观察细胞形态，确定细胞生长良好后，按实验分组用取样器每孔 加入相应液体各5μ1。每组4个复孔。
[0042] 2.4.3检测方法再经过24 h培养后，在96孔细胞培养板中加入MTT溶液10μ1继续 培养4 h。吸去培养液，加入与培养液相同量的DMSO。然后振荡IOmin，使结晶充分溶解。在酶 联免疫检测仪上测定光吸收值。
[0043] 2.4.4实验分组根据药物组合物细胞毒实验求出的药物组合物IC5q值，得出药物 组合物的IC5Q值所在的给药浓度范围。本实验IC5Q值所在的给药浓度范围在l-100μg/ml之 间。因此实验分组如下： 药物组合物组:取药物组合物组的中间浓度(50μg/ml); 药物组合物加西药组:取药物组合物组的中间浓度(50μg/ml)并加用西药； 西药组； 空白对照组(只加细胞培养液），共4个大组，每一组各4个复孔。
[0044] 2.4.5观察指标在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm，测定OD数值。并进 行形态学观察。
[0045] 2.4.6绘制细胞增殖抑制实验图表细胞存活率(％)=实验组光吸收值/对照组光 吸收值X 100%，对照组为只加等量的细胞培养液而不加任何药物。细胞增殖抑制率(％)=(1-细胞存活率）X 100%。以时间为横轴，以细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞增殖抑制实验图 表。
[0046] 2.5实验条件控制全部实验在遵义医学院中心实验室完成，细胞培养及相关检 测在其细胞培养室完成。
[0047] 2.6统计学处理方法方差分析两两差异比较用LSD-t检验，两者间比较用均数比 较。统计学软件应用MicrosoftExcel2000进行统计分析。
[0048] 3 结果 3.1不同浓度药物组合物对NCI-H446细胞的增殖抑制作用 人小细胞肺癌NCI-H446细胞在10，25, 50, 75，lOOμg/ml的5个浓度上，癌细胞呈现 出相应的变化：即随着药物组合物药物浓度的增高癌细胞数量明显减少。NCI-H446细胞在 低浓度25μg/ml时，细胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态。NCI-H446细胞在较 高浓度75μg/ml时，癌细胞呈卵圆形，梭形；核大、胞浆少；核仁不明显，核分裂不明显。NCI-H446细胞在较高浓度100μg/ml时，细胞数量继续减少，癌细胞呈结构不清。
[0049] 3.2同浓度药物组合物对NCI-H446细胞的增殖抑制率 药物组合物在10，25，50，75，lOOμg/ml各浓度和在24,48,72h这3个观测时间点与 空白组(培养基对照组)比较均有统计学差异。
[0050] 药物组合物组3次重复实验经过统计分析得到:P=O.456,即药物组合物3次重复实 验无统计学差异，说明实验具有可重复性。结果显示不同浓度药物组合物作用48h对NCI- H446细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着作用时间的延长抑制作用逐渐减弱，且随着给 药剂量的增大，抑制作用增强。药物组合物在2 4，4 8，7 2 h的抑制率分别达到6 3 . 18 %， 66.35%和35.24%。3次实验的药物组合物的最高抑制率分别达到66.35%，63.46%和58.37%。
[0051] 3.3四个给药组(药物组合物组、药物组合物加西药组、西药组、空白组)之间的比 较 3.3.1细胞形态学观察 药物组合物组选用的中间浓度(50μg/ml)。人小细胞肺癌NCI-H446细胞在4种不同给药 方式作用下呈现不同细胞形态。其中药物组合物加西药组在48h观察点上效果最明显，细胞 核完全固缩，核溶解，细胞轮廓难以辨认;其次是西药组，细胞呈现出细胞核固缩，核溶解， 细胞轮廓勉强可以辨认;再次是中药组，细胞呈现出偶尔有细胞核固缩，细胞轮廓清楚，细 胞数量最多癌细胞被相互积压而呈现出变形状态，癌细胞呈卵圆形，梭形但不规整;空白出 细胞存活状态良好，核大、胞浆少;核仁不明显，核分裂活跃，只是偶尔有衰老细胞增多。 [0052] 3.3.2不同给药方式对NCI-H446细胞的增殖抑制率 药物组合物组选用的中间浓度(50μg/ml)。药物组合物加西药组与药物组合物组;药物 组合物加西药组与西药组;药物组合物组与西药组;药物组合物组与空白组;药物组合物加 西药组与空白组；西药组和空白组的细胞抑制率有统计学差异。通过给药组间均数两两比 较:药物组合物加西药组优于药物组合物组;药物组合物加西药组优于西药组；西药组优于 药物组合物组;药物组合物组优于空白组;药物组合物加西药组优于空白组；西药组优于空 白组并有统计学差异。
[0053]结果表明，药物组合物在体外对人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞具有抑制作用，具 有潜在药用价值，值得进一步深入研究。
【主权项】
1. 一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量 份为： 狼萁草3080-3090重量份砧草2220-2230重量份三叶豆紫檀苷165-170重量份金鸡 菊噢210-216重量份穿心莲黄酮苷E180-200重量份。2. 根据权利要求1所述一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的 原料药的组成和重量份为： 狼萁草3085重量份砧草2225重量份三叶豆紫檀苷167重量份金鸡菊噢213重量份 穿心莲黄酮苷E190重量份。3. 根据权利要求1所述一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于药物组合物可以采用 制剂学的常规方法制备成片剂或胶囊剂或滴丸。4. 根据权利要求1所述一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于药物组合物与化学药 或中药组成的治疗肺癌药物。5. -种治疗肺癌的药物组合物的制备方法，其特征在于按如下步骤制备： 原料药的组成和重量份为:狼萁草3080-3090重量份砧草2220-2230重量份三叶豆紫 檀苷165-170重量份金鸡菊噢210-216重量份穿心莲黄酮苷E180-200重量份； 制备方法： (1) 按原料药配比取狼萁草、砧草、三叶豆紫檀苷、金鸡菊噢、穿心莲黄酮苷E，混匀，用 重量百分比浓度19%乙醇作为溶剂，在28.5°C温浸提取，提取次数为14次，每次提取时间为 22小时，每次溶剂用量为原料药总重量的22倍，滤过，得药渣A和提取液A，提取液A回收乙 醇，浓缩至相对密度1.08,滤过，药液通过D4020大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用重量百 分比浓度39.5%乙醇溶液洗脱D4020大孔吸附树脂柱，收集重量百分比浓度39.5%乙醇洗脱 液，回收乙醇，浓缩干燥，即得提取物A; (2) 取步骤（1)药渣A，用重量百分比浓度45%乙醇作为溶剂，加热回流提取9次，每次提 取时间为0.4小时，每次溶剂用量为药渣A重量的40倍，滤过，得药渣B和提取液B，提取液B回 收乙醇，浓缩至相对密度1.18,滤过，药液通过LK07大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用重量 百分比浓度66%乙醇溶液洗脱LK07大孔吸附树脂柱，收集重量百分比浓度66%乙醇洗脱液， 回收乙醇，浓缩干燥，即得提取物B; (3) 将提取物A和提取物B混匀，即得药物组合物。6. 根据权利要求5所述一种治疗肺癌的药物组合物的制备方法，其特征在于按如下步 骤制备： 原料药的组成和重量份为:狼萁草3085重量份砧草2225重量份三叶豆紫檀苷167重 量份金鸡菊噢213重量份穿心莲黄酮苷E190重量份； 制备方法： (1)按原料药配比取狼萁草、砧草、三叶豆紫檀苷、金鸡菊噢、穿心莲黄酮苷E，混匀，用 重量百分比浓度19%乙醇作为溶剂，在28.5°C温浸提取，提取次数为14次，每次提取时间为 22小时，每次溶剂用量为原料药总重量的22倍，滤过，得药渣A和提取液A，提取液A回收乙 醇，浓缩至相对密度1.08,滤过，药液通过D4020大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用重量百 分比浓度39.5%乙醇溶液洗脱D4020大孔吸附树脂柱，收集重量百分比浓度39.5%乙醇洗脱 液，回收乙醇，浓缩干燥，即得提取物A; (2) 取步骤（1)药渣A，用重量百分比浓度45%乙醇作为溶剂，加热回流提取9次，每次提 取时间为0.4小时，每次溶剂用量为药渣A重量的40倍，滤过，得药渣B和提取液B，提取液B回 收乙醇，浓缩至相对密度1.18,滤过，药液通过LK07大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用重量 百分比浓度66%乙醇溶液洗脱LK07大孔吸附树脂柱，收集重量百分比浓度66%乙醇洗脱液， 回收乙醇，浓缩干燥，即得提取物B; (3) 将提取物A和提取物B混匀，即得药物组合物。7. 根据权利要求5所述一种治疗肺癌的药物组合物的制备方法，其特征在于药物组合 物可以采用制剂学的常规方法制备成片剂或胶囊剂或滴丸。8. 根据权利要求5所述一种治疗肺癌的药物组合物的制备方法，其特征在于药物组合 物与化学药或中药组成治疗肺癌药物。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗肺癌的药物组合物及其制备方法，本发明药物组合物是以狼萁草、砧草、三叶豆紫檀苷、金鸡菊噢、穿心莲黄酮苷E为原料药，配比而成，可按常规制剂工艺制成各种剂型，治疗肺癌疗效显著。
【IPC分类】A61K31/7048, A61K31/352, A61K36/74, A61K31/343, A61P35/00
【公开号】CN105687393
【申请号】CN201610047085
【发明人】不公告发明人
【申请人】济南星懿医药技术有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月25日