一种漂白复合酶及其制备方法

一种漂白复合酶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种漂白复合酶及其制备方法，以耐高温碱性木聚糖酶为主要原料，科学复配嗜热芽孢杆菌培养物、漆酶及其介质、葡聚糖酶、EDTA、保护剂、激活剂、甘露糖酶、脂肪酶、单宁酶、果胶酶、白度稳定剂、非离子表面活性剂、抗氧化剂等，在完全保留纸浆纤维素的同时，最大限度地溶出木质素并将其降解，制备了一种酶系全、漂白效果好、易保存、储存稳定性好的漂白复合酶，对阔叶木、针叶木和芦苇黄浆可显著提高纸浆产量和质量，白度分别提高10.94％、11.97％和11.10％；返黄值分别降低39.84％、37.31％和24.32％；可节约常规化学用品量50-60％；最终达到降低成本和保护环境的目的。
【专利说明】一种漂白复合酶及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及造纸用复合酶，具体涉及一种漂白复合酶及其制备方法。

【背景技术】
[0002] 在工业生产中，制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木质素，为使 溶解制浆纤维素纯度达到98%，这就需要大量的氢氧化钠处理纸浆，造成了严重的环境污 染，为此许多学者转而尝试生物处理制浆，而用于制浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。 冯建良等（Kimura et al. 2000)用木聚糖酶预处理麦草与常规化学法制浆进行了比较试 验，木聚糖酶预处理提高了原料的脱木素程度，还可以降低制浆的卡伯值。木聚糖酶在辅 助漂白方面有较广泛而深入的研宄，且取得了很大成果。研宄发现，无论是针叶木浆、阔叶 木浆或是竹浆、草浆，木聚糖酶均可以降解纸浆中残余的木质素，提高了白度（AL BALAA et al, 2006 ;Meek and Lipman, 1922)。用于纸衆漂白的木聚糖酶必须具有耐高温特点，Khasin 等得到了一个来源于碱性菌株Bacillus sterarothermophilus T26木聚糖酶，该木聚糖酶 在pH 9.0及65°C时对纸浆有最好的漂白效果（Khasin et al，1993)，很多木聚糖酶不具备 这样的特点，限制了商业化应用。全世界每年产生的废纸数量是惊人的，废纸回收后再利用 工作就变得尤为重要了，可以使在资源重复利用的同时也保护了环境。1991年，由韩国学者 首次报道了应用木聚糖酶能将油墨从新闻废纸浆中脱除。此后，人们开始研宄利用木聚糖 酶进行废纸脱墨，以减轻或消除化学脱墨带来的环境污染（曹军卫等，2004)。
[0003] 目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各 国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美洲的30余 家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中加拿大有约10% 的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制 剂厂商，纷纷推出了专门用于制浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业 上应用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50°C左右，众所周 知，纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖 酶产品在此领域的应用受到极大的限制。
[0004] 但是，由于木聚糖酶处理工艺是通过降解除去纸浆表面再沉积的半纤维素等方式 来帮助化学漂剂漂白的，木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化学漂剂。因此，生 物预漂白并不能完全替代化学漂白，能减少污染却不能最终消除污染，要从根本上消除有 氯漂白液的污染，需最终实现生物漂白，即完全采用生物手段除去纸浆中残留的木质素，因 为木质素的存在是纸浆返黄的根本原因，化学漂白可直接作用木质素而破坏纸浆中的发色 基团。木素酶可直接作用于木质素，对木质素进行降解，主要为白腐菌分泌的木素过氧化物 酶、锰过氧化物酶、漆酶和纤维二糖脱氢酶等，近几年研宄的热点主要集中在漆酶的生物漂 白上，漆酶是一种多铜氧化酶，也称多酚氧化酶，主要氧化含酚的木质素结构单位，但天然 木材木质素只有少于20%的含酚结构单位，另通常真菌漆酶分子量较大（约为70000Da)难 以穿入木头中作用木质素分子，要想充分发挥其酶活性，必须添加漆酶介质，通常为紫尿 酸（VA)和1-羟基苯并三氮唑（HBT)，视不同漂白工艺而选用，并且漆酶的产量较小、稳定性 较差。
[0005] 中国专利CN 102978986 A公开了一种生物酶法制备纸浆的方法，所述生物酶制备 液中生物酶组分的质量百分比含量为：纤维素酶20%，半纤维素酶10%，木素降解酶10%， 淀粉酶20%，脂肪酶5%，果胶酶和漆酶20% ;其中的纤维素酶会降解纸浆中的有效成分纤 维素，不易控制，严重影响成纸的物理机械性能，同时，上述生物酶适用于制浆工艺，而非漂 白工艺，并且，单一使用漆酶，其酶活力很难发挥，不能很好作用于木质素，纸浆返黄可能性 增大。中国专利CN 103555701 A公开了一种纸浆漂白用复合酶液的生产方法，其特征是将 各组份酶经称量、复配罐混合配制、防腐、检验、包装后存放于5°C库房中，所述各组份酶为 碱性果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和木质素酶；上述复合酶液酶种类和特性单一、木质素 酶活力低且没有公开木质素酶的具体种类，工业化难于实现，还是不能从根本上彻底消除 木质素，漂白效果仍不理想，并且不易保存、储存稳定性差，商品化应用受限。
[0006] 综上，制备一种酶系全、漂白效果好、易保存、储存稳定性好的纸浆漂白酶具有广 阔的市场前景和巨大的市场潜在价值。


【发明内容】

[0007] 本发明所解决的技术问题是克服现有纸浆漂白酶的缺陷，以耐高温碱性木聚糖酶 为主要原料，科学复配嗜热芽孢杆菌培养物、漆酶及其介质、葡聚糖酶、EDTA、保护剂、激活 剂、甘露糖酶、脂肪酶、单宁酶、果胶酶、白度稳定剂、非离子表面活性剂、抗氧化剂等，制备 一种酶系全、漂白效果好、易保存、储存稳定性好的纸浆漂白酶，在完全保留纸浆纤维素的 同时，最大限度地溶出木质素并将其降解，从根本上降低纸浆中木质素含量，增强脱木素效 果，同时适度复配白度稳定剂，可弥补生物漂白的不足，力争达到永久漂白，防止纸浆返黄， 提高成纸的产量和质量，以推进生物漂白在造纸工业的应用进程，最终达到降低成本和保 护环境的目的。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种漂白复合酶，由以下重量份数的原料制备：
[0010] 碱性木聚糖酶10-20份，嗜热芽孢杆菌培养物8-10份，漆酶8-10份，葡聚糖酶5-8 份，1-羟基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份，保护剂4-7份，激活剂4-7份，甘露糖酶4-6 份，脂肪酶3-5份，单宁酶3-5份，果胶酶3-5份，白度稳定剂2-5份，非离子表面活性剂2-4 份，抗氧化剂1 _3份。
[0011] 所述碱性木聚糖酶和嗜热芽孢杆菌培养物是由产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽 孢杆菌（Bacillus thermophilus) 701 (保藏编号为CCTCC M 2013537)为出发菌株，并通过 优化培养基组成和发酵工艺而制备；
[0012] 所述碱性木聚糖酶耐高温、耐碱性强、作用条件宽泛、不具有纤维素酶活性，更加 适合纸浆的生物漂白和化学助漂；
[0013] 所述耐高温碱性木聚糖酶的酶学性质如下：
[0014] (1)温度：该酶温度适应范围较宽，适用温度范围为40-75°C，最适反应温度65°C， 在75 °C酶活完全稳定；
[0015] (2) pH :该酶适用反应pH值范围为5. 0-11. 0,在pH值为11. 0时酶活完全稳定，最 适反应pH值为10. O ;
[0016] (3)酶活性：发酵液碱性木聚糖酶酶比活力较高，为350-420IU/ml ;
[0017] (4)热稳定性：该酶在70°C条件下保存Ih后仍能保持80 %以上酶活，75°C条件下 保存Ih后保持70%以上酶活；
[0018] (5)存储稳定性：该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于3. 0%。
[0019] 优选地，所述耐高温碱性木聚糖酶的制备方法如下：将保存完好的嗜热芽孢杆 菌CCTCC M 2013537的斜面菌种经活化和逐级扩大培养（包括一、二、三级种子培养以及 一级种子罐培养）得到种子液，以6%接种量接入发酵罐，培养温度37-45°C，搅拌速度 200-700rpm，通风量（V/V)l:l-3,培养时间25-30h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温至 15-20°C，恒温培养10_12h ;继续以1-2°C /h降温速率缓慢降温至8-10°C，此时，将一级种 子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养7-12h ;最后以1-2°C /h升温速率缓慢 升温至15-20°C，恒温培养10_12h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢升温至37-45°C，恒温培 养20-30h ;发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木聚糖酶，所述调配过程加 入浓缩酶液总重量0. 5-5%中草药粉剂；
[0020] 所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2_5g，琼脂 15-20g，中草药粉剂 5-10g，蒸馏水 lOOOmL，pH 值 5-11，121°C灭菌 20min ;
[0021] 所述中草药粉剂的制备方法如下：以重量份数计，称取黄芪20-30份，党参10-18 份，柴胡10-15份，黄芩10-15份，鱼腥草8-12份，当归8-10份；分别将上述中草药粉碎至 粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C?90°C 保持2?4h，然后降温至45-60 °C，加入混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为5. 5-6. 8,酶解 2_4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C?78°C保持 3?4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0022] 所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ;
[0023] 所述混合酶的重量份数组成为：内β -葡聚糖酶10-20份，夕卜β -葡聚糖酶10-20 份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份， β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份， 葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0024] 所述乙醇和丙醇的质量比例为I :1-1. 5 ;
[0025] 所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
[0026] 酵母粉0. 3-0. 5%，葡萄糖1-1. 5%，蛋白胨0. 3-0. 5%，牛肉膏0. 5-0. 8%，磷酸氢 二钾0.8-1. 5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙0. 1%，氯化镁0.2%，柠檬酸 钠0· 1-0. 3%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123°C灭菌30-40min ;
[0027] 所述种子罐培养基重量组成为：
[0028] 麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0. 8%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白 胨0. 1-0. 5%，玉米浆0. 1-0. 5%，磷酸氢二钾0.8-1. 5%，硫酸镁0.05-0. 1%，柠檬酸 钠0. 1-0. 5%，桦木木聚糖0. 1-0. 8%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123°C灭菌 3〇-40min ；
[0029] 所述种子罐发酵液菌体浓度为7. Ox 108-8. Ox IO8个/ml ;
[0030] 所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草 药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，桦木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米浆l-5g，硫酸铵l-3g， 磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，梓檬酸钠 l-5g，消泡剂0. 1-lg,纯净水lOOOmL，pH值 5-11，121°C 灭菌 20min ;
[0031] 所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉 米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值5-11，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀 粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70°C保温15-30min，然后缓慢升温至90°C 保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH5-ll，121-123°C灭菌 30_40min 备用。
[0032] 所述嗜热芽孢杆菌培养物含有较强的生物活性，在生物漂白过程中通过发酵一方 面可产生耐高温碱性木聚糖酶，为体系持续提供，另一方面是通过发酵的动态反应可使嗜 热芽孢杆菌均匀、充分地分散到纸浆纤维素、半纤维素和木质素间质，充分柔化纤维素和降 解半纤维素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使复合酶的其它成分（如漆酶、介质等酶制剂、螯 合剂、保护剂、激活剂、白度稳定剂等）均匀、充分地渗透到纸浆植物细胞间质，充分发挥组 份的作用，以提高纸浆收得率和质量，缩短漂白时间，并去除杂质和增强生物漂白效果；
[0033] 优选地，所述嗜热芽孢杆菌培养物的制备方法为上述制备碱性木聚糖酶的发酵液 经减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎而得到的；
[0034] 所述嗜热芽孢杆菌培养物活菌含量为7Χ101(ι-9 Χ101(^Ρυ/^。
[0035] 所述1-羟基苯并三氮唑可激活大分子漆酶的活力，形成强氧化作用的复合介体， 提高漆酶的酶解效力，充分发挥漆酶对木质素的降解作用，从根本上消除木质素，防止纸浆 返黄。
[0036] 所述EDTA可螯合纸浆中大部分过渡金属离子（铜离子、二价铁离子、三价铁离子、 二价锰离子、二价镍离子等）和微量重金属，以排除其对生物酶酶活力的抑制和消除作用， 使酶组份充分、有效地发挥作用；
[0037] 所述白度稳定剂具有漂白和稳定白度的双重作用，既可有效提高纸浆白度，又可 防止纸浆返黄，并且不会受纸浆中氧气和过渡金属离子（铜离子、二价铁离子、三价铁离 子、二价锰离子、二价镍离子等）的影响，白度稳定剂的使用可有效弥补生物漂白后残留木 质素引起的纸浆返黄；
[0038] 所述白度稳定剂为硫醇、硫醚、三羟甲基磷酸（ΤΗΡ)、四羟甲基磷酸盐（THPC)、三 羟甲基磷酸的双磷衍生物（BBHPE)中的一种或几种以任意比例均匀混合；
[0039] 优选地，所述白度稳定剂为三羟甲基磷酸的双磷衍生物（BBHPE);
[0040] 所述非离子表面活性剂在酶漂白过程中可促进复合酶组份渗透，充分游离木质 素、半纤维素、果胶、单宁、脂肪、等底物，促进和延长各组份酶与底物的作用时间，使纸浆中 的有害成分充分降解，提高纸浆纤维的柔滑性和漂白均匀度；
[0041] 优选地，所述非离子表面活性剂为环保型非离子表面活性剂，容易生物降解，无残 留，对人体、生物及环境无任何毒副作用；
[0042] 更优选地，所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷（APG) 30-40份，烷基 葡萄糖酰胺（AGA) 15-20份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠（ED3A) 10-15份，异构醇醚羧酸盐 AEC-110710-15份，月桂酰胺醚羧酸盐（LAEC) 8-10份，平平加 c-1253-5份，JFC 3-5份；上 述原料均为市购固体粉状商品。
[0043] 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠15-18份，氯化锌 6-8份，氯化儀5_8份，氯化1? 3_5份。
[0044] 所述保护剂由以下重量份数的原料组成：海藻糖30-50份，灵芝多糖12-18份， NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
[0045] 所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几 种组合；
[0046] 优选地，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比 3-5:1-3:1-2均匀混合；
[0047] 所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物均为市购商品
[0048] 上述漂白复合酶的制备方法，包括如下步骤：
[0049] 首先将所述保护剂、激活剂分别超微粉碎，均匀混合，随后立即依次加入非离子表 面活性剂、嗜热芽孢杆菌培养物均匀混合20-30min，然后依次加入碱性木聚糖酶、漆酶、葡 聚糖酶、甘露糖酶、脂肪酶、单宁酶、果胶酶均匀混合，最后依次加入1-羟基苯并三氮唑、 EDTA、白度稳定剂、抗氧化剂，混合均匀后密封包装即得漂白复合酶。
[0050] 本发明另一目的是所述漂白复合酶在造纸生物漂白工艺中的应用。
[0051] 使用方法：
[0052] 1.复合酶在黄浆氯化前或氯化后或碱化后加入被漂黄浆中；
[0053] 2.复合酶作用条件：适应pH值5-11，最适pH值7-9,适应温度40-70°C，最适反应 温度 45-55 °C ;
[0054] 3.使用方法：1)将复合酶与50°C水按质量比1:10均匀混合，调整pH值为7-9,活 化20-30min，通过计量泵加入被漂黄浆中，使其与黄浆混合均匀进行酶解反应；
[0055] 2)复合酶的添加量占绝干黄浆质量的0. 05-0. 3 % ;
[0056] 3)黄浆的浓度为5-15 % ;
[0057] 4)酶解时间35-60min，酶解完成后，其化学漂白按常规工艺步骤进行，各步骤化 学品用量为常规用量的40-50 %。
[0058] 所述的黄浆为造纸原料经备料、制浆、洗涤、筛选后制成的黄浆；
[0059] 所述的黄浆为木浆或非木浆中的一种或组合；
[0060] 所述的非木浆由原料麦草或稻草或芦苇或蔗渣制备；
[0061] 所述复合酶在氯化前加入时，复合酶的添加量占绝干黄浆质量的0. 15-0. 3 % ;复 合酶在氯化后加入时，复合酶的添加量占绝干黄浆质量的〇. 1-0. 15 % ;复合酶在碱化后加 入时，复合酶的添加量占绝干黄浆质量的〇. 05-0. 1 %。
[0062] 有益效果：
[0063] 本发明漂白复合酶以耐高温碱性木聚糖酶为主要原料，科学复配嗜热芽孢杆菌培 养物、漆酶及其介质、葡聚糖酶、EDTA、保护剂、激活剂、甘露糖酶、脂肪酶、单宁酶、果胶酶、 白度稳定剂、非离子表面活性剂、抗氧化剂等，制备一种酶系全、漂白效果好、易保存、储存 稳定性好的纸浆漂白酶，在完全保留纸浆纤维素的同时，最大限度地溶出木质素并将其降 解，从根本上降低纸浆中木质素含量，增强脱木素效果，同时适度复配白度稳定剂，可弥补 生物漂白的不足，以达到永久漂白，防止纸浆返黄，提高成纸的产量和质量，与市售纸浆漂 白专用酶相比，本发明漂白复合酶对阔叶木、针叶木和芦苇黄浆可显著提高纸浆产量和质 量：得率分别提高8. 94%、8. 80%和10. 05% ; α -纤维素含量分别提高8. 58%、9. 49%和 16. 41% ;白度分别提高10. 94%、11. 97%和11. 10% ;返黄值分别降低39. 84%、37. 31 %和 24. 32%;粘度分别降低I. 20%、1. 18%和1. 43%;灰分分别降低25%、26%和28%，可节约 常规化学用品量50-60% ;从而推进生物漂白在造纸工业的应用进程，最终达到降低成本和 保护环境的目的，其有益效果是复合酶各组份协同作用的综合体现，具体表现在：
[0064] 1.本发明的碱性木聚糖酶耐高温、耐碱性强、作用条件宽泛、不具有纤维素酶活 性，更加适合纸浆的生物漂白和化学助漂。
[0065] 2.本发明的嗜热芽孢杆菌培养物含有较强的生物活性，在生物漂白过程中通过发 酵一方面可产生耐高温碱性木聚糖酶，为体系持续提供，另一方面是通过发酵的动态反应 可使嗜热芽孢杆菌均匀、充分地分散到纸浆纤维素、半纤维素和木质素间质，充分柔化纤维 素和降解半纤维素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使复合酶的其它成分（如漆酶、介质等酶 制剂、螯合剂、保护剂、激活剂、白度稳定剂等）均勾、充分地渗透到纸浆植物细胞间质，充 分发挥组份的作用，以提高纸浆收得率和质量，缩短漂白时间，并去除杂质和增强生物漂白 效果。
[0066] 3.本发明将漆酶及其介质1-羟基苯并三氮唑科学复配，形成强氧化作用的复合 介体，提高漆酶的酶解效力，充分、有效地实现漆酶对木质素的降解作用，从根本上消除木 质素，防止纸浆返黄。
[0067] 4.本发明使用EDTA可螯合纸浆中大部分过渡金属离子（铜离子、二价铁离子、三 价铁离子、二价锰离子、二价镍离子等）和微量重金属，以排除其对生物酶酶活力的抑制和 消除作用，使酶组份充分、有效地发挥作用。
[0068] 5.本发明白度稳定剂具有漂白和稳定白度的双重作用，既可有效提高纸浆白度， 又可防止纸浆返黄，并且不会受纸浆中氧气和过渡金属离子（铜离子、二价铁离子、三价铁 离子、二价锰离子、二价镍离子等）的影响，白度稳定剂的使用可有效弥补生物漂白后残留 木质素引起的纸浆返黄。
[0069] 6.本发明非离子表面活性剂主要科学复配了环保型性能优越的非离子表面活性 剂，容易生物降解，无残留，对人体、生物及环境无任何毒副作用；可在酶漂白过程中可促进 复合酶组份渗透，充分游离木质素、半纤维素、果胶、单宁、脂肪、等底物，促进和延长各组份 酶与底物的作用时间，使纸浆中的有害成分充分降解，提纸浆纤维的柔滑性和漂白均匀度。
[0070] 7.本发明漂白复合酶抗氧化剂的科学复配，可有效防止复合酶酶分子结构氧化而 造成酶活性损失，提高酶活力稳定性。在〇°C和40°C条件下储存12个月，复合酶中单酶酶 活损失分别为〇. 41 %和0. 56%，比对比例分别降低18. 0%和65%，有效防止在包装、储存、 运输、使用等环节因环境改变、操作方法不当而造成酶的失活，尤其可防止高温造成的酶失 活。
[0071] 8.本发明漂白复合酶中保护剂的科学复配，有效减缓了复合酶制剂的回潮；同时 可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20_30°C，耐冷冻温 度可降低10-15摄氏度，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长 了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，比同类产品保质期可延长2-3年。
[0072] 9.本发明漂白复合酶添加无机盐作为激活剂，创造了酶催化作用的最佳条件，充 分发挥了植物酶和微生物酶的活力，提高了复合酶作用效力。

【具体实施方式】
[0073] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。
[0074] 实施例1原料制备
[0075] 1.碱性木聚糖酶的制备：包括如下步骤
[0076] (1)菌种活化
[0077] 将保存完好的嗜热芽孢杆菌CCTCC M 2013537的斜面菌种接种于斜面培养基， 45°C培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
[0078] 所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g，琼脂 20g，中草药粉剂10g，蒸馏水1000mL，pH值10,121°C灭菌20min ;
[0079] 所述中草药粉剂的制备方法如下：
[0080] 以重量份数计，称取黄芪25份，党参15份，柴胡12份，黄芩12份，鱼腥草10份， 当归9份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍 重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至55°C，加入混合物料总重量8%的混合酶进行 酶解，用乳酸调节PH值为6,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙 醇和丙醇的质量比例为I : 1. 5,控制温度至70°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获 得中草药粉剂；
[0081] 所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份， β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β -淀粉酶12份， 中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶 8份；
[0082] (2)液体种子扩大培养
[0083] ①一级种子培养：将步骤（1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基 装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度43°C，培养时间15h ;
[0084] ②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0085] ③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度43°C，培养时间15h ;
[0086] ④一级种子罐培养：将三级种子以10 %接种量接入总容积为150L的一级种子罐， 发酵培养基装量100L，培养温度45°C，搅拌速度400rpm，通风量（V/V) 1:2,罐压0. 05Mpa， 培养时间20h ;
[0087] 所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
[0088] 酵母粉0. 5%，葡萄糖1. 5%，蛋白胨0. 5%，牛肉膏0. 8%，磷酸氢二钾1. 5%，中草 药粉剂2 %，海藻糖3 %，硫酸钙0. 1 %，氯化镁0. 2 %，柠檬酸钠0. 3 %，不足部分纯净水补 足，pH 值 10,123°C灭菌 40min ;
[0089] 所述种子罐培养基重量组成为：
[0090] 麦芽糊精15%，酵母粉0. 8%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，蛋白胨0. 5%，玉米浆 0. 5 %，磷酸氢二钾1. 5 %，硫酸镁0. 1 %，柠檬酸钠0. 5 %，桦木木聚糖0. 8 %，不足部分纯净 水补足，pH值10,123°C灭菌40min ;
[0091] 所述种子罐发酵液菌体浓度为8. Ox IO8个/ml ;
[0092] (3)发酵罐发酵
[0093] 将步骤（2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度45°C，搅拌速 度700rpm，通风量（V/V) 1:3,培养时间30h ;然后以2°C /h降温速率缓慢降温至20°C，恒温 培养12h ;继续以2°C /h降温速率缓慢降温至10°C，此时，将步骤（2)中一级种子罐发酵液 以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至20°C，恒 温培养12h ;继续以2°C /h升温速率缓慢升温至45°C，恒温培养30h ;
[0094] 溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30% ;
[0095] pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在10 ;
[0096] 补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养 基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ;
[0097] 放罐标准：80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；
[0098] 所述发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g， 海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g， 桦木木聚糖15,消泡剂lg，纯净水lOOOmL，pH值10,121°C灭菌20min ;
[0099] 所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精20-30 %，玉米粉10-20 %，豆粉15-25 %， 中草药粉剂5-10%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123°C灭菌30-40min ;
[0100] 所述发酵培养基的调配方法为：
[0101] 按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH 值10,加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温 至70°C保温30min，然后缓慢升温至90°C保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均 勾，调初始pH值10,123°C灭菌40min备用。
[0102] (4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木聚糖酶；
[0103] 所述调配过程不添加任何防腐剂，加入浓缩酶液总重量5%中草药粉剂。
[0104] 2.嗜热芽孢杆菌培养物的制备：所述嗜热芽孢杆菌培养物的制备方法为上述 1中制备碱性木聚糖酶的发酵液经减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎而制得，其活菌含量为 9xl010CFU/g〇
[0105] 实施例2耐高温碱性木聚糖酶酶活力的测定（3, 5-二硝基水杨酸比色法，简称 DNS 法）
[0106] 1.试剂和溶液
[0107] I. 1所用水除特别要求外，均为符合GB/6682-1992规定的三级水，化学药品除 特别要求外，均为分析纯。
[0108] 1.2DNS 试剂
[0109] 称取3, 5-二硝基水杨酸IOg加入500ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌 溶解（温度< 45°C )，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至 1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用（如有沉淀过滤后使用）。
[0110] 1. 30. lmol/L，pH5. 0醋酸一醋酸钠缓冲液
[0111] 吸取冰醋酸I. 8ml，加适量水，加醋酸钠5. 78g，溶解，定容至1000ml，调节PH至 5. 00 ±0.01后使用。室温下存放2个月有效。
[0112] L 40. 1 %即lmg/ml木糖标准溶液
[0113] 无水木糖于80°C烘至恒重，称取0. IOOOg于烧杯中，加适量水溶解，转入容量瓶 中并定容至l〇〇ml。
[0114] 1.51.0%木聚糖溶液
[0115] 称取木聚糖I. OOg于烧杯中，用2ml 0. 5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40ml缓冲 液，于60?70°C水浴中加热溶解，冷凉后用0. 5mol/L醋酸（约2ml)调pH5. 0,转入容量瓶 中，加缓冲液（4. 3)定容至100ml。如果冰箱中放置时间长了出现沉淀，使用前应在热水浴 中热溶。
[0116] 1.6木糖标准曲线的绘制
[0117] 吸取lmg/ml木糖溶液0, 0· 2,0· 4,0· 6,0· 8,1. Oml于试管中，补水至2ml，加 DNS试 剂3ml，混合后于沸水中煮IOmin,冷却后定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光 度（A)。以吸光度为纵坐标，木糖量为横坐标，绘制标准曲线，三次重复试验的均值用最小 二乘法拟合一元线性方程y = ax + b，求出吸光度与木糖量的关系。
[0118] 2.待测酶样品的处理
[0119] 直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0. 25 - 0. 4范围内。
[0120] 3.酶活力测定
[0121] 取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底 物（吸取前摇匀）（1. 5)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，50°C水解 IOmin.
[0122] 反应步骤及试剂、溶液用量见表1 :
[0123] 表1反应步骤及试剂、溶液用量
[0124]

【权利要求】
1. 一种漂白复合酶，由以下重量份数的原料制备：碱性木聚糖酶10-20份，嗜热芽孢杆 菌培养物8-10份，漆酶8-10份，葡聚糖酶5-8份，1-羟基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份， 保护剂4-7份，激活剂4-7份，甘露糖酶4-6份，脂肪酶3-5份，单宁酶3-5份，果胶酶3-5 份，白度稳定剂2-5份，非离子表面活性剂2-4份，抗氧化剂1-3份； 所述碱性木聚糖酶和嗜热芽孢杆菌培养物均由产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆 菌CCTCC M 2013537为出发菌株，并通过优化培养基组成和发酵工艺而制备； 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠15-18份，氯化锌6-8 份，氯化镁5-8份，氯化1? 3-5份； 所述保护剂由以下重量份数的原料组成：海藻糖30-50份，灵芝多糖12-18份，NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
2. 如权利要求1所述的一种漂白复合酶，其特征在于，所述耐高温碱性木聚糖酶的 制备方法如下：将保存完好的嗜热芽孢杆菌CCTCC M 2013537的斜面菌种经活化和一、 二、三级种子培养以及一级种子罐培养得到种子液，以6%接种量接入发酵罐，培养温度 37-45°C，搅拌速度 200-700rpm，通风量（V/V)l:l-3,培养时间 25-30h;然后以 1-2°C / h降温速率缓慢降温至15-20°C，恒温培养10_12h ;继续以1-2°C /h降温速率缓慢降温至 8-10°C，此时，将一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养7-12h ;最后以 1-2°C /h升温速率缓慢升温至15-20°C，恒温培养10_12h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢 升温至37-45°C，恒温培养20-30h ;发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木 聚糖酶。
3. 如权利要求1所述的一种漂白复合酶，其特征在于，所述嗜热芽孢杆菌培养物活菌 含量为 YxKT-gxKTCFU/g。
4. 如权利要求1所述的一种漂白复合酶，其特征在于，所述白度稳定剂为硫醇、硫醚、 三羟甲基磷酸、四羟甲基磷酸盐、三羟甲基磷酸的双磷衍生物中的一种或几种以任意比例 均匀混合。
5. 如权利要求1所述的一种漂白复合酶，其特征在于，所述非离子表面活性剂为环保 型非离子表面活性剂。
6. 如权利要求1所述的一种漂白复合酶，其特征在于，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青 素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合。
7. 如权利要求1-6任一所述的一种漂白复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤：首先将所述保护剂、激活剂分别超微粉碎，均匀混合，随后立即依次加入非离子表面活 性剂、嗜热芽孢杆菌培养物均匀混合20-30min，然后依次加入碱性木聚糖酶、漆酶、葡聚糖 酶、甘露糖酶、脂肪酶、单宁酶、果胶酶均匀混合，最后依次加入1-羟基苯并三氮唑、EDTA、 白度稳定剂、抗氧化剂，混合均匀后密封包装即得漂白复合酶。
8. 如权利要求7所述的一种漂白复合酶的制备方法，其特征在于，所述白度稳定剂为 三羟甲基磷酸的双磷衍生物。
9. 如权利要求7所述的一种漂白复合酶的制备方法，其特征在于，所述非离子表面活 性剂的质量组份为：烷基多苷30-40份，烷基葡萄糖酰胺15-20份，N-十二烷基乙二胺三 乙酸钠10-15份，异构醇醚羧酸盐AEC-110710-15份，月桂酰胺醚羧酸盐8-10份，平平加 c-1253-5 份，JFC 3-5 份。
10.如权利要求7所述的一种漂白复合酶的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂为葡 萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比3-5:1-3:1-2均匀混合。
【文档编号】D21C9/10GK104499337SQ201410715635
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月30日 优先权日:2014年11月30日
【发明者】邵素英 申请人:邵素英