(Corning Cellgro)洗涂3次（也可用含庆大 霉素800U/ml的D-hank'S液进行漂洗）。置含1-2%胎牛血清DMEM配置的0.5%的dispase (Sigma)中，4°C冰箱消化14heD-hank's(武汉Boster生物技术有限公司）液漂洗2次。用眼科 綴将表皮与真皮分离。分离后真皮用于成纤维细胞的培养。将分离的真皮用组织剪充分剪 碎，约0.1 mm3大小，置于37°C、5%C〇2的解箱中用0.5 %~0.04%的膜酶消化30min，用己氏管 轻轻反复吹打，尽量吹散，10 % FBS的DMEM终止消化，通过150目不诱钢筛网过滤，离屯、 120化pm，5min，加入5ml培养基，移入75ml培养瓶中，置入37 °C、5 % C〇2的培养箱中原代培 养。成纤维细胞培养3d后首次换液，当细胞达70 %~80 %融合时Wo. 25%~0.1 %的膜酶消 化传代，按W上方法消化、传代接种。成纤维细胞接种后地左右即可见贴壁现象，细胞伸出 伪足初期附着，接种后3d可见细胞变扁平，数量增多，呈梭形，传代后细胞生长排列较规律， 多呈放射状、编织状或縱满状走行。
[0073] 利用2-4代的成纤维细胞，用0.125%的膜酶消化铺盘后12-1化，给予60mJ/cm2的 UVB照射，使用40μg/ml、化g/ml、0.4iig/ml的抽皮巧、新澄皮巧，化g/ml、0.化g/ml、0.0化邑/ ml辛弗林W及20化g/ml、20μg/ml、化g/ml实施例1~3处理4她。收集细胞，并用化izol进行 裂解，抽提总RNA，使用TaKaRa RNAPCR试剂盒进行RT-PCR反应，反转录反应条件：55 °C 2〇111111，99。[5111111，5。[5111111。？〔1?反应条件：94。(：日111111，94。[3036。，55。[3036。，72。[ 30sec，循环30次，反应产物于1 %aga;rose中电泳。产物条带与marker条带进行比对，W GAPDH为内参对扩增产物进行半定量。
[0074] 取实施例1~3和中提取物处理过的成纤维细胞衰老模型细胞进行总RNA进行PCR， 结果如表1~2所示。经过紫外照射后，成纤维细胞中I型胶原蛋白含量降低，MMP-I表达上 升。抽皮巧、新澄皮巧、辛弗林、积实提取物处理后，均能增加胶原蛋白表达，降低MMP-I表 达，并存在剂量依赖，同时积实提取物的抗衰老效果要优于抽皮巧、澄皮巧单、辛弗林单一 组分。
[0075] 表1提取物对成纤维细胞衰老模型I型胶原蛋白表达影响
[0078]表2提取物对成纤维细胞衰老模型基质金属蛋白酶(MMP-I)表达影响
[0081 ]实施例5对成纤维细胞衰老模型的影响
[0082] 利用2-4代的成纤维细胞，用0.125 %的膜酶消化铺盘后12-16h，给予60mJ/cm2的 UVB 照射，使用40]ig/ml、化g/ml、0.4]ig/ml 的抽皮巧、新澄皮巧，4]ig/ml、0.化g/ml、0.04]ig/ ml辛弗林W及20化g/ml、2化g/ml、2]ig/ml实施例1~3处理4她。利用衰老染色试剂盒进行 beta-半乳糖巧酶染色。试验设置未经处理的正常对照，和仅经紫外照射而不采用提取处理 的模型组。
[0083] 实施例1~3中提取物对紫外照射成纤维细胞衰老模型的作用效果如表3所示。经 过紫外照射后，衰老的成纤维细胞增加。2~20化g/ml积实提取物处理，均能够显著降低成 纤维细胞的衰老(P<〇.01)，存在剂量依赖，并且积实提取物的抗衰老效果要优于抽皮巧、 澄皮巧、辛弗林。
[0084] 表3提取物对成纤维细胞衰老模型的影响
[0087] *与模型组比较，P<0.05;**与模型组比较，P<0.01。
[0088] 实施例6:对化化T细胞衰老模型的作用
[0089] 化化T(上海复祥生物科技有限公司提供)细胞经0.125%的膜酶消化，用含有10% FBS的DMEM终止消化，离屯、（1200rpm，IOmin)，用DMEM重悬，计数并接种铺盘。利用2-4代的 化化T细胞进行衰老实验。对2-4代的化化T细胞给予120mJ的UVB进行照射，然后加入相应的 受试物处理，照射后4她后利用衰老染色试剂盒进行beta-半乳糖巧酶染色，染色后计数阳 性细胞数。
[0090] 实施例1~3提取物对紫外照射化化T衰老模型的作用效果如表4所示。经过紫外照 射后，衰老的染色阳性角质形成细胞增加。经过积实提取物处理，均能够显著降低角质形成 细胞的衰老(P<〇.01)，同时积实提取物的抗衰老效果要优于抽皮巧、澄皮巧、辛弗林，积实 提取物的抑制作用具有剂量依赖。
[0091] 表4提取物对化化T衰老模型的影响
[0094] *，与模型组比较，P<0.05;**，与模型组比较，P<0.01。
[00%] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种枳实提取物，其特征在于，主要包括质量分数为17.35 %~29.27 %的柚皮苷、质 量分数为13.83 %~26.82 %的新橙皮苷和质量分数为1.69 %~3.03 %的辛弗林。2. 权利要求1所述枳实提取物的制备方法，包括将枳实饮片粉碎，以乙醇水溶液提取制 得枳实提取物； 所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30%~90% ; 所述提取的温度为20°C~70°C，提取的时间为lh~3h。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为 60% ;所述枳实饮片与乙醇水溶液的质量-体积比为1: (5~20)。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取的温度为50°C，提取的时间 为2h。5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述以乙醇水溶液提取后还包括干燥 的步骤;所述干燥的方法为真空薄膜浓缩;所述干燥的温度为20~60°C。6. 权利要求1所述枳实提取物在制备胶原蛋白表达促进剂中的应用。7. 权利要求1所述枳实提取物在制备MMP-1表达抑制剂中的应用。8. 权利要求1所述枳实提取物用于降低紫外线对细胞损伤。9. 权利要求1所述枳实提取物在制备抗衰老的产品中的应用。10. -种抗衰老的化妆品，其特征在于，包括权利要求1所述枳实提取物。
【专利摘要】本发明涉及植物提取领域，尤其涉及一种枳实提取物及其制备方法与在延缓皮肤衰老中应用。本发明中提供的提取方法针对抗衰老效果改善提取工艺参数，所制得的枳实提取物能够显著降低紫外对成纤维细胞和角质形成细胞的伤害，促进成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达，抑制MMP-1的表达，发挥延缓皮肤衰老的功效。本发明中的枳实提取物从表皮和真皮双管齐下达到延缓皮肤衰老的目的，弥补了对枳实保健功效的研究不足。为抗衰老食品、保健品、化妆品的开发，提供有力的支持。
【IPC分类】A61K31/7048, A61K8/41, A61K31/133, A61K8/97, A61K36/752, A61K8/60, A61P17/18, A61P17/16, A61Q19/08
【公开号】CN105662941
【申请号】CN201610019332
【发明人】华洋林, 魏晓丽, 寇忠京, 李泓颖, 唐健
【申请人】无限极（中国）有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月11日