补片取出置于新的孔中，同时重新加入400yL新鲜PBS缓冲液。收集旧孔中PBS缓冲液并测定其体积(V1)，用分光光度计在268nm下测定吸收值，并根据工作曲线计算其含有的淫羊藿苷浓度(C1),第一天释放的淫羊藿苷量为&￥1。在第2、4、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、38、43和48天之内重复此过程，将第N天收集的PBS缓冲液的体积和淫羊藿苷浓度分别记为Vn和CN，这个时间段内释放的淫羊藿苷量为(:?1累计释放量2&￥4~=1、2、4、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、38、43、48)，形成的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的淫羊藿苷释放曲线见图2。
[0021]由图2可见，不同层数的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片呈现类似的释放行为，在前2天药物有一个较高的释放量，之后淫羊藿苷的释放趋于平缓，并且此稳定释放行为能持续50天左右。单层补片的稳定药物释放量为0.3?0.4yg/cm2/day，双层补片的稳定药物释放量为0.6?0.8yg/cm2/day，可见淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的载药量稳定，药物释放只和补片的面积有关。
[0022]3、淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片体外生物学活性验证结果
[0023]3.1、细胞培养及传代:准备含有5?10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培养基作为培养液;将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-ElSubclone 14细胞置于5% 二氧化碳浓度、37°C的细胞培养箱中培养，培养液的用量为200yL/cm2，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，确保培养液的用量为200yL/cm2，当培养至MC3T3-ElSubcl0ne 14细胞汇合度大于90%时进行细胞传代，细胞传代的过程为:弃去旧的培养液，加入用量为200μ!7cm2的PBS缓冲液，清洗2?3次;然后加入用量为40?50yL/cm2的0.25%的胰酶，在37°C下孵育Imin;收集细胞并加入至离心管，在100rpm转速下离心2min;弃去上清，然后加入ImL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(I?2) X 14细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养;重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-ElSubclone 14细胞；
[0024]3.2、取汇合度为70?80%的MC3T3-ElSubclone 14细胞，加入至离心管，在100rpm转速下离心2min，弃去上清，再加入ImL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，然后根据计算得到的细胞密度将该细胞悬液稀释至I X 15细胞/mL的终浓度，即配制得到细胞悬液;按5 X 14细胞/孔的细胞密度将配制得到的稀释的细胞悬液均匀滴加在24孔板中，完成细胞种植，然后立即放入细胞培养箱中孵育;孵育4?6h后，取出植有细胞的24孔板，用I?2mL/cm2用量的培养液清洗2?3次，除去表面未黏附的细胞，之后以ImL/孔的用量加入新的培养液，最后将该植有细胞的24孔板置于细胞培养箱孵育；
[0025]3.3、淫羊藿苷-SIS补片活性测定:植有细胞的24孔板于细胞培养箱孵育16h后，从细胞培养箱中取出，弃去旧的培养液，将所有孔分为4组，分别加入培养基、培养基+SIS补片(transwell)、培养基+淫羊藿苷-SIS补片(transwell)和含I X 10—5M淫羊藿苷的培养基，每隔一天更换培养基。培养3天后，提取各组细胞的RNA，利用real-time RT-PCR技术测定OCN的表达量，OCN的表达越高说明成骨分化越强。图3为淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片体外生物学活性验证结果，图3中，control:对照培养基组；SIS:对照培养基+SIS补片(transwell)组;SIS+1C:对照培养基+淫羊藿苷-SIS补片(transwe 11)组;IC:含I X I O—5M淫羊藿苷的培养基组。从图3可见，单纯SIS组的OCN表达与对照组类似，没有成骨促进作用，载药补片组的OCN表达与直接在培养基加入淫羊藿苷的效果类似，有明显促成骨分化作用。
[0026]4、淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片在小鼠体内的成骨验证
[0027]将实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片具体应用于小鼠头盖骨缺失模型骨修复，具体实验过程为:选择实验对象:选取5只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象，建立头盖骨缺失模型:在小鼠头盖骨两侧部位用Miltex公司生产的B1psy Punch设备移去直径为4mm的骨组织，然后在一侧缺失处植入淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，另一处植入空白作为对照;手术缝合后小鼠正常饲养8周后处死，取得头盖骨组织进行如下体内成骨状况分析:
[0028]4.1、组织学结果:对比无植入物的空白对照骨的HE染色结果和实施例一的载药补片组的HE染色结果可见，在空白对照骨缺失处，8周后几乎没有新生骨，而在植入本实用新型复合工程骨的位置，出现了较多的包含血管、髓腔的成熟新生骨组织，且骨桥几乎覆盖了一半缺失区域；
[0029]4.2、统计学计算结果:采用NIH软件Imagej对小鼠骨缺失处的新生骨面积比例进行计算，每个样品取5张不同截面的切片，通过统计学分析发现空白组中新生骨面积比例为4.7% ±5.9% (Mean土S.D.)，而实验组中新生骨面积比例为29.9% ±16.4% (Mean土
S.D.)，两者具有显著差异(p〈0.001)，证明本实用新型淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片在体内骨修复过程中效果显著。
【主权项】
1.淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，其特征在于该补片的微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷，所述的SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构，所述的淫羊藿苷为颗粒状，所述的淫羊藿苷附着于所述的SIS胶原纤维骨架上。2.根据权利要求1所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，其特征在于所述的淫羊藿苷的颗粒度为0.3?5 μ??。3.根据权利要求2所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，其特征在于所述的淫羊藿苷的颗粒度为0.3?0.6 μπι。4.根据权利要求2所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，其特征在于所述的淫羊藿苷的附着量为20~80 yg/cm20
【专利摘要】本实用新型公开的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷，SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构，淫羊藿苷为颗粒状，淫羊藿苷附着于SIS胶原纤维骨架上；本实用新型淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片，在SIS胶原纤维骨架上附着颗粒状的淫羊藿苷，建立稳定的药物释放体系，将SIS胶原纤维骨架和淫羊藿苷这两个极具潜力的骨组织工程元素结合起来，形成的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片复合材料可靠、稳定，对淫羊藿苷安全、经济、化学性质稳定及优异的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用，该淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片是一种载药补片，具有极强的促骨再生能力，在骨再生领域具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61L27/54, A61L27/24, A61L27/50
【公开号】CN205235020
【申请号】CN201521037004
【发明人】赵基源, 李梅, 陈梦洁, 谷俏俏, 陈松娣, 罗钫妙, 张迟
【申请人】宁波大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月14日