用于磁共振成像(mri)的含有具有多羟基化取代基的螯合部分的高弛豫造影剂的制作方法

专利名称：用于磁共振成像(mri)的含有具有多羟基化取代基的螯合部分的高弛豫造影剂的制作方法
本申请要求保护2004年7月2日提交的临时申请U.S.S.N.60/585,181的权益，引用在此作为参考。
本发明涉及诊断成像领域，涉及新颖的具备高弛豫(relaxivity)的造影剂。更确切地，涉及能够螯合顺磁性金属离子的化合物、其与所述金属离子的螯合配合物和它们作为非特异性造影剂在磁共振成像(MRI)中的用途。
背景技术：
MRI中的造影基本上由于水质子弛豫时间的差异，利用能够催化水质子弛豫过程的化学品能够增强之。一类最重要的MRI造影剂以Gd(III)螯合物为代表，它们目前用在约1/3的临床试验中。为了被视为潜在有价值的MRI造影剂，Gd(III)配合物必须显示较高的热力学(和可能的动力学)稳定性，目的是确保没有游离Gd(III)离子和配体的释放，二者已知对活的生物体是有毒的。因此，已知的螯合性化合物、包括八齿配体，例如二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)和它们的衍生物，已被考虑用于Gd(III)离子的螯合。这些配体包裹这种镧系(III)离子，留出一个结合位点可供一个水分子配位。因而，配位水质子显示非常短的弛豫时间(T1M)，它被快速交换过程转移至“本体(bulk)”水分子(Kex＝1/τM)。关于一般参考文献，参见Aime S.；Botta M.；Fasano，M.；Terreno，E.Chem.Soc.Rev.1998，27，19-29。
就弛豫增强性质而言，顺磁性Gd(III)配合物是以其弛豫(r1p)为特征的，它代表Gd(III)水溶液的质子弛豫率相较于净水质子弛豫率(R1°)的增加。弛豫通常是在298K和20MHz(0.5T)下测量的。
另一方面，在考虑Gd-配合物或者更一般的顺磁性螯合配合物或顺磁性造影剂的不同性质时，例如药动学行为，可以确定下列诊断类别在给药后自由快速分布至细胞外空间的非特异性试剂(NSA)；可以仅缓慢地从血液系统扩散至细胞外空间的低扩散试剂(LDA)；和主要(如果不完全)分布至血液系统的血液池试剂。
因为它们的生物分布行为，NSA因而被设计供一般用途。举例而言，下列目前用在临床实践中的NSA试剂显示几乎等同的弛豫，为大约4.7mM-1s-1(在298K和20MHz下测量)。
由于更高的弛豫引起MR图像中更好的造影区别，近二十年来已经投入更多关注来寻找比商用产品具有更高弛豫的系统。
在这方面，公认就配位水分子处于与“本体”水的快速交换中的Gd(III)配合物而言，r1p值与它们的分子量(MW)的增加呈线性增加。这种行为与已知的T1M对分子重取向时间的(τR)依赖性完全一致(参见上述参考文献)。
在此基础上，已经沿袭两种途径来延长分子重取向时间i)共价途径，由在配体表面上结合本体部分组成；和ii)非共价途径，由能够与缓慢移动的底物生成超分子加合物的系统组成。就后一种手段而言，最常用的底物以人血清白蛋白(HAS)为代表，若干含有适合于高亲和性结合该血清蛋白质的取代基的Gd(III)螯合物已有所述。一旦结合HSA，这些Gd(III)配合物显示它们的最大r1p值，观测频率为25-30MHz，也就是说磁场强度接近1T。不过在更高的场，它们的r1p快速降低，从而显示τR对T1M的强大效应在0.5与1.5T之间的成像场是至关重要的。关于一般参考文献，参见Aime S.，Botta M.，Fasano，M.；Terreno，E.Chem.Soc.Rev.1998，27，19-29；and Caravan P.，Cloutier N.J.，Matthew T.，Lauffer R.B.等人J ACS，2002，124，3152-3162。
就临床应用而言，目前的趋势是在3T下操作X光断层照相机，以便获得更好的成像分辨率。因此，需要确定新的在广大磁场强度范围内达到高弛豫的方式。
而且，鉴于它们增加了大小，这些高MW造影剂在机体血管系统中具有几乎独特的定位，这种生物分布模式使它们被称为“血液池”造影剂，相应地限制了它们的用途。
在考虑高弛豫MRI造影剂时，有些其他化合物的MW低于血液池试剂，但是仍然表现至多25mM-1·s-1的弛豫，在20MHz和37℃下测量(例如参见WO 00/75141和J.Magn.Reson.Imaging 2000，11182-191)。
这些化合物被称为低扩散试剂(LDA)，因为它们从5至10kDa不等的MW之高足以仅允许它们低扩散至血管外空间。因为它们的药动学行为，这些LDA的诊断应用不同于已有市售的NSA，后者通过从血管床自由扩散，所以被设计供一般诊断应用。
因此需要新的改进NSA，其能够综合具有自由和迅速的生物分布，所以有一般有用性，弛豫高。
本发明因而涉及一类新颖的造影剂，本质上以羟基化基团的存在为特征，它们满足上述要求。
发明概述本发明涉及一类新的低分子量顺磁性离子类造影剂，它们显示类似于常用T1-代血管外试剂的药动学行为，但是与所述已有市售的NSA相比，进一步以更高弛豫为特征。而且，提高了的弛豫在广大的磁场强度范围内得以持续，没有任何显著降低。
因此，本发明的第一个目的是顺磁性离子类非特异性造影剂(NSA)，具有低分子量，以高弛豫为特征，弛豫在从约0.5至约3MHz不等的磁场强度下基本上得以保留。
优选地，术语低分子量表示分子量低于约3.5kDa。
本说明书中，除非另外指出，术语非特异性造影剂(NSA)表示任何这样的造影剂，除了任何上述附加特征以外，在给药、特别是血管内给药后，迅速和自由分布至细胞外空间。
术语顺磁性离子类造影剂包括任何螯合配合物，具有二价或三价顺磁性金属离子，优选地原子数在20与31、39、42、43、44、49之间和在57与83之间，例如Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)、Mn(3+)和Gd(3+)，后者是优选的。
按照本发明并且除非另有说明，措辞高弛豫表示弛豫等于或高于8mM-1s-1(在20MHz(大约0.5T)、298K和pH7下测量)，进而更优选高于10mM-1s-1、12mM-1s-1、15mM-1s-1和20mM-1s-1，分别就MW为约1500、2000、2500和3500Da的系统而言。
此外，高弛豫应当得以保留，在上述磁场强度范围内没有显著降低，也就是约0.5至约3MHz。进而，任何非显著性降低可以优选地包含例如可能的不超过40％的弛豫变化。
按照第一种实施方式，本发明的造影剂(也可以包括其生理学上可接受的盐)包含螯合骨架部分，被一个或多个高度亲水性氨基多元醇部分取代，其中所述氨基多元醇部分直接或者通过连接基连接于所述骨架螯合结构，连接的方式不改变所述螯合部分配位笼的特征。
因此，本发明的另一目的是提供式(I)螯合配体A(LR)v(I)其中A是线性或环状螯合骨架部分；R独立地是H或者C2-C70氨基多元醇部分，包含直链或支链烷基链，被2至30个羟基取代，所述链可选地被一个或多个选自如下的基团中断-O-、-NH-、-N＜、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-CON＜或＞NCO-；并且可选地被一个或多个C4-C10环状单元取代；L独立地是价键或者A与R之间的二价直链或支链连接基部分，至多包含20个碳原子；
v是1至7的正整数；其条件是至少一个R基团不是H；或者这类配体的生理学上可接受的盐。
除非另有说明，术语氨基多元醇部分表示基团-NHR’或-NR’R”，其中氮原子通过连接基L键合于骨架部分A，R’和R”相同或不同，单独或者一起代表上述多羟基化的直链或支链烷基链。
所述氨基多元醇部分可以也可选地如上所示被中断或取代(实例参见实验一节)。
除非另有说明，术语环状单元表示可选被取代的4-至-10元碳环或杂环，后者包含1至2个选自N和O的杂原子。
优选地，碳环是6-元环，被一个或多个选自羟基、羟甲基和氨基的基团取代，进而更优选地，它是具有下式的氨基-肌醇衍生物 优选地，杂环是5-或6-元吡喃糖苷或哌啶子基环，可选地被一个或多个羟基、羟甲基和氨基取代，进而更优选地，它是下式的吡喃糖苷或哌啶子基衍生物 显然，在式(I)化合物内，并且除非另有说明，当一个或多个碳原子代表不对称中心时，任何旋光活性形式、其外消旋物以及任何包含大部分任何旋光活性形式的混合物都被包含在本发明的范围内。
依赖于螯合骨架部分A的属性，同此确定了多种式(I)化合物。
按照优选的发明方面，式(I)化合物可以因而选自下组
其中L和R相同或不同，在每种场合中独立地是如前文所示的。
上式中，并且只要至少一个所述R基团不是H，-L-R基团本身在其中定位为与分子其余部分优选结合位点的非限制性实例。
除非另有说明，即使已经同此插入每一上式中的负电荷以确定羧酸根和膦酸根阴离子，例如当化合物呈现顺磁性螯合配合物或盐时，例如碱金属盐，相应携带羧酸(-COOH)和膦酸(-PO3H2)基团的化合物也被包含在发明范围内。
按照第一种发明实施方式，特别优选下式(II)的螯合化合物 其中R和L具有如上所述的含义。
在这种类别中进而更优选由下式(II)代表的衍生物
其中R和L具有如上所述的含义。
进而更优选下式(II)化合物 其中R和L具有如上所述的含义。
显然，在上述式(II)化合物小类中，所给出的-LR基团有意被H代替；因此在那些相同的位置，L是单键，R是H。相反，就其余-LR基团而言，它们可以具有如上所述的含义，因此也包括H，前提是至少一个所述R基团不是H。
按照另一种发明实施方式，也优选下式(III)和(IIIa)的螯合化合物 其中R和L具有如上所述的含义。
在这种类别中进而更优选由下式(III)和(IIIa)代表的衍生物 其中R和L具有如上所述的含义。
在这种类别中进而更优选式(III)衍生物
其中R和L具有如上所述的含义。
就该小类式(III)或式(IIIa)化合物内的-LR基团而言，和它们可能的被H代替，参见上述关于上式(II)化合物所提供的注解。
按照另一种发明实施方式，也优选由下式(IV)和(V)代表的衍生物 其中R和L具有如上所述的含义。
综上所述，本领域技术人员明显看出，任何式(II)、(III)、(IIIa)、(IV)和(V)化合物的确代表本发明的具体实施方式
，因此落入如上所述的式(I)的含义。
按照另一种发明实施方式，式(I)化合物、因此也涵盖式(II)至(V)衍生物内的R基团当不是H时，优选地选自下组-NH-(CH2)0-2-C[(CH2)1-2-O-Q]3；-NH-(CH2)1-2-CON[(CH2)1-3-CONH-C[(CH2)1-2-O-Q]3]2；-N[(CH2)1-4-NHCO-(CHOH)4-CH2OH]2；-NH-(CH2)0-2-C[(CH2)1-4-NHCO-(CHOH)4-CH2OH]3；-N[(CH2)1-4-N[(CH2)1-4-COY]2]2；-NH-C[(CH2)1-4-COY]3；-NH-C[(CH2)1-2-O-(CH2)1-3-COY]3；-NH-CH(COY)[(CH2)1-2-COY]；-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2；-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2]2；
-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2]2]2；其中Q是下式基团 R1是H或甲基；和Y是如下表(a)所述基团表(a) 在更优选的方面，本发明涉及式(II)至(V)螯合化合物，其中R是H或者选自下列优选的氨基多元醇，用代码A至G标识如下。
表(b)
表(c)
表(d)


综上所述，技术人员应当明显看出，任何A、B和G氨基多元醇是通过恰当的化学式来定义的，而表(b)和(c)有意被解释为通过表格顶部的化学式来明确定义C、D、E和F部分，这些部分然后被Y基团取代，得到多种R基团，各自是由上述代码系统所精确定义的。
按照另一发明实施方式，L代表价键或者至多包含20个碳原子的连接基。
优选地，L代表价键或者至多包含15个碳原子的连接基；进而更优选地，L代表价键或者下式连接基 其中n和n’相同或不同，各自独立地是0或者1至4的整数，p、q和s各自独立地选自0或1。
进而更优选地，L代表价键或者下式连接基 其中n、q和s具有如上所述的含义。
综上所述，特别优选的本发明式(I)化合物以下列为代表根据下表1的式(II)；根据下表2的式(III)；根据下表3的式(IV)；和根据下表4的式(V)。
表1 表2
表3
表4 本发明的进一步目的以式(I)化合物与二价或三价顺磁性金属离子的螯合配合物为代表，因此涵盖式(II)至(V)那些，和其生理学上可接受的盐。
优选的螯合配合物是这样的，其中所螯合的顺磁性金属离子的原子数在20与31、39、42、43、44、49之间和57与83之间，例如Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)、Mn(3+)和Gd(3+)，后者是进而更优选的。
式(I)化合物、因此涵盖式(II)至(V)那些，也能够与放射性核素配位化合，包括203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113In、90Y、97Ru、62Cu、64Cu、52Fe、52mMn、140La、175Yb、153Sm、166Ho、149Pm、177Lu、142Pr、159Gd、212Bi、47Sc、149Pm、67Cu、111Ag、199Au、161Tb、51Cr、167Tm、141Ce、168Yb、88Y、165Dy、166Dy、97Ru、103Ru、186Re、188Re、99mTc、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、177Sn和199Au，及其氧化物和氮化物。放射性核素的选择将取决于所需的治疗或诊断应用。例如，就诊断目的而言(例如利用闪烁图成像诊断和监测治疗过程)，优选的放射性核素包括64Cu、67Ga、68Ga和111In，111In是尤其优选的。就治疗目的而言(例如提供放射疗法)，优选的放射性核素包括64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186/188Re和199Au，177Lu和90Y是特别优选的。
配体和顺磁性或放射性螯合物也都可以是盐的形式，特别是与生理学上可相容的碱或酸的加成盐。
优选的能够适用于制备本发明配合物或配体的盐的无机碱阳离子例如包含碱金属或碱土金属的离子，例如钾、钠、钙或镁。
优选的有机碱阳离子例如包含伯胺、仲胺和叔胺的离子，例如乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N-二甲基葡糖胺。
优选的能够适用于制备本发明配合物或配体的盐的无机酸阴离子包含卤代酸的离子，例如氯化物、溴化物或碘化物，以及其他适合的离子，例如硫酸根。
优选的有机酸阴离子包含在药学技术中惯用于制备碱性物质盐的那些，例如乙酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、富马酸根、马来酸根或草酸根。
优选的氨基酸阳离子和阴离子例如包含牛磺酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或者天冬氨酸和谷氨酸的离子。
式(I)化合物、因此涵盖式(II)至(V)化合物及其螯合配合物本身或者生理学上可接受的盐形式的制备代表本发明的另一目的。
确切而言，式(I)化合物及其螯合配合物可以通过包含下列步骤的一般合成过程制备1)制备氨基多元醇部分R的适合形式，其中氨基参与与分子其余部分(A-L)的偶联反应，它和羟基可以适当地和独立地被保护或活化；
2)制备连接基L的适合形式，其中任何作为其一部分的可选官能团可以独立地和适当地被保护或活化；3)制备骨架螯合部分A的适合形式，其中任何参与或不参与金属配位和与分子其余部分共价结合的官能团可以适当地和独立地被保护或活化；可选地，其中螯合部分A可以是已经与所选择的顺磁性或放射性金属离子配位化合；4)在任何A、L和R部分中裂解任何所选择的官能团的任何所选择的保护基团和/或活化，以任意适合的顺序偶联基团A、L和R；5)裂解任何保护基团，分离式(I)化合物；可选地，6)配位化合式(I)化合物与所选择的顺磁性或放射性金属离子，继之以分离螯合配合物和/或其盐。
上述过程是其任何变化的综合，特别是当提到已知官能团的保护/去保护和活化步骤时，或者甚至是可以完成上述反应步骤的顺序，都是按照本领域已知的常规方法进行的。
综上所述，技术人员应当明显看出，当连接基L代表共价键时，通过直接偶联基团R与分子其余部分来进行步骤(4)。
与之类似，在L不是共价键的情况下，式(I)化合物及其螯合配合物的制备可以如下完成，首先偶联部分R和L，随后使所得化合物与部分A反应，或者作为替代选择，首先偶联部分A和L，然后使所得化合物与部分R反应。
本说明书中，除非另外指出，术语分子或部分内的官能团表示合成有机化学领域中的普遍含义。
在本案中，确切而言，术语官能团表示任何直接参与A与L、R与L或者甚至A与R之间价键生成的原子或原子团，以及任何其他适合用已知方法保护起来不参加前者反应的基团。
鉴于上述，参加偶联反应的官能团需要被适当活化，或者本身所存在的形式或容易转化为反应性形式。
另一方面，任何不参与价键生成的官能团无论其反应敏感性如何，都需要被适当保护，以避免生成不需要的副产物；保护和去保护官能团的手段是本领域非常熟悉的。
根据本发明化合物和它们的制备过程，所述官能团基本上选自氨基、酰氨基、羰基、羧基、羟基和膦酸基团。
该过程的原料(下文可以适宜用基团A、R和L来标识)，及其任何前体和反应剂都是已知的化合物，或者可以按照常规方法制备。
作为非限制性实例，本发明的若干氨基多元醇本身是商业上可获得的，而其他可以容易地借助本领域已知的方法制备 2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇，CAS编号[77-86-1]，商业上可获得； 2-(氨甲基)-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇，CAS编号[7332-39-0]；Hiskey，M.A.等人Propellants，Esplosives，Pyrotechnics，1991，16，40-42； See Kitagawa，I.等人Chem.Pharm.Bul1.1984，32，4858-4865； 盐酸壳糖胺，[66-84-2]，商业上可获得； D-葡糖胺，[488-43-7]，商业上可获得； N-甲基-D-葡糖胺，[6284-40-8]，商业上可获得；
1，1’-亚氨基双[1-脱氧glucitol]，[15351-31-2]，van Haveren，J.等人Carbohydrate Res.1993，243，259-271。
除了上述以外，在此还提供关于氨基多元醇的相应胺的制备的一般参考文献，这些多元醇在前文中用A1(Ashton，P.R.等人Chem.Eur.J.1996，2，1115-1128)和B1(Tetrahedron Lett.2000，41，8485-8488；CAS[55264-15-8])表示。
有些根据本发明的氨基多元醇或者提到它们的胺是新的，因而构成本发明的另一目的。
确切而言，所述新颖的氨基多元醇包括下列化合物 以及前文表示为A2、B2、B3、C1至C11、D1至D11、E1至E11、F1至F11和G1至G11的那些。
本发明的顺磁性配合物、特别是Gd(III)螯合者可以通过化学计量加入适合的Gd(III)衍生物、特别是Gd(III)盐或氧化物来制备。
优选地，根据熟知的实验方法采用Gd(III)的氯化物或氧化物，例如EP 230893的所述。
关于用在本发明过程中的操作条件以及所采用的反应流程的一般说明，参见下文实验一节。
因为它们的高弛豫，本发明的NSA显著优于在先技术，特别是与用在临床实践中的NSA相比较。
惊人地，高弛豫不仅仅依赖于MW(优选低于约3.5kDa)。事实上，已经进行了一些试验以评价大量Gd类造影剂的弛豫与MW之间的关联性。
在这方面，测试了本发明的一些代表性化合物，如实验一节所述，与携带相同骨架螯合结构、但是没有本发明L-R基团的衍生物相比较。所得结果清楚地表明，本发明的Gd-螯合化合物至少额外贡献了3mM-1s-1的弛豫，在有些情况下甚至更高，而且所得弛豫高于这些相同化合物在它们MW基础上的预期(参见

图1和实施例34)。将大量不同的本发明Gd-螯合化合物、包括线性或环状骨架螯合结构与一些市售NSA、熟知LDA和其他供对比目的所制备的化合物相比，也获得相似的结果。
将所得弛豫值对相应MW作图(参见图2和实施例34)。在这种情况下，本发明化合物对弛豫也有额外贡献，鉴于它们的MW这确实是意外的。
将在20MHz和298K下测量的弛豫值r1p对相同化合物的分子重取向值τR作图，进一步放大了本发明化合物的弛豫增强作用(图3)。用于这种作图的后者参数τR能够得自根据已知方法的1/T1 NMRD(核磁共振分散)特征曲线拟合。
进而更有趣地，改变磁场强度从约0.01至约130MHz，本发明化合物所提高的弛豫意外地得以维持基本上不变(图4、5和5副)。
举例而言，在上述磁场范围内比较了本发明螯合配体2b的钆配合物(以下称之为Gd-2b)与市售NSA、即Magnevist_和血液池试剂、即Gd-DTPA(BOM)3与BSA(牛血清白蛋白)之间的大分子加合物(图6)。
所得行为的分析显示，尽管非常低，Magnevist_从0.2至3MHz的弛豫也是相当稳定的，而本发明化合物在相同条件下所表现的弛豫是基本上稳定的和显著更高的。上述血液池试剂的相应行为是相当不同的。事实上，它在25-30MHz下显示弛豫增加，不过落入非常短的场强度范围。所有这些结果强烈地支持了本发明化合物可以有利地用于广大的磁场强度范围，因此是代表MRI领域发展趋势的宝贵工具。
还已经检测了一些本发明螯合化合物的药动学特性。这些化合物显示类似于典型NSA的生物分布特性，象ProHance_、Magnevist_、Dotarem_和Omniscan_(参见实施例36-37)。
本发明化合物具有广泛的应用，因为它们能够用于血管内(例如静脉内、动脉内、冠脉内、心室内给药等)、鞘内、腹膜内、淋巴内和腔内给药。此外，这些化合物适合于口服或肠胃外给药，因此特别适合于胃肠道成像。
关于肠胃外给药，它们可以优选地被配制成无菌水溶液或悬液，其pH可以从6.0至8.5。
这些水溶液或悬液可以在0.002与1.0M之间的浓度范围内给药。这些制剂可以被冻干以及原样供应，在使用前重新配制。
关于胃肠用途或者关于在体腔内注射，这些成分可以被配制成溶液或悬液，可选地含有适合的赋形剂，目的例如是控制粘度。
关于口服给药，它们可以按照惯用在药学技术中的制备方法加以配制，或者被配制成包衣制剂，以额外保护不受胃酸性pH的影响，从而防止螯合金属离子释放，这特别会发生在典型的胃液pH值下。
按照已知的药物制剂技术，还可以加入其他赋形剂，例如包括甜味剂和/或矫味剂。
本发明化合物的溶液或悬液也可以被配制成气雾剂，用在气雾剂-支气管造影和滴注中。
可选地，本发明化合物可以化学缀合于适合的大分子，或者掺入或包埋在适合的载体中。
例如，它们也可以被包封成脂质体，或者甚至构成脂质体本身，因而能够作为单层或多层囊使用。
因此，本发明的另一目的是用于诊断用途的式(I)化合物或其药学上可接受的盐与二价或三价顺磁性金属离子、特别是钆的螯合配合物。
本发明的另一目的是式(I)化合物与顺磁性金属离子、特别是钆的螯合配合物或其生理学上可相容的盐制备药物制剂的用途，该药物制剂用于人或动物体器官或组织的M.R.I.诊断成像。
另一方面，本发明涉及用于诊断用途的药物组合物，包含本发明的螯合化合物。优选地，本发明涉及产生造影的组合物，包含至少一种本发明的Gd-类NSA。
按照另一目的，本发明也涉及利用MRI使人或动物体器官或组织成像的方法，所述方法包含对人或动物体给予药物组合物，其包含本发明的顺磁性金属离子配合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的包括式(I)化合物与放射性核素的螯合配合物或其生理学上可相容的盐。
关于作为诊断成像剂使用(例如闪烁图)，式(I)化合物与诊断性放射性核素配位化合。关于在放射疗法中使用，式(I)化合物与治疗性放射性核素配位化合。优选地，这类螯合配合物包括一种或多种适当的靶向部分，因而能够定位于有关组织。
附图的简要说明图1q＝1的携带膦酸根螯合基团的本发明Gd(III)-配合物和对比Gd-配位化合物的弛豫值，对它们的分子量作图(25℃，中性pH，0.47T)。
图2结构上不同的q＝1的本发明Gd(III)-配合物和对比Gd-配位化合物的弛豫值，对它们的分子量作图(25℃，中性pH，0.47T)。
图3结构上不同的q＝1的Gd(III)-配合物的弛豫值，对它们的分子重取向时间(τR)作图(25℃，中性pH，0.47T)。
图4Gd-1b配合物的1H 1/T1 NMRD特性(25℃，1mM水溶液)。
图5和5副Gd-1c、Gd-2c和Gd-3c配合物的1H 1/T1 NMRD特性(25℃，1mM水溶液)。
图6Gd-2b(●)、Gd-DTPA(Magnevist)_(■)和Gd-DOTA(BOM)3与BSA之间非共价加合物(○)的1H 1/T1 NMRD特性(25℃，1mM水溶液)。
图7渗透性测定利用ICP-AES在H5V单层上测定Gd-2b(1.25mM)的跨内皮通过，与ProHance_相比较(参见实施例36)。
实验下一节所述优选本发明化合物和它们制备中间体的非限制性列表，以更好地示范本发明的广泛应用潜力。
同此说明的是用在下列实验一节中的缩写列表；其他一些没有说明者采取常规含义。
实施例1式1a化合物的制备
制备包括下列步骤。
a)按照下列流程A合成氨基多元醇A2；b)根据流程B合成适当官能化的骨架螯合结构；c)按照下列流程C的偶联反应。
流程A
化合物2 向N-苄基-3，3’-亚氨基双(叔丁基丙酸酯)1(VonWronski，M.A.等人WO 01/91805)(8.0g，0.022mol)的MeOH(40.0mL)溶液加入10％Pd/C(2.0g)，混合物在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，除去甲醇，得到化合物2，为油状物。收率5.4g(90％).MS274(M+H)化合物3 向胺2(5.46g，0.02mol)、Z-甘氨酸(4.5g，0.0215mol)与HATU(8.17g，0.0215mol)在二氯甲烷(25mL)中的混合物加入二异丙基乙胺(3.9g，5.41mL，0.03mol)，将混合物搅拌6h。除去二氯甲烷，将残余物溶于乙酸乙酯(150mL)，用饱和碳酸氢钠溶液(2×100mL)、水(2×100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到粗产物，经过硅胶色谱处理，得到Z-衍生物3，为粘性的油状物。收率6.8g(94％).MS487.2(M+H)化合物4 向化合物3(2.32g，0.005mol)加入TFA(15.0mL)，将溶液搅拌6h。除去TFA，得到粘性的油状物。在真空下干燥，然后用乙腈研制，得到化合物4，为白色固体。收率1.2g(68％).MS353.4(M+H)
化合物5 向所述二元酸4(0.1g，0.284mmol)的DMF(2.0mL)溶液中加入HOBT(0.1g，0.66mmol)和DIC(0.1mL)。将混合物在RT下搅拌2h。然后向反应混合物加入三(2，3，4，6-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基-氧基甲基)甲基胺(Ashton，P.R.；Boyd，S.E.；Brown C.L.；Jayaraman，N.；Nepogodiev，S.A.；Stoddart，J.F.Chem.Eur.J.1996，2，1115-1128)(0.65g，0.58mmol)，在50℃下搅拌48h。然后在真空下除去DMF，残余物在真空下干燥2h。向残余物加入水(5.0mL)，滗析溶液。重复后者过程(5×5mL)，过滤所得固体，风干，得到纯产物，无需进一步纯化即可用于随后的氢化步骤。
化合物6 (氨基多元醇A2的被保护形式)向化合物5(45mg，0.018mmol)的MeOH(5mL)溶液加入10％Pd/C(25mg)，混合物在15psi下氢化6h。除去催化剂，在旋转蒸发器上除去甲醇，得到泡沫状固体。收率35mg(81％).MS2407(M+H).
流程B 化合物9 将4-硝基丁酸1，1-二甲基乙基酯7(Fuji，M.；Muratake，H.；Natsume，M.Chem.Pharm.Bull.1992，40(9)，2338-2343)(3.00g；15.0mmol)滴加到搅拌着的N，N-二苄基乙二胺乙酸盐8(5.40g；15.0mmol)的绝对EtOH(20mL)溶液中，然后加热至60℃。向反应混合物加入多聚甲醛(1.50g；49.5mmol)，3h后使溶液冷却至室温。16h后在减压下蒸发反应混合物。将油性残余物溶于EtOAc(200mL)，用饱和NaHCO3水溶液(150mL)洗涤。水相用EtOAc(200mL)萃取。合并有机相，干燥(Na2SO4)，蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到9(6.00g；13.0mmol)，为浅黄色油。收率86％.MS454.3(M+H)；476.3(M+Na)化合物10 向化合物9(3.00g；6.62mmol)的MeOH(110mL)溶液加入10％Pd/C(1.00g)。将反应混合物加热至40℃，在氢气氛下搅拌10h。将混合物通过Millipore_仪器(FH0.5μm)过滤，蒸发，得到10(1.46g；6.00mmol)，为浅黄色油。收率97％.MS244.2(M+H).
化合物11 将化合物10(1.56g；6.40mmol)的DMF(20mL)溶液滴加到K2CO3(4.40g；32.0mmol)、Na2SO4(2.70g；19.2mmol)与苄基-2-溴乙酸酯(7.33g；32.0mmol)在DMF(20mL)中的混合物中。将反应混合物在搅拌下加热至65℃达15h，然后过滤和蒸发。将残余物溶于EtOAc(300mL)，用水洗涤(3×150mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，蒸发至残余物，经过柱色谱纯化，得到11(1.02g；1.22mmol)，为黄色的油。收率19％.MS836.8(M+H)；858.7(M+Na)。
化合物12 将化合物11(0.74g；0.88mmol)的TFA(5.0mL)溶液在室温下搅拌4h。然后蒸发混合物，将残余物溶于CH2Cl2(30mL)，在减压下蒸发溶液。重复该操作两次。粗油然后经过柱色谱纯化。合并含有产物的级分，蒸发，溶于50mL H2O/CH3CN(80/20)，冻干，得到12(0.43g；0.55mmol)，为白色固体。收率62.5％.MS780.5(M+H)；802.4(M+Na)。
流程C
化合物13 向化合物6(0.58g，0.24mmol)、化合物12(0.175g，0.225mmol)与HATU(0.11g，0.29mmol)的DMF(3.0mL)溶液加入二异丙基乙胺(0.3mL)，将混合物搅拌24h。在真空下除去DMF，在真空下干燥残余物达6h。向残余物加入水(5.0mL)，滗析水溶液。再次加入水(5.0mL)，研制混合物。将所生成的固体用水洗涤(6×5mL)，过滤，干燥。粗产物经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱，得到产物13，为泡沫状固体。收率0.22g(31％).MS1584.3(M+2H)/2。
化合物14 向苄基酯13(0.35g，0.11mmol)的甲醇(10.0mL)溶液加入10％Pd/C(150mg)，混合物在15psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到油，在真空下干燥，得到化合物14，为泡沫状固体。收率0.29g(94％).MS1584.3(M+2H)/2。
化合物1a 在-20℃下，用氨饱和甲醇(10mL)。向化合物14(0.2g，0.07mmol)加入饱和氨的甲醇溶液(4.0mL)，将反应混合物在0℃下放置1h，在RT下放置48h。24h后生成白色固体。滗析甲醇溶液，所得固体然后用氨的甲醇溶液(1.0mL)洗涤，在真空下干燥，得到产物1a。收率98mg(76.5％).MS1797(M+H)；893.3(M+2H)/2。
实施例2式3a化合物的制备
制备包括下列步骤。
a)按照下列流程D合成氨基多元醇B2；b)按照下列流程E的偶联反应。
流程D 化合物3 将2，2-双(氨甲基)-1，3-丙二胺四盐酸盐1(Zompa，L.J.；Bogucki，R.F.J.Am.Chem.Soc.1966，88，5186-5191)(7g；25mmol)悬浮在DMF(85mL)与TEA(12.48mL；90mmol)的混合物中。在室温下缓慢滴加(1.5h)商业上可获得的δ-葡糖酸内酯2(16g；90mmol)的DMF(89mL)溶液。将混合物在室温下搅拌2天。过滤反应混合物，在减压下浓缩。将残余物用乙腈处理，得到沉淀，过滤，用乙腈洗涤。干燥固体，得到3(19g；28.5mmol)，为白色固体。定量收率。MS667(M+H)。
化合物4 将化合物3(30.0g，45.0mmol)溶于DMF(450mL)，缓慢滴加(Boc)2O(17.2g；65.2mmol)的DMF(100mL)溶液。然后加入氢氧化四甲基铵(8.15g，45.0mmol)，将混合物在室温下搅拌2天。在减压下浓缩溶液。将残余物用CH2Cl2处理，得到沉淀，过滤，用H2O(100mL)和CH3OH(100mL)洗涤。干燥固体，得到4(25g，32.6mmol)。收率72％。
化合物5 在室温下，向化合物4(10.0g；13.0mmol)的Ac2O(186mL；1.97mol)悬液加入吡啶(25.7g；326mmol)。然后将混合物加热至90℃以溶解试剂，然后在室温下冷却。在室温下1天后，在减压下浓缩混合物，将残余物溶于EtOAc(200mL)，用水(200mL)和10％NaHCO3水溶液(200mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，蒸发，得到5(15g；10.7mmol)。收率82％。
化合物6(氨基多元醇B2的被保护形式)将TEA(3.67g；32.0mmol)加入到化合物5(4.50g；3.20mmol)的CH2Cl2(56mL)溶液中。在室温下3天后，向反应混合物加入更多的TFA(1.82g；16.0mmol)。在室温下另外4天后，在减压下除去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2(7mL)和TFA(5.49g；48.0mmol)。将混合物在室温下搅拌1天，然后在减压下蒸发。将残余物溶于CH2Cl2(10mL)，蒸发。这种操作重复两次，得到6(3.00g；2.31mmol)，为白色固体。收率72％。
流程E
化合物8 向冷却的酸7(参见实施例1)(0.45g，0.55mmol)与HATU(0.23g，0.6mmol)在DMF(3.0mL)中的混合物中加入二异丙基乙胺(0.23g，0.32mL，1.8mmol)，将混合物搅拌5min。向活化的酸中加入化合物6(0.65g，0.5mmol)的DMF(3.0mL)溶液，将溶液在RT下搅拌12h。在真空下除去DMF，将所得浓稠的油用饱和碳酸氢钠溶液处理(2×10mL)。将所得黄色固体用水洗涤(3×10mL)，过滤，干燥。所得粗产物经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱，得到产物8，为泡沫状固体。收率320mg(30％).MS2060.4(M+H)化合物9 向所述化合物8(0.32g，0.15mmol)中的甲醇(30mL)溶液加入10％Pd/C(300mg)，溶液在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到四元酸9，为白色泡沫状固体。收率0.25g(94％).MS1700.2(M+H)。
化合物3a 向所述四元酸9(0.25g，0.14mmol)中加入饱和氨的甲醇溶液(～25％，5mL)，将溶液在4℃下放置48h。羟基化合物3a沉淀出来，为白色固体。小心地滗析上清溶液，用氨的甲醇溶液洗涤固体(2×0.5mL)，滗析氨的甲醇溶液。将所得白色固体在真空下干燥，得到化合物3a。收率0.13g(88％).MS1068.7(M+H)。
实施例3式2a化合物的制备 制备包括下列根据流程F的步骤。
流程F 化合物3 向冷却的酸2(参见实施例1)(0.65g，0.8mmol)与HATU(0.342g，0.9mmol)在DMF(3.5mL)中的混合物加入二异丙基乙胺(0.312g，0.43mL，0.24mmol)，将混合物搅拌5min。向该混合物加入化合物1(被保护的氨基多元醇B1)(Takahashi，M.等人Tetrahedron Lett.2000，41，8485-8488)(0.62g，0.7mmol)的DMF(3.5mL)溶液，将溶液在RT下搅拌12h。在真空下除去DMF，将所得浓稠的油溶于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液(2×10mL)、水(2×10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到粗产物，经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱，得到产物3，为泡沫状固体。收率360mg(31％).MS1642.1(M+H)化合物4 向四苄基酯3(0.36g，0.22mmol)的甲醇(40mL)溶液加入10％Pd/C(300mg)，溶液在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到四元酸4，为白色泡沫状固体。收率0.26g(93％).MS1281.8(M+H)；1303.8(M+Na)化合物2a 向四元酸4(0.26g，0.2mmol)加入饱和氨的甲醇溶液(～25％，5mL)，将溶液在4℃下放置48h。去乙酰化产物沉淀出来，为白色固体。小心地滗析氨的甲醇溶液，用氨的甲醇溶液洗涤固体(2×0.5mL)，滗析氨的甲醇溶液。将所得白色固体在真空下干燥，得到化合物2a。收率0.15g(86％).MS861.6(M+H)。
实施例4式1b化合物的制备 制备包括下列根据流程G1、G2、G3和H的步骤。
流程G1
化合物2 将多聚甲醛(4.22g；140.6mmol)加入到二苄胺(25.0g；127mmol)的MeCN(250mL)溶液中。将悬液加热至80℃达1小时，然后将所得溶液冷却至室温。向反应混合物历经25min滴加亚磷酸三叔丁酯(Cox，J.R.；Newton，M.G.J.Org.Chem.1969，34，2600-2605)(35.2g；140.6mmol)的MeCN溶液，将溶液在室温下搅拌22h。在真空下蒸发溶剂，向残余物加入0.1N HCl(630mL)。悬液用CH2Cl2萃取(3×300mL)，合并有机相，用水洗涤(3×300mL)，干燥(Na2SO4)，在真空中蒸发。粗产物(53.6g)经过硅胶色谱纯化(15∶85EtOAc/石油醚)，得到所需产物(33.32g)，为白色固体。收率65.3％.MS404(M+H)化合物3 将化合物2(33.3g；82.7mmol)溶于MeOH(500mL)，在大气压下用10％Pd/C(3.3g)氢化。2h后通过Millipore apparatus_(0.5μm)过滤混合物，在真空下蒸发溶液。粗产物(18.4g)无需任何进一步纯化即可使用。定量收率。MS224(M+H)。
流程G2 化合物5 将70％HClO4水溶液(13,5g；0,134mol)滴加到L-天冬氨酸4-(苯基甲基)酯4(商业上可获得)(25g；0,112mol)的tBuOAc(515mL；3,822mol)悬液中，在室温下搅拌。在室温下18h后，将所得澄清溶液用H2O(470mL)稀释，分离各相；水相用EtOAc萃取(2×235mL)。收集有机相，用5％aq.NaHCO3(2×250mL)和水(2×200mL)洗涤。收集新的水相，用EtOAc萃取(3×100mL)。收集全部有机相，经Na2SO4干燥，蒸发，得到5(24,12g)，为无色的油。收率77％.MS280.2(M+H)，302,2(M+Na)。元素分析(C15H21NO4)计算值C64,50；H7,58；N5,01.实验值C64,40；H7,60；N5,17.
化合物6 将化合物5(24,12g；0,086mol)、BrCH2CO2tBu(17,68g；0,091mol)、MeCN(144mL)与2M磷酸盐缓冲液pH8(72mL)的混合物在室温下剧烈搅拌；18h后分离各相，蒸发有机相。将所得残余物溶于EtOAc(300mL)，用H2O(2×150mL)和饱和NaCl水溶液(2×150mL)洗涤。经Na2SO4干燥后，蒸发有机溶液，得到粗产物，经过快速色谱纯化，得到6(19,61g)，为无色的油。收率58％.MS416,2(M+Na)元素分析(C21H31NO6)计算值C64,10；H7,94；N3,56.实验值C64,20；H8,00；N3,64。
化合物7 将三氟甲磺酸2-溴乙基酯(Franzini，M.等人WO01/46207)(16g；0,062mol)缓慢滴加到化合物6(14g；0,036mol)与2，6-二甲吡啶(12g；0,112mol)的甲苯(210mL)溶液中，在-15℃惰性气氛(N2)下搅拌。将反应混合物在室温下搅拌20h，然后用水(100mL)稀释，用EtOAc(100mL)萃取。将有机溶液经Na2SO4干燥，蒸发，得到粗产物，经过色谱纯化，得到7(10,35g)，为淡黄色油。收率58％.MS522,3(M+Na)流程G3 化合物8 在剧烈搅拌下，将溴代-衍生物7(4.11g；8.22mmol)的MeCN(20mL)溶液历经8小时缓慢滴加到膦酸酯3(916mg；4.11mmol)在MeCN(10mL)与2M磷酸盐缓冲液(pH8)(20mL)中的乳液中。22h后分离各相，水层用EtOAc萃取(2×30mL)。蒸发有机相。将油性残余物溶于EtOAc(20mL)，合并有机相，用1∶1水/盐水洗涤(2×30mL)，经Na2SO4干燥。粗产物经过硅胶色谱纯化。得到化合物8(1.85g)，为黄色的油。收率42％.MS1062.8(M+H)，1084.8(M+Na)。
化合物9 将化合物8(973mg；1.10mmol)溶于MeOH(50mL)，在大气压下用10％Pd/C(50mg)氢化。30min后通过Milliporeapparatus_(0.5μm滤器)过滤反应混合物，在真空下蒸发溶液。产物(725mg)无需任何进一步纯化即可用于下一步。收率75％.MS881m/z(M+H)。
流程H
化合物11 向9(636mg；0.36mmol)与10(Takahashi.M.等人Tetrahedron Lett.2000，41，8485-8488)(634mg；0.72mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液加入HATU(274mg；0.72mmol)，搅拌混合物，得到几乎澄清的溶液。加入DIEA(189μL；1.08mmol)，在室温下搅拌溶液。26h后用1∶1水/盐水(1×20mL)和盐水(1×20mL)洗涤混合物。水层用二氯甲烷萃取(1×20mL)，合并有机层，经Na2SO4干燥，在真空下蒸发。粗产物经过硅胶色谱纯化(CHCl3/MeOH 9∶1)。合并含有产物的级分，蒸发，得到产物11(328mg)。收率35％.MS2606.3(M+H)；2629.1(M+Na)。
化合物12 将化合物11(100mg；0.038mmol)用冰浴冷却，滴加TFA(2mL)，得到褐色溶液。30min后除去冰浴，溶液保持在rt下搅拌27小时。除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷(5mL)，蒸发溶液。这种过程重复三次。最后在真空泵下干燥残余物(115mg)。定量收率。MS2270.2(M+H)；2309.9(M+K)。
化合物1b 向12(115mg)的MeOH(0.5mL)溶液加入6.5％氨的甲醇溶液(2mL)，将混合物在室温下搅拌过夜。从溶液中分离出白色固体。将固体过滤，悬浮在6.5％氨的甲醇溶液(4mL)中，在rt下搅拌20h。滗析固体，在真空中干燥，得到1b(38mg)，为白色固体。收率53％.MS1428(M+H)。
实施例5式2b化合物的制备 2b的制备包括下列步骤a)按照实施例2步骤(a)合成氨基多元醇部分；b)按照实施例4步骤(a)合成适当官能化的骨架螯合结构；c)根据流程I的偶联反应，类似于实施例4的说明操作。
流程I
实施例6式Gd-1c螯合化合物的制备 制备包括下列步骤a)按照下列流程L合成氨基多元醇G1；b)根据流程M的偶联反应。
流程L
化合物2 在0℃ Ar气氛下，向醇1(Grayson，S.M.；Fréchet，J.M.J.J.Am.Chem.Soc.2000，122，10335-10344)(2.154g，3.50mmol)与Et3N(1.22mL，8.75mmol)的CH2Cl2搅拌溶液中滴加甲磺酰氯(0.60mL，7.74mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h，然后加入H2O(20mL)，将混合物剧烈搅拌10min。将混合物转移至分液漏斗，然后加入CH2Cl2(100mL)。有机层然后用1M HCl(100mL)、饱和NaHCO3溶液(100mL)和H2O(100mL)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，蒸发至干，得到粗的甲磺酸酯(2.48g)，立即使用。
将粗甲磺酸酯与NaN3的DMF(20mL)悬液在60℃、Ar气氛下搅拌14h。然后除去溶剂，使残余物在H2O(100mL)与CH2Cl2(100mL)之间分配。水相进一步用CH2Cl2萃取(2×100mL)，合并有机相，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发至干。产物经过柱色谱纯化(SiO2∶EtOAc/己烷15∶85)，得到叠氮化物2，为澄清的油(1.89g，84％)。ES MS[M]+(计算值662.3206)实测值662.3237。
化合物3 将叠氮化物2(1.89g)、10％Pd(OH)2/C与N2H4H2O的THF/EtOH悬液在90℃下搅拌，用ES+监测反应的进程。根据需要加入更多的10％Pd(OH)2/C和N2H4.H2O。完成后，通过C盐垫过滤反应，蒸发滤液至干，得到粗的胺3，为微黄色油(767mg)。胺3进一步经过凝胶过滤色谱纯化。ES MS[M+H]+(计算值254.1604)实测值254.1597。
流程M
化合物Gd-1c 向钆配合物4(Rousseaux，O.；Simonot，C.WO 00/71526)(20mg)与HOBt(41mg)的1∶1 H2O/二噁烷(1.0mL)溶液中加入EDC(60mg)，将反应搅拌15min。向反应加入胺3(70mg)的H2O(260μL)溶液，将混合物在室温下搅拌4天，在此期间向反应加入更多的EDC(60mg)。然后将反应冷冻干燥，残余物悬浮在H2O(0.5mL)中，离心(1500rev/min)5min。小心地除去液体，冷冻干燥，得到粗产物，为淡褐色油(239mg)。经过凝胶过滤色谱纯化，得到纯的化合物Gd-1c(20mg，48％)。MALDI-TOF MS[M+H]+＝1788.7实施例7式Gd-2c配位化合物的制备
制备包括下列步骤a)按照下列流程N合成氨基多元醇G2；b)按照下列流程O的偶联反应。
流程N 化合物2 将化合物1(Grayson，S.M.；Jayaraman，M.；Fréchet，J.M.J.Chem.Commun.1999，1329-1330)(6g，11mmol)溶于2M HCl/二噁烷(1∶1)(100mL)，在RT下搅拌3h。在减压下除去溶剂，在真空下干燥，得到2，为无色固体(3.0g，93％)。ES MS[M+Na]+(315)。
化合物3 将氢化钠(0.79g，32mol)溶于无水THF(20mL)，在RT下滴加烯烃2(2.4g，8.2mmol)的THF(20mL)溶液，继之以苄基溴(5.62g，32mol)的THF(30mL)溶液。将溶液在RT下搅拌1h，在回流温度下加热72h。用水(20mL)淬灭反应，产物用乙醚萃取(3×20mL)。将醚层干燥(K2CO3)，在真空下除去溶剂，得到澄清的油。产物经过柱色谱纯化(SiO2∶乙酸乙酯/己烷20∶80)，得到所需的烯烃3，为澄清的油(5g，92％)。ES MS[M+Na]+(675)。
化合物4 按照本领域已知的方法，使用9-BBN(碱性过氧化物处理)，借助反-马尔科夫尼科夫水合反应，从烯烃3开始制备所需的醇4；参考文献参见Jayaraman，M.；Freshet，J.M.J.J.Am.Chem.Soc.1998，120，12996-12997和Grayson，S.M.；Fréchet，J.M.J.J.Am.Chem.Soc.2000，122，10335-10344。ES MS[M+Na]+(693)。
化合物5 在0℃氩气氛下，向搅拌着的化合物4(1.654g，2.46mol)与Et3N(0.38mL，2.79mol)的CH2Cl2溶液滴加甲磺酰氯(0.23mL，3.0mol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h。利用TLC和ESMS监测向甲磺酸酯的转化。加入叠氮化钠的DMF溶液(8mL)、催化量的四丙基溴化铵，然后加入H2O，在65℃下加热24h。在真空下除去溶剂，用二氯甲烷萃取所需产物，干燥(MgSO4)，蒸发，得到油性产物。叠氮化物5用柱色谱纯化(SiO2∶EtOAc/己烷30∶70)，得到澄清的油(1.25g，73％)。ES MS[M+Na]+(718)。
化合物6 将叠氮化物5(1.00g)、10％Pd(OH)2/C与几滴盐酸的乙醇(20mL)溶液在RT和H2(30psi)下搅拌，用ES+监测反应的进程。24h后滤出催化剂，除去溶剂，得到树状胺-2，为非常淡黄色的油(0.45g，99％)。ES MS[M+H]+(310)。
流程O
化合物Gd-2c 向钆配合物7(Rousseaux，O.；Simonot，C.WO00/71526)(30mg)与HOBt(2mg)的6∶4 H2O/二噁烷(1.0mL)溶液中加入EDC(54mg)和胺6(87mg)。将溶液的pH用稀氢氧化钠溶液调节至6.5，在RT下搅拌3天，同时监测pH。在此期间向反应混合物加入另外的EDC(60mg)。溶液然后冷冻干燥，得到黄色玻璃状物。将玻璃状物溶于水(2mL)，经过凝胶过滤色谱纯化，得到化合物Gd-2c，为无色固体。ESMS[M]+＝2010。
实施例8式Gd-3c配位化合物的制备
制备包括下列步骤a)按照下列流程P合成氨基多元醇G3；b)按照下列流程Q的偶联反应。
流程P 化合物2 将醇1(Grayson，S.M.；Fréchet，J.M.J.J.Am.Chem.Soc.2000，122，10335-10344)(2.677g，2.06mmol)与NEt3的CH2Cl2(80mL)溶液冷却至0℃，滴加甲磺酰氯。将反应混合物在0℃下搅拌45min，然后加入H2O(20mL)，将混合物剧烈搅拌10min。将混合物转移至分液漏斗，然后加入CH2Cl2(100mL)。有机层然后用1MHCl(50mL)、饱和NaHCO3溶液(50mL)和H2O(50mL)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，蒸发至干，得到粗的甲磺酸酯(2.934g)，无需进一步纯化立即使用。
将粗甲磺酸酯与NaN3(1.34g，20.6mmol)的DMF(10mL)悬液在60℃氩气氛下搅拌14h。然后除去溶剂，使残余物在H2O(100mL)与CH2Cl2(100mL)之间分配。水相进一步用CH2Cl2萃取(2×100mL)，合并有机相，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发至干。产物经过柱色谱纯化(SiO2∶EtOAc/己烷20∶80)，得到所需的叠氮化物2，为澄清的油(2.14g，78％)。ES MS[M+H]+(计算值1346.9659)实测值1346.9859。
化合物3 向叠氮化物2(270mg)与10％Pd(OH)2/C(224mg)的THF/EtOH(20mL)悬液中加入1滴1M HCl。将所得混合物在H2气氛(45psi)下振荡4天，然后通过C盐垫过滤。蒸发滤液至干，得到粗的胺，为澄清的油(158mg)。胺3进一步经过凝胶过滤色谱纯化。ES MS[M+H]+(计算值578.3388)实测值578.3394。
流程Q 化合物Gd-3c 向钆配合物4(Rousseaux，O.；Simonot，C.WO00/71526)(23mg)的DMF(0.5mL)悬液中加入O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(51mg)，将混合物搅拌2h。向反应加入胺3(91mg)的DMF(0.5mL)溶液，将混合物在室温下搅拌5天，在此期间向反应混合物进一步加入O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(47mg)。然后通过注射滤器过滤反应，蒸发至干。经过凝胶过滤色谱纯化，得到配位化合物Gd-3c(25mg，30％)。MALDI-TOF MS[M+H]+＝3083.5。
实施例9式Gd-4c化合物的制备
制备按照下列流程R进行流程R
化合物2 类似于实施例7(步骤a)所述的操作，将化合物1(Grayson，S.M.；Jayaraman，M.；Fréchet，J.M.J.Chem.Commun.1999，1329-1330)转化为胺2。
配位化合物Gd-4c 向钆配合物3(Rousseaux，O.；Simonot，C.WO 00/71526)(25mg)的水/二噁烷溶液加入HOBt(5mg)、胺2(0.16mg)和EDC(34mg)。将溶液在环境温度下搅拌，用稀NaOH水溶液调节pH至6.5。
实施例10式9a化合物的制备 制备包括下列步骤a)按照下列流程S合成适当官能化的骨架螯合结构；b)根据下列流程T偶联。
流程S
化合物2 将亚硝酸钠(5.88g；85.2mmol)的水(60mL)溶液在30min内滴加到冷却至0℃的L-天冬氨酸β苄基酯(商业产品)(10.0g；44.8mmol)与NaBr(17.1g；165.8mmol)在1N HBr(200mL)中的混合物中。在0℃下3h后，加入浓H2SO4(4.4mL)，溶液用Et2O萃取(3×200mL)。合并有机相，用盐水洗涤(2×200mL)，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到2(9.3g)，为无色的油。收率73％.MS287.1(M+H)；309.0(M+Na)。
化合物3 将化合物2(9.3g；27.1mmol)在乙酸叔丁酯(100mL)与70％HClO4(0.08mL)中的溶液在室温下搅拌12h。加入水(300mL)，溶液用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。合并有机相，用5％Na2CO3(200mL)、水(200mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到3(8.4g)，为无色的油。收率90％.MS365.0(M+Na)。
化合物4 将3(5.98g；17.4mmol)、6-氨基-6-甲基-全氢-1，4-二氮杂_(Giovenzana G.B.等人WO 03/008390)(0.5g；3.9mmol)与K2CO3(2.4g；17.4mmol)在乙腈(50mL)中的混合物搅拌24h。在减压下蒸发溶液，然后加入水(100mL)和CHCl3(100mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到4(1.3g)，为淡黄色油。收率37％.MS654.4(M+H)；676.4(M+Na)。
化合物5 将溴乙酸叔丁酯(0.32mL；2.18mmol)加入到在0℃下冷却的、搅拌着的4(0.80g；0.87mmol)、K2CO3(0.46g；3.32mmol)与Na2SO4(0.22g)的乙腈(8mL)溶液中。在室温下30min后，使溶液回流5h又30min。在室温下14h后，蒸发溶液，用8∶2石油醚/EtOAc(20mL)处理。弃去沉淀，蒸发液体相，得到粗产物(0.90g)，经过快速色谱纯化，得到5(0.66g)，为黄色的油。收率86％.MS882.8(M+H)；904.8(M+Na)。
化合物6 将5％Pd/C(0.18g)加入到化合物5(0.60g；0.68mmol)的绝对EtOH(50mL)溶液中。将反应混合物在氢气氛下搅拌1h。通过Millipore_apparatus(FH 0.5μm)过滤混合物，蒸发，得到6(0.41g)，为白色固体。收率89％.MS702.6(M+H)；724.5(M+Na)。
流程T 化合物9a 使二元酸6与胺7反应(参见实施例3)，再类似于实施例3的所述操作(参见化合物2a的制备)，制备化合物9a。
实施例11式10a化合物的制备 按照下列流程U制备该化合物流程U 化合物10a 使二元酸2(参见实施例10的化合物6)与胺1反应(参见实施例2)，再类似于实施例10的所述操作(参见化合物9a的制备)，制备化合物10a。
实施例12化合物9b的制备
9b的制备包括下列步骤a)根据流程V合成氨基多元醇部分G10；b)根据流程Z的偶联。
流程V 化合物4 将N-羟基琥珀酰亚胺(1.35g；11.7mmol)和二异丙基碳二亚胺(1.48g；11.7mmol)加入到1(1.11g；3.90mmol)(商业上可获得)的CH2Cl2(12mL)悬液中。在室温下搅拌18h后，过滤悬液，在真空下蒸发。将粗的2(3.94g)溶于DMF(70mL)，加入胺3(Takahashi，M等人Tetrahedron Lett.2000，41，8485-8488)(6.86g；7.80mmol)。将澄清的溶液在65℃下搅拌48h。加入另一部分3(1.50g；1.71mmol)，将混合物在65℃下搅拌另外24h。除去溶剂，将粗产物溶于CH2Cl2(200mL)，用饱和NaHCO3水溶液(2×50mL)和饱和NH4Cl水溶液(50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，蒸发。粗产物经过硅胶柱色谱纯化，得到化合物4(3.44g；1.72mmol)。收率44％.MS2005.7(M+H)；2027.7(M+Na)。
化合物5 向化合物4(3.44g；1.72mmol)的MeOH(50mL)溶液加入10％Pd/C(350mg)和乙酸(206mg；3.44mmol)。悬液在大气压下氢化4.5h。过滤除去催化剂，蒸发溶液。将残余物溶于CH2Cl2(50mL)，用饱和NaHCO3水溶液洗涤(2×15mL)。有机层经Na2SO4干燥，过滤，蒸发，得到化合物5(3.22g；1.72mol)。定量收率。MS1870.7(M+H).
流程Z
化合物7 在0℃下，向如实施例4(流程G3)所述制备的二元酸6(94.4mg；107μmol)与N-甲基哌啶(26.0μL；214μmol)的CH2Cl2(1.0mL)溶液中加入氯甲酸异丁酯(29.2mg；214μmol)，将溶液在该温度下搅拌20min。向反应混合物加入胺5(400mg；214μmol)。在0℃下1h和在室温下另一小时后，将混合物用CH2Cl2(15mL)稀释，用饱和NH4Cl水溶液洗涤(2×10mL)。分离有机相，经Na2SO4干燥，蒸发。残余物经过硅胶柱色谱纯化，得到7(200mg；43.6μmol)，为白色固体。收率41％.MS4608.7(M+Na)。
化合物8 在室温下，将K2CO3(6.0mg)加入到7(200mg；43.6μmol)的MeOH(10mL)溶液中，将溶液搅拌10min。得到乳状沉淀，加入更多的MeOH(10mL)，得到澄清的溶液。18h后蒸发混合物，残余物用Et2O(20mL)处理。过滤悬液，得到8(128mg)，为白色固体。定量收率。MS2929.4(M+Na)。
化合物9b 在0℃下，将化合物8(120mg；41.3μmol)溶于三氟乙酸(TFA)(1.5mL)，使混合物升温至室温，搅拌过夜。蒸发混合物，将残余物溶于新鲜的TFA(1.5mL)，将溶液搅拌另外5h。蒸发反应混合物，残余物用Et2O(20mL)处理。过滤悬液，得到化合物9b的三氟乙酸盐(120mg)，为白色固体。定量收率。MS2593.0(M+Na)。
实施例13式11b化合物的制备
11b的制备包括下列步骤a)根据流程Z-A合成氨基多元醇；b)根据流程Z-B的偶联。
流程Z-A 化合物11 类似于实施例12(流程V)所述进行操作，通过中间体10(参见实施例2流程D)制备化合物11。
流程Z-B 化合物11b 使化合物11与化合物6(如实施例4流程G3所述制备)反应，再类似于实施例12(流程Z)的所述进行操作，制备化合物11b。
实施例14式12a化合物的制备 根据下列流程Z-C和Z-D进行式12a化合物的制备。
流程Z-C 化合物2 将2M NaOH(180mL)加入到1(54.0g，140mmol)(US专利5514810)的EtOH(360mL)溶液中。将反应混合物搅拌24小时，然后浓缩。含水残余物与异丙醇共沸蒸馏，蒸发至干。将残余物溶于MeOH(330mL)，向醇溶液加入丙烯酸甲酯(96.4g，1.12mol)。将反应混合物在室温下搅拌5天。蒸发溶剂，粗产物经过柱色谱纯化(30∶1CH2Cl2/MeOH)，得到2(55.7g，103mmol)，为粘性的油。收率74％.MS560.7(M+Na)。
化合物3 将2(14.0g，26.0mmol)的DMSO(30mL)溶液加入到搅拌着的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)(22.0g，182mmol)与无水K2CO3(25.2g，182mmol)的DMSO(70mL)悬液中。将反应在50℃氮气氛下搅拌3天，然后加入更多的TRIS(9.44g，78.0mmol)和无水K2CO3(10.8g；78.0mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌另外4天，然后过滤。在真空下浓缩滤液，残余物经过树脂Amberlite XAD 16.00洗脱纯化，得到3(15.6g，17.4mmol)，为吸湿性淡黄色固体。收率67％.MS895.1(M+H).
化合物4 将4-二甲氨基吡啶(3.10g；25.0mmol)和吡啶(14.0mL；168mmol)加入到3(13.0g；14.0mmol)的乙酸酐(200mL)溶液中。将反应混合物在60℃下搅拌11h。蒸发溶液，将残余物溶于CHCl3(300mL)，有机相用H2O洗涤(3×50mL)。分离有机层，经Na2SO4干燥，蒸发。粗产物经过柱色谱纯化(3∶2丙酮/CHCl3)，得到4(17.0g；12.0mmol)，为油性产物。收率86％.MS1421.5(M+H).
化合物5 向4(17.0g；12.0mmol)的MeOH(120mL)与AcOH(3.43mL，60mmol)溶液加入10％Pd/C(1.1g)，将悬液在室温氢气氛下搅拌3h。过滤后，在减压下蒸发溶液，得到化合物5(16.0g；12.0mmol)，为油性产物。定量收率。MS1307.4(M+H).
流程Z-D
化合物7 将二异丙基乙胺(DIEA)(130μL，0.77mmol)加入到酸6(300mg，0.38mmol)(参见实施例3流程F)与HATU(180mg，0.46mmol)在DMF(0.50mL)中的混合物中，将混合物在室温下搅拌10min。向活化酸溶液加入化合物5(500mg，0.38mmol)的DMF(0.50mL)溶液，将混合物在室温下搅拌15h。在真空下除去DMF，所得浓稠的油经过硅胶柱色谱纯化，得到产物7(50.0mg；24.1μmol)，为白色固体。收率6.3％.MS2071.2(M+H).
化合物8 将10％Pd/C(5mg)加入到化合物7(50.0mg，24.1μmol)的MeOH(0.30mL)与CHCl3(0.20mL)溶液中，溶液在大气压下氢化48h。过滤除去催化剂，蒸发溶液。将残余物溶于H2O(0.50mL)和乙腈(20μL)，冻干，得到四元酸8(40mg，23μmol)，为白色固体。定量收率。MS1710(M+H).
化合物12a 向四元酸8(20.0mg，11.7μmol)加入饱和氨的甲醇溶液(1mL)，将溶液在室温下放置48h。然后蒸发反应混合物，将残余物溶于H2O(500μL)和乙腈(20μL)，冻干，得到化合物12a(10mg，8.3μmol)，为白色固体。收率71％.MS1206.5(M+H).
实施例15式5a化合物的制备 根据下列流程Z-E制备式5a化合物流程Z-E
化合物3 将1(参见实施例10流程S)(1.7g；4.8mmol)、6-氨基-6-甲基-全氢-1，4-二氮杂_2(Aime，S.等人Inorg.Chem.2004，43，7588)(0.25g；1.9mmol)与K2CO3(0.67g；4.8mmol)在MeCN(10mL)中的混合物搅拌72h。过滤悬液，在减压下蒸发。将残余物溶于CH2Cl2(30mL)，然后用水(2×20mL)和盐水(2×20mL)洗涤。分离后，将有机相干燥(Na2SO4)，蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到3(1.1g)，为黄色的油。收率85％。
化合物4 将溴乙酸叔丁酯(0.41mL；2.79mmol)加入到搅拌着的3(0.76g；1.11mmol)、K2CO3(0.54g；3.90mmol)与Na2SO4(0.3g)的MeCN(20mL)溶液中，冷却至0℃。加入后，将悬液在氮下回流15h，然后在60℃下搅拌另外15h。加入更多的溴乙酸叔丁酯(0,41mL；2,79mmol)，将反应混合物在回流下搅拌8h，然后在60℃下搅拌15h。将悬液冷却至室温，过滤，蒸发溶剂。将残余物溶于CH2Cl2(20mL)，用H2O(2×10mL)和5％NaHCO3水溶液(2×10mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发。粗的橙色的油经过快速色谱纯化，得到4(0.65g)，为黄色的油。收率64％。
化合物5 将10％Pd/C(100mg)加入到化合物4(0.5g；0.55mmol)的MeOH(20mL)溶液中。将反应混合物在氢气氛下搅拌5h。通过Millipore_apparatus(FH 0.5μm)过滤混合物，蒸发，得到5(0.4g)，为黄色固体。收率99％。
化合物5a 使二元酸5与根据实施例2(流程D)制备的胺6反应，再类似于实施例11(流程U)所述进行操作，合成化合物5a。
实施例16式1d化合物的制备
根据下列流程Z-F制备化合物1d流程Z-F
化合物3 将K2CO3(525mg；3.79mmol)和溴代衍生物2(1.00g；4.18mmol)加入到环烯(cyclen)1(218mg；1.26mmol)的无水乙腈溶液中。将悬液在氮气氛下加热至60℃达12小时。将反应混合物过滤，滤液用CH2Cl2(25mL)稀释。将有机相用水洗涤(2×25mL)，分离，经Na2SO4干燥，在真空下蒸发。粗产物(770mg)经过硅胶柱色谱纯化，得到产物3(315mg；487μmol)，为黄色的油。收率39％.MS647.7(M+H).
化合物6 在氮气氛下，向根据实施例2(流程D)制备的4(3.00g；2.30mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液加入二异丙基乙胺(DIEA)(469μL；2.76mmol)。加入氯化物5(392μl；2.76mmol)，将混合物在室温下搅拌4小时。反应混合物用水(50mL)和0.1N HCl(25mL)洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，在真空下蒸发。粗产物(3.42g)经过硅胶柱色谱纯化，得到6(1.39g；0.95mmol)，为白色固体。收率41％.MS1486.8(M+Na)。
化合物7 将6(847mg；584μmol)的乙腈(15mL)溶液历经15min滴加到化合物3(315mg；490μmol)、K2CO3(81.0mg；584μmol)与Na2SO4(50mg)的乙腈(10mL)悬液中。将反应混合物加热至回流达12小时，然后过滤，在真空下蒸发溶液。将残余物溶于EtOAc(50mL)，溶液用水(2×50mL)和5％NaHCO3水溶液(2×50mL)洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，蒸发。粗产物(960mg)经过硅胶柱色谱纯化，得到7(390mg；188μmol)，为白色固体。收率38％.MS2075.1(M+H).
化合物8 将化合物7(390mg；188μmol)溶于MeOH(20mL)，加入K2CO3(24.0mg；0.18mmol)。将悬液在室温下搅拌4小时，然后过滤，在真空下蒸发，得到8(256mg；179μmol)，为白色固体。收率95％.MS1452.5(M+Na)。
化合物1d 在50℃下，向化合物8(74.0mg；52.0μmol)的水(5.0mL)溶液历经3天加入0.1N NaOH(3.12mL)，以达到和维持pH11.5。然后使混合物冷却至室温，用0.1N HCl(3.30mL)酸化至pH2.5，在真空下浓缩。粗产物经过Amberlite XAD 16.00树脂洗脱纯化，得到所需化合物1d(54.0mg；40.1μmol)。收率77％.MS1346.3(M+H)，1368.3(M+Na)实施例17式5d化合物的制备 根据下列流程Z-G制备式5d化合物流程Z-G
化合物12 类似于实施例16(流程Z-F)所述进行操作，从根据实施例10(流程6)制备的环烯10和化合物11合成化合物12。收率84％(519mg；0.52mmol).MS1024.3(M+Na)。
化合物13 类似于实施例16(流程Z-E)所述进行操作，从化合物12和6合成化合物13。收率84％(1.04g；0.43mmol).MS2437.6(M+Na)。
化合物14 将化合物13(170mg；70.0μmol)溶于MeOH(10mL)，在大气压下用5％Pd/C(45mg)氢化。2小时后通过Millipore_apparatus(0.5μm滤器)过滤反应混合物，在真空下蒸发溶液，得到化合物14(110mg)。收率73％.MS2167.2(M+Na)。
化合物15 在0℃下，将O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)(63.0mg；164μmol)和胺4(参见实施例2)(212mg；164μmol)加入到化合物14(110mg；51.0μmol)与DIEA(58.0μl；0.33mmol)的DMF(5mL)溶液中。将混合物在室温氮气氛下搅拌48小时，然后在真空下蒸发。将残余物溶于CH2Cl2(20mL)，溶液用5％NaHCO3水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤。分离有机层，经Na2SO4干燥，在真空下蒸发。粗产物经过硅胶柱色谱纯化，得到化合物15(128mg；21.4μmol)。收率42％.MS5982.7(M+H).
化合物16 类似于实施例16(流程Z-F)所述进行操作，得到化合物16。收率93％(70.0mg；20.0μmol).MS3475.5(M+H).
化合物5d 在0℃氮气氛下，将化合物16(70.0mg；20.0μmol)溶于三氟乙酸(TFA)(1.0mL)，使混合物升温至室温，搅拌18h。蒸发溶液，将残余物溶于新鲜的TFA(1.0mL)，将溶液在室温下搅拌另外5h。蒸发反应混合物，残余物用Et2O(20mL)处理。过滤悬液，得到化合物5d的三-三氟乙酸盐(58.3mg；16.0μmol)，为白色固体。收率83％.MS3307.21(M+H).
实施例18式G11氨基多元醇(被保护形式)的制备
根据下列流程Z-H制备式G11化合物的被保护形式(例如酰化)流程Z-H 化合物2 在室温下，将三氟乙酸(TFA)(0.71mL)加入到1(0.50g，0.77mmol)(WO 2001052899)的CH2Cl2(5.0mL)溶液中。将反应混合物搅拌24小时，然后浓缩。加入净TFA(5.0mL)，将溶液搅拌另外4h，然后蒸发。将残余物溶于CH2Cl2(10mL)，蒸发(操作重复两次)。将油性残余物用Et2O处理，得到2的三-三氟乙酸盐(590mg，103mmol)，为白色固体。定量收率。MS426.4(M+H).
化合物3 将0-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(11.4g；30.0mmol)和二异丙基乙胺(DIEA)(7.65mL；45.0mmol)加入到2(2.13g；5.00mmol)(内铵盐形式)的DMF(100mL)的溶液中。10min后，在室温下向溶液加入葡糖胺(5.43g；30.0mmol)，将混合物搅拌48h。在真空下蒸发溶剂，将油性残余物溶于水，经过Amberlite XAD 16.00树脂洗脱纯化，得到3(2.78g，2.58mmol)，为淡黄色固体。收率52％.MS1079.2(M+H).
化合物4 将吡啶(10mL)加入到3(1.19g；1.10mmol)的乙酸酐(10mL)溶液中，将反应混合物在60℃下搅拌17h。蒸发溶液，将残余物溶于CHCl3(50mL)，有机相用H2O洗涤(3×50mL)。分离有机层，经Na2SO4干燥，蒸发。粗产物经过柱色谱纯化(8∶2∶0.1CH2Cl2/MeOH/AcOH)，得到4的三乙酸盐(1.01g；0.48mmol)，为油性产物。收率44％.MS1918.3(M+H).
化合物G11(被保护的)向4(1.01g；0.48mmol)的MeOH(10mL)与AcOH(0.25mL)溶液加入10％Pd/C(0.10g)，在室温H气氛下搅拌3h。过滤后，在减压下蒸发溶液，将残余物溶于CHCl3(10mL)，溶液用饱和NaHCO3(3×20mL)水溶液和水(2×20mL)洗涤。将有机相干燥，蒸发，得到化合物G11(0.88g)，为灰白色固体。定量收率。MS1829.8(M+H).
式G11化合物可以原样用在偶联反应中，得到本发明化合物。作为替代选择，可以适当地除去酰基，留下游离羟基，这可以按照常规去保护方法进行操作，例如在碱性条件下处理，正如前文实施例所述。
实施例19式G9氨基多元醇(被保护形式)的制备 根据下列流程Z-I制备式G9化合物的被保护形式流程Z-I
化合物6按照文献所述的方法(Organic Synthesis 1951，907)，从1-苄基-4-哌啶酮合成化合物6。
化合物7 按照实施例18(流程Z-H化合物4)所述的方法乙酰化化合物6。
化合物8 按照实施例18(流程Z-H化合物5)所述的方法氢化化合物7。
化合物9在0℃下，将氯甲酸异丁酯(1.28g；9.40mmol)加入到四元酸2(参见实施例18流程Z-H)(1.00g；2.35mmol)与N-甲基哌啶(1.14mL；9.40mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液中，将溶液在该温度下搅拌20min。向反应混合物加入胺8(4.05g；9.40mmol)。在0℃下1h和在室温下另外1h后，将混合物用CH2Cl2(25mL)稀释，用饱和NH4Cl水溶液(2×20mL)洗涤。分离有机相，经Na2SO4干燥，蒸发。残余物经过硅胶柱色谱纯化，得到化合物9(1.95g；0.94mmol)，为白色固体。收率40％.MS2100.8(M+Na)。
化合物G9 按照实施例18(流程Z-H，化合物C6的制备)所述的方法氢化化合物9。
式G9化合物可以原样用在偶联反应中，得到本发明化合物，或者适当地去保护(参见实施例18)。
实施例20化合物A-L’(H)(下称化合物5)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是连接基-CH2-NH- 化合物1 将乙酸(6.0mL)加入到N，N-二苄基乙二胺(12.18g，50.6mmol)的乙醇(80mL)溶液中，将溶液在60℃下搅拌10min(生成白色固体，加热至80℃后溶解)。加入N-(3-硝基丙基)邻苯二甲酰亚胺1(11.7g，50.0mmol)[(1)Alston，T.A.；Porter，D.J.T.；Bright，H.J.J.Enzyme Inhibition.1987，212-222]，继续在80℃下搅拌，得到澄清的溶液。历经30min向该溶液分小批加入多聚甲醛(5.0g，166mmol)，继续在80℃下搅拌5h。冷却反应混合物，过滤所生成的固体，用冷乙醇洗涤，在真空下干燥。收率22.0g(88％).MS499.5(M+H).
化合物2 将邻苯二甲酰亚氨基衍生物1(21.0g，42.0mmol)加入到CH3NH2/THF(40.0mL)与CH3NH2/H2O(80mL)的混合物中，在室温下搅拌48h。通过氮气流除去过量甲胺，在真空下除去溶剂。将所得固体溶于四氢呋喃(100mL)与水(10mL)的混合物。向THF-水溶液加入二碳酸二叔丁酯(19.0g，87.0mmol)，搅拌16h。除去溶剂，将所得糊状固体溶于乙酸乙酯(400mL)，用氯化钠溶液洗涤(2×200mL)，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到黄色的油，经过硅胶柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱。收集UV可见的级分，蒸发，得到2，为油。收率18.20g(92％).MS469.2(M+H).
化合物3 将Pd-C10％(750mg)加入到硝基化合物2(2.0g，4.27mmol)的甲醇(40mL)溶液中，混合物在45psi下氢化24h。过滤除去催化剂，在旋转蒸发器上除去甲醇，得到胺3，为浓稠的油。收率1.0g(91％).MS259.2(M+H).
化合物4 将溴乙酸叔丁酯(3.8g，2.88mL，19.5mmol)加入到胺3(1.0g，3.87mmol)与碳酸钾(2.69g，19.5mmol)在DMF(4mL)中的混合物中，将混合物在40℃下搅拌12h。在真空下除去DMF，将所得油溶于乙酸乙酯(150.0mL)，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到油，经过柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱。收集含有产物的级分(Rf 0.7)，蒸发，得到浓稠的油。收率1.10g(40％).MS715.5(M+H)，737.4(M+Na)化合物5 将Boc衍生物4(0.82g 1.15mmol)加入到二氯甲烷(5mL)、乙酸叔丁酯(15mL)与TFA(4mL)的混合物中，将混合物搅拌10min。历经10min分批加入甲磺酸(300μL)的二氯甲烷(1mL)溶液，搅拌12h。将溶液用碳酸氢钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯溶液用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到油，在真空下干燥，得到泡沫状固体。收率0.7g(99％).MS615.4(M+H).
实施例21化合物A-L’(H)(下称化合物8)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是在氨基位点被保护的连接基-CH2-NH-
化合物7 将溴代酯26(0.8g，2.24mmol)[(2)Eisenwiener，K.-P.；Powell，P.；Macke，H.R.Bioorg.，Med.Chem.Lett.2000，10，2133-2135]加入到胺3(0.26g，1.0mmol)与碳酸钾(0.5g，3.62mmol)在乙腈(4mL)中的混合物中，将混合物搅拌8h。过滤反应混合物，在真空下除去乙腈。将所得浓稠的油溶于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到油，经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱。收集级分(Rf 0.5)，蒸发，得到酯7，为油状物。收率0.3g(37％).MS811.4(M+H)，849.3(M+K)化合物8 将溴乙酸叔丁酯(0.29g，0.22mL，1.4mmol)加入到胺7(0.3g，0.37mmol)与碳酸钾(0.2g，1.45mmol)在乙腈(3mL)中的混合物中，将混合物在70℃下搅拌24h。向反应混合物加入乙腈(15mL)，过滤。除去乙腈，将所得油溶于乙酸乙酯，用水洗涤(2×10mL)，干燥(Na2SO4)。蒸发溶剂，得到褐色的油，经过柱色谱纯化(硅胶，己烷-乙酸乙酯7∶3)。收集UV可见的级分(Rf 0.45)，蒸发，得到8，为油状物，放置后固化。收率0.27g(70％).MS1040.4(M+H).
实施例22化合物A-L’(H)(下称化合物13)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(IIIa)螯合单元，L’是在氨基位点被保护的连接基-C6H4-NH- 化合物9 将二碳酸二叔丁酯(30.0g 138mmol)加入到冰-冷却的对-氨基苯乙基溴氢溴酸盐3(36.0g，128mmol)[(3)Tamai，T.；Tanaka，M.；Mukaiyama，H.；Hirabayashi，A.；Muranaka，H.；Sato.M.；Akahane，M.US 6353025]与三乙胺(10mL)的混合物中，将混合物在室温下搅拌24h。除去溶剂，将糊状固体用水处理，用乙酸乙酯萃取。蒸发乙酸乙酯，得到固体，经过柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯洗脱。收集UV可见的级分，蒸发，得到白色固体。收率34.2g(88％).MS324.2(M+Na)化合物10 将化合物9(3.0g，10.0mmol)加入到亚硝酸钠(1.4g，20.0mmol)在DMSO(5mL)中的混合物中，将混合物搅拌2h。30min后生成半固体。反应后，将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯溶液用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到黄色固体，经过柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱。收集UV可见的级分，蒸发，得到黄色固体。收率1.29g(48.5％).MS289.2(M+Na)化合物11 将乙酸(0.6mL)加入到反式-N，N-二苄基-1，2-二氨基环己烷4(1.43g，4.85mmol)[(4)Tye，H.；Eldred，C.；Wills，M.Tetrahedron Lett.44，155-158(2002)]的乙醇(5.0mL)溶液中，在60℃下搅拌10min。向该溶液加入化合物10(1.29g，4.84mmol)，继续在60℃下搅拌另外10min。历经30min分小批加入多聚甲醛(0.5g，16.6mmol)，将反应混合物在80℃下搅拌5h。除去乙醇，残余物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤，干燥。蒸发乙酸乙酯，得到油，经过硅胶柱色谱纯化(己烷-乙酸乙酯7∶3)。收集UV可见的级分，蒸发，得到油。收率2.2g(76％).MS585.3(M+H)。
化合物12 将Pd-C10％(1.0g)加入到温热的化合物10(2.1g，3.6mmol)的甲醇(40mL)浆液中，在RT下混合物在45psi下氢化24h。过滤除去催化剂，在真空下除去溶剂，得到油，无需进一步纯化即可用于下一步。收率1.28g(95％).MS375.3(M+H)，389.4(M+Na)化合物13 将溴乙酸叔丁酯(2.34g，1.78mL，12mmol)加入到胺12(0.75g，2.0mmol)与碳酸钾(1.66g，12.0mmol)的DMF(4mL)溶液中，将混合物在70℃下搅拌24h。向反应混合物加入二氯甲烷(10.0mL)，过滤。除去溶剂，所得褐色的油经过硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2∶CH3OH，95∶5)。收集UV可见的级分(Rf 0.48)，蒸发，得到油，放置后固化。收率0.75g，(45％).MS831.5(M+H).
实施例23化合物A-L’(H)(下称化合物18)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(IIIa)螯合单元，L’是连接基-CH2-NH-
化合物14 将乙酸(3.60mL)加入到反式-N，N-二苄基-1，2-二氨基环己烷(8.82g，30.0mmol)的乙醇(60mL)溶液中，在60℃下搅拌10min。加入N-(3-硝基丙基)邻苯二甲酰亚胺(7.1g，30.3mmol)，继续在60℃下搅拌另外30min。历经30min向该溶液分小批加入多聚甲醛(3.75g，126mmol)，继续在80℃下搅拌5h。除去乙醇，将所得浓稠的油溶于乙酸乙酯(200mL)，乙酸乙酯溶液用碳酸氢钠溶液、水洗涤，干燥(Na2SO4)。浓缩乙酸乙酯溶液，所得油经过硅胶柱色谱纯化(7∶3)。收集级分(Rf 0.48)，蒸发，得到浓稠黄色的油，在真空下干燥，得到泡沫状固体。将所得泡沫状固体溶于甲醇(50.0mL)，放置30min。过滤所生成的固体，用冷乙醇洗涤，在真空下干燥。收率8.3g(50.0％).MS553.3(M+H).
化合物15 将邻苯二甲酰亚氨基衍生物14(8.0g，14.5mmol)加入到2M CH3NH2的THF溶液(75mL)与40％CH3NH2的H2O溶液(30mL)的混合物中，将混合物在室温下搅拌48h。通过氮气流除去过量甲胺，在真空下除去溶剂。将所得黄色固体溶于四氢呋喃(100mL)与水(10mL)的混合物。向THF溶液加入二碳酸二叔丁酯(8.72g，40.0mmol)，搅拌6h。除去THF，将所得糊状固体溶于乙酸乙酯(300mL)，用碳酸钠溶液洗涤，然后用氯化钠溶液洗涤(2×200mL)，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到黄色的油，经过硅胶柱色谱纯化，用己烷-乙酸乙酯(9∶1和8∶2)洗脱。收集UV可见的级分，蒸发，得到14，为油。将所得油溶于甲醇(50mL)，放置1h。过滤所生成的白色固体，在真空下干燥。收率5.1g(67.5％).MS523.3(M+H).
化合物16 在Pd-C10％(2.0g)的存在下，化合物14(4.80g，9.2mmol)的甲醇(50mL)溶液在45psi下氢化72h。过滤除去催化剂，在减压下除去甲醇，得到2.6g(90％)胺16。MS313.2(M+H).
化合物17 将溴乙酸叔丁酯(3.51g，2.65mL，18.0mmol)加入到碳酸钾(2.5g，18.0mmol)与胺16(0.93g，3.0mmol)的DMF(4mL)浆液中，将混合物在70℃下搅拌24h。然后向反应混合物加入二氯甲烷(10mL)，过滤。除去溶剂，所得褐色的油经过硅胶柱色谱纯化(己烷-乙酸乙酯7∶3)。收集级分(Rf 0.48)，蒸发，得到油，放置后固化。收率1.1g，(48.0％).MS769.5(M+H).
化合物18 将Boc衍生物4(1.1g 1.43mmol)加入到二氯甲烷(5mL)、乙酸叔丁酯(25mL)与TFA(5mL)的混合物中，将混合物搅拌10min。历经10min分批加入甲磺酸(400μL)的二氯甲烷(1mL)溶液，将反应搅拌3h。将溶液用碳酸氢钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯溶液用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到油，在真空下干燥，得到泡沫状固体。收率0.82g(99％).MS669(M+H).
实施例24化合物A-[L’(OH)]2L”(OH)(下称化合物7)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是连接基-CH2-CH2CO-，L”是连接基-CH2CO-
化合物2 将NaNO2(1.35g；19.6mmol)的水(15mL)溶液历经30min滴加到冷却至0℃的L-谷氨酸5-叔丁基酯1(商业产品)(2.0g；9.8mmol)与KBr(4.31g；36.0mmol)在1N HBr(45mL)中的混合物中。在0℃下3h后，溶液用EtOAc萃取(3×100mL)。合并有机相，用盐水(80mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到(0.53g)2，为无色的油。收率20％。
化合物3 将化合物2(1.38g；5.2mmol)、苄醇(0.58mL；5.7mmol)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(1.18g；5.7mmol)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.06g；0.52mmol)的CH2Cl2(25mL)溶液在室温下搅拌3h。滤出所沉淀的二环己基脲，将滤液用5％AcOH水溶液(20mL)和水(3×20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到3(1.31g)，为无色的油。收率71％。
化合物5 将3(1.30g；3.65mmol)的MeCN(2mL)溶液历经5min滴加到在0℃下冷却的6-氨基-六氢-1H-1，4-二氮杂_-6-丙酸1，1-二甲基乙基酯4(实施例1，流程B，化合物10)(0.40g；1.66mmol)与K2CO3(0.57g；4.15mmol)在MeCN(13mL)中的混合物中。使反应混合物升温至rt，搅拌29h。滤出盐，在减压下蒸发滤液。粗产物经过柱色谱纯化，得到5(0.91g)，为黄色的油。收率69％。
化合物6 将溴乙酸苄基酯(0.41mL；2.60mmol)加入到5(0.83g；1.05mmol)、K2CO3(0.41g；2.80mmol)与Na2SO4(0.22g)在MeCN(5mL)中的混合物中，冷却至0℃。加入后，使反应混合物升温至室温，回流6h。向混合物加入更多量的溴乙酸苄基酯(0.05g；0.30mmol)和K2CO3(0.04g；0.28mmol)，回流另外8h。过滤混合物，蒸发，将残余物溶于CH2Cl2(10mL)。将有机相用水洗涤(2×10mL)，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到6(0.22g)，为黄色的油。收率19％。
化合物7 将化合物6(0.22g；0.20mmol)的CF3COOH(2.5mL)溶液在室温下搅拌60h。然后蒸发混合物，将残余物溶于CH2Cl2(10mL)，在减压下蒸发溶液。操作重复两次，得到粗产物，经过柱色谱纯化，得到7(0.12g)，为淡黄色油。收率65％。
实施例25化合物A-L’(OH)(下称化合物7)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是连接基-CH2-CH2CO- 化合物2 在机械搅拌下，将L-谷氨酸γ苄基酯1(商业产品)(20g，84.3mmol)的1M HBr(400mL)溶液冷却至-7℃，然后加入NaBr(32.1g，311.9mmol)。在35min内向反应溶液滴加NaNO2(11.05g，160.2mmol)的水(40mL)溶液。1h后加入浓H2SO4(10mL)，混合物用Et2O萃取(4×200mL)；合并有机相，用盐水洗涤(2×150mL)，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到所需产物2(13.79g)。收率54％。
化合物3 将化合物1(13.46g，44.7mmol)溶于乙酸叔丁酯(179mL)，然后加入70％HClO4(193μL)，在室温下搅拌溶液。24h后加入水(180mL)，分离有机相，用水(130mL)、5％NaHCO3水溶液(130mL)和水(130mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在减压下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到产物3(10.75g)。收率67％。
化合物5 将溴代衍生物3(5.5g；15.4mmol)的MeCN(30mL)溶液在35min内滴加到用冰浴冷却的6-氨基-6-甲基-全氢-1，4-二氮杂_4(Aime，S.等人Inorg.Chem.2004，43，7588)(6.62g；51.3mmol)与K2CO3(2.13g；15.4mmol)的MeCN(130mL)悬液中。此后除去冷却浴，将反应混合物在室温下搅拌。4h后过滤混合物，在减压下蒸发溶剂。将粗产物溶于EtOAc(150mL)，用水洗涤(3×100mL)。将有机相用稀HBr洗涤，水相用25％NH4OH调至pH9，然后用EtOAc萃取(4×70mL)。合并有机相，用水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发，得到产物5(4.8g)。收率77％。
化合物6 将溴乙酸叔丁酯(7.86g，40.3mmol)加入到化合物5(4.65g，11.5mmol)、K2CO3(6.36g，46mmol)与Na2SO4(1.5g，1O.6mmol)的MeCN(80mL)悬液中，将混合物在回流下加热。16h后过滤混合物，在减压下蒸发。粗产物经过快速色谱纯化，得到所需产物6(7.24g)。收率84％。
化合物7 将化合物6(572mg，0.77mmol)溶于EtOH(50mL)，在大气压下用10％Pd/C(100mg)氢化。通过Milllpore_apparatus(FH0.5μm)过滤混合物，在减压下蒸发，得到产物7(430mg)。收率85％.
实施例26化合物A-L’(H)(下称化合物7)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是连接基-(CH2)4-NH- 化合物2 在0℃下，将Nε-苄酯基-L-赖氨酸1(商业产品)(15g；0.052mol)溶于6M HBr(45mL)。历经30min分小批加入NaNO2(3.97g；0.057mol)。将反应溶液在室温下搅拌2h，然后用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，在真空下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到化合物2(14.06g)，为橙色的油。收率79％。
化合物3 将70％HClO4水溶液(1.5mL)滴加到化合物2(13g；0.0377mol)的乙酸叔丁酯(160mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌24h。然后用水(2×200mL)和5％NaHCO3水溶液(2×150mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，在真空下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到产物3(9.66g)，为黄色的油。收率64％。
化合物5 在0℃下，将化合物3(4.6g；0.115mol)的MeCN(25mL)溶液在30min内滴加到6-氨基-6-甲基-全氢-1，4-二氮杂_4(Aime，S.等人Inorg.Chem.2004，43，7588)(5g；0.039mol)与K2CO3(1.59g；0.0115mol)在MeCN(25mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌4h，然后在真空下蒸发。将粗产物溶于EtOAc(25mL)，用水洗涤(3×25mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，在真空下蒸发。将粗产物溶于EtOAc(25mL)，用HBr水溶液洗涤。收集水相，加入NH4OH水溶液调节pH至9，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发，得到产物5(3.3g)。收率64％。
化合物6 在0℃下，将溴乙酸叔丁酯(3.8mL)的MeCN(20mL)溶液滴加到搅拌着的化合物5(3.28g；7.3mmol)、K2CO3(3.6g)与Na2SO4(0.5g)的MeCN(30mL)悬液中。在加入结束时，将混合物在回流下加热14h。然后过滤，在真空下蒸发。将粗产物溶于CH2C12(50mL)，用水(50mL)和5％NaHCO3水溶液(2×50mL)洗涤；将有机层干燥(Na2SO4)，过滤，在真空下蒸发。粗产物经过柱色谱纯化，得到产物6(3.32g)，为黄色的油。收率58％。
化合物7 将10％ Pd/C(400mg)加入到化合物7(3.32g；4.2mmol)的MeOH(20mL)溶液中。将反应混合物在氢气氛下搅拌2h。通过aMillipore_apparatuS(FH 0.5μm)过滤混合物，蒸发，得到化合物7(2.42g)，为黄色的油。收率90％。
实施例27保护/去保护和偶联的实例在前述实施例20至26的化合物A-L’(H)内，任何氨基无论作为游离基团还是在去保护后，都能够恰当地与多羟基化部分偶联，无论携带末端羧基还是通过适合的连接基团再与氨基多元醇偶联，得到本发明化合物。
另外，所述携带氨基的螯合单元可以适当地与恰当的多元醇-内酯偶联；关于一般说明，例如参见在实施例31中所采取的操作条件(例如多元醇-内酯与胺缩合)。
氨基的去保护可以按照已知方法进行。例如，在酸性环境中可以容易地完成叔丁氧羰基的除去(例如TFA、甲磺酸，在二氯甲烷中)。
除了上述以外，实施例21的化合物8可以被适当地选择性去保护。例如，通过催化氢化作用可以除去苄氧基(例如H2，Pd/C10％，甲醇，24h)，以得到相应的二羧酸衍生物，继而可以用恰当的氨基多元醇适当地官能化(例如在HATU和二异丙基乙胺的存在下，在DMF中)，以得到本发明化合物。
在上述偶联反应中所采用的操作条件或者根据任何去保护步骤的操作条件都是本领域已知的。
实施例28化合物A-L’(OH)(下称化合物25)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(III)螯合单元，L’是连接基-CH2-CO- 化合物19 将乙酸(3mL)加入到N，N’-二苄基乙二胺(6.0g，25mmol)的乙醇(40mL)溶液中，将混合物在60℃下搅拌10min。然后向反应混合物加入4-硝基丁酸叔丁酯(4.73g，25mmol)，继续在60℃下搅拌另外10min。向反应混合物分批加入多聚甲醛(2.5g，83mmol)，将悬液在80℃下搅拌5h，在RT下搅拌过夜。浓缩深色反应混合物，将残余物用碳酸氢钠溶液处理，用乙酸乙酯(400mL)萃取。将乙酸乙酯溶液用水洗涤(2×200mL)，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到深色浓稠的油。经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷洗脱。收集UV可见的级分，蒸发，得到浅黄色油，放置后固化。收率8.9g(86.5％).MS454.3(M+H).
化合物20 将Pd-C10％(2.0g)加入到硝基化合物19(4.5g，10mmol)的甲醇(25mL)溶液中，混合物在50psi下氢化24h。过滤除去催化剂，在旋转蒸发器上除去甲醇。将所得油在真空下干燥24h，得到胺20。收率2.2g(92％).MS244.2(M+H)化合物21 将吡啶(15.0mL)加入到胺20(3.5g，14.4mmol)的二氯甲烷(25.0mL)溶液中，将混合物冷却至-10℃。历经30min滴加三氟乙酸酐(22.7g，15.25mL，108mmol)的二氯甲烷(25.0mL)溶液。将反应混合物在0℃下搅拌3h，在室温下搅拌12h。除去溶剂，将所得糊状物溶于乙酸乙酯(200mL)，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到黄色的油，在真空下干燥，得到泡沫状固体。收率6.92g(90％).
将三氟乙酸(15mL)加入到所述叔丁基酯(5.0g，9.4mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中，将溶液搅拌6h。除去溶剂，将所得褐色的油溶于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。浓缩乙酸乙酯溶液，在真空下干燥残余物，得到21，为黄色泡沫状固体。收率4.23g(95％).MS474.1(M-H)化合物22 将碳酸银(3.43g，12.4mmol)加入到酸21(4.2g，8.8mmol)的乙腈(15mL)溶液中，将混合物搅拌10min。然后向反应混合物加入苄基溴(3.42g，2.4mL，12.4mmol)，继续搅拌5h。向反应混合物加入二氯甲烷(25mL)，过滤。滤饼用二氯甲烷(15.0mL)洗涤。浓缩滤液，所得褐色的油经过柱色谱纯化(硅胶，己烷-乙酸乙酯7∶3)。收集级分(Rf 0.45)，蒸发，得到浅黄色油，在真空下干燥，得到浅黄色固体。收率4.2g(84％).MS588.1(M+Na)化合物23 将硼氢化钠(0.23g，6.0mmol)分两份加入到冷却的三氟乙酰胺22(0.57g，1.0mmol)的绝对乙醇(5mL)浆液中。将反应混合物在10℃下搅拌30min，在室温下搅拌30min。然后向反应混合物加入HCl的乙醇溶液，除去溶剂，得到0.72g粗产物。无需进一步纯化即可用于下一步。MS278.2(M+H)，300.1(M+Na)化合物24 将溴乙酸叔丁酯(1.17g，0.89mL，6.0mmol)加入到盐酸盐23(0.72g，1.0mmol)与碳酸钾(0.83g，6.0mmol)的DMF(1mL)浆液中，将混合物在40℃下搅拌24h。向反应混合物加入二氯甲烷(5mL)，过滤。在真空下除去溶剂，将粗产物溶于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到油，经过硅胶柱色谱纯化(己烷-乙酸乙酯7∶3)。收集级分(Rf 0.5)，蒸发，得到苄基酯24，为浅黄色油。收率0.12g(17％).MS734.4(M+H)，756.4(M+Na)化合物25 在Pd-C10％(150mg)的存在下，苄基酯24(0.15g，0.2mmol)的甲醇(5mL)溶液在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到油。在真空下干燥，得到泡沫状固体。收率0.11g(83％).MS644.4(M+H).
标题化合物25，A-L’(H)然后可以如前文所述通过游离羧基部分与任意适合的氨基多元醇偶联，得到本发明化合物。
实施例29化合物A-L’(OH)(下称化合物30)的制备，其中A是携带被保护羧基的式(IIIa)螯合单元，L’是连接基-CH2-CO-
化合物26将乙酸(4.5mL，75mmol)加入到反式-N，N-二苄基-1，2-二氨基环己烷(10.87g，0.037mmol)的乙醇(50mL)溶液中，在60℃下搅拌10min。然后加入4-硝基丁酸叔丁酯(7.1g，37.5mmol)，继续搅拌另外10min。历经30min分批加入多聚甲醛(3.37g，125mmol)，在80℃下搅拌6h。冷却反应混合物，过滤所生成的固体，用乙醇洗涤，在真空下干燥。收率9.2g(49％).MS508(M+H).
化合物27 将Pd-C10％(2.0g)加入到温热的硝基化合物26(5.1g，10mmol)的甲醇(50mL)溶液中，混合物在50psi下氢化24h。过滤除去催化剂，除去甲醇得到2.92g(98％)胺27。MS298(M+H).
化合物28 将甲磺酸(1.0mL)加入到叔丁基酯27(1.0g，3.37mmol)的苄醇(20mL)溶液中，将混合物搅拌24h。向反应混合物加入THF(100mL)，过滤所生成的固体，用THF研制(2×50mL)，过滤。所得粗的苄基酯直接用于下一步。收率1.2g(57％).MS332.3(M+H).
化合物29 将溴乙酸叔丁酯(0.51g，0.39mL，2.6mmol)加入到28(0.15g，0.45mmol)与碳酸钾(0.5g，3.7mmol)在DMF(4mL)中的混合物中，将混合物搅拌48h。向反应混合物加入二氯甲烷(10mL)，除去溶剂，得到油。所得油经过硅胶色谱处理，用二氯甲烷、再用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱。收集含有产物的级分(Rf 0.4)，蒸发，得到油。收率0.15g(43％).MS788.6(M+H)，826.4(M+K)化合物30 将Pd-C10％(250mg)加入到苄基酯(0.4g，0.19mmol)的甲醇(10mL)溶液中，混合物在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到油，在真空下干燥，得到泡沫状固体。收率0.32g(92％).MS698.4(M+H).
标题化合物30，A-L’(H)然后可以如前文所述通过游离羧基与任意适合的氨基多元醇偶联，得到本发明化合物。
实施例30化合物A-L’(OH)(下称ω-羧基癸基AAZTA)的制备，其中A是式(III)螯合单元，L’是连接基-(CH2)8-CO-
11-溴十一烷酸叔丁基酯将DCC(8.90g，43.4mmol)加入到11-溴十一烷酸(10.0g，37.7mmol)、2-甲基-2-丙醇(8.38g，0.113mol)与DMAP(0.50g，3.77mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2天，滤出所沉淀的二环己基脲，用CH2Cl2洗涤。合并滤液和所合并的洗液，用水(2×50mL)、HCl 1M(2×50mL)、NaHCO35％(2×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。粗产物经过硅胶柱色谱纯化(PET/醚98/2)，得到无色的油3(6.37g，60％)。ESI-MS323-321(MH+)；(计算值C15H29BrO2320u.m.a.)。
11-硝基十一烷酸叔丁基酯在100ml双颈圆底烧瓶中，将11-溴十一烷酸叔丁基酯(6.10g，19.0mmol)滴加到搅拌着的NaNO2(2.60g，38.0mmol)与间苯三酚(3.10g，19.0mmol)的DMF(10mL)溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌24h，然后倒入40mL冰/水与40mL PET的混合物中。分离后，水相进一步用PET萃取(3×30mL)，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩。粗产物经过硅胶柱色谱纯化(PET/二乙醚95/5)，得到浅黄色固体(2.29g，42％)。M.p.39-42℃.ESI-MS288(MH+)；(计算值C15H29NO4287u.m.a.)。
1，4-二苄基-6-(10-叔丁氧羰基癸基)-6-硝基-1，4-二氮杂环庚烷在250mL圆底烧瓶中，将N，N′-二苄基乙二胺二乙酸盐(2.76g，7.65mmol)和11-硝基十一烷酸叔丁基酯(2.20g，7.65mmol)溶于1∶1甲苯/乙醇(100mL)。向该溶液分批加入多聚甲醛(800mg，26.8mmol)，使所得悬液回流。混合物变得均匀(多聚甲醛溶解)，回流3h后，将混合物冷却，在真空中蒸发。残余物经过柱色谱纯化(PET/二乙醚95/5)，得到无色的油(2.90g，69％)。ESI-MS552(MH+)；(计算值C33H49N3O4551u.m.a.)。
6-(10-叔丁氧羰基癸基)-1，4-二氮杂环庚烷-6-基胺在50mL烧瓶中，将1，4-二苄基-6-(10-叔丁氧羰基癸基)-6-硝基-1，4-二氮杂环庚烷(500mg，0.906mmol)溶于甲醇(20mL)。加入Pd/C10％(200mg，用0.2mL水湿润)，继之以甲酸铵(1.14g，18.1mmol)。将混合物搅拌和加热至回流，直至原料完全消失。然后过滤除去催化剂，在真空中蒸发滤液。将残余物重新溶于二氯甲烷，用水洗涤(2×10mL)。将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中蒸发，得到所需三氨基酯(308mg，99.5％)，为无色的油。ESI-MS364(MNa+)，342(MH+)；(计算值C19H39N3O2341u.m.a.)。乙酸叔丁基酯在100mL圆底烧瓶中，将所述三氨基酯(1.16g，3.4mmol)溶于乙腈(20mL)，加入K2CO3(3.76g，27.2mmol)。向搅拌着的多相混合物中缓慢滴加溴乙酸叔丁酯(3.31g，17.0mmol)，同时维持温度＜10℃(冰浴)。加入后，将混合物在60℃下加热，同时搅拌，直至TLC显示完全转化。滤出沉淀，用二氯甲烷洗涤；合并滤液和洗液，在真空中蒸发，得到粗产物。半固体残余物经过硅胶色谱纯化(石油醚/醚8.5/1.5)，得到纯的五酯，为淡黄色油(2.71g，37％)。ESI-MS820(MNa+)，798(MH+)，742(MH+-tBu)；(计算值C43H79N3O10797u.m.a.)。乙酸在50mL圆底烧瓶中，将所述五酯(1.00g，1.25mmol)溶于三氟乙酸(15mL)，在室温下搅拌过夜。然后在真空中蒸发溶液，将残余物溶于甲醇(2mL)。用过量乙醚沉淀出产物，离心分离，用乙醚充分洗涤，在真空中干燥，得到纯的标题化合物(641mg，99％)，为无定形白色固体。m.p.187-190℃(分解).ESI-MS540(MNa+)，518(MH+)；(计算值C23H39N3O10517u.m.a)。
实施例31化合物14a(下称化合物50)的制备根据下列流程Z-L和Z-M制备化合物14a流程Z-L
化合物43将三乙胺(1.66g，2.3mL，16.0mmol)加入到季戊四醇四胺盐酸盐(1.2g，4.3mmol)的DMF(25mL)浆液中，将混合物在室温下搅拌30min。历经3h向反应混合物滴加Lactanolactone5(5.0g，14.7mmol)[(3)Guedj，C.；Pavia，A.A.；Pucci，B.；Riess，J.G.；Zarif，L.WO 94/03468]的DMF(30mL)溶液，在室温下搅拌另外48h。在真空下除去DMF。将所得油性残余物用乙腈研制(3×100mL)，滗析乙腈溶液。将所得固体在真空下干燥，无需进一步纯化即可用于下一步。收率4.5g(91％).MS1153.3(M+H).
化合物44 将N-(苄氧基碳酰氧基)琥珀酰亚胺(3.75g，15.0mmol)加入到所述氨基-三-内酰胺43(4.6g，4.0mmol)与二异丙基乙胺(1.96g，2.65mL，15.0mmol)在DMF(50mL)中的混合物中，搅拌24h。在真空下除去DMF，糊状固体用乙腈研制(3×100mL)，弃去乙腈溶液。所得白色固体在真空下干燥，得到Z-保护的氨基-三-内酰胺44。收率4.72g，(92％).MS1287.3(M+H).
化合物45 将化合物44(5.0g，6.3mmol)溶于吡啶-乙酸酐混合物(1∶1，100mL)，将混合物在50℃下搅拌36h。在真空下除去吡啶-乙酸酐，将深褐色油用水(500mL)处理，放置过夜。过滤所生成的橙色固体，溶于乙酸乙酯，用10％HCl(3×100mL)、饱和碳酸氢钠(2×100mL)和水(2×100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)。蒸发乙酸乙酯，得到橙色泡沫状固体，经过硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯∶己烷(6∶4)洗脱。收集微弱UV可见的级分，蒸发，得到浅黄色固体。收率4.2g(47％)。
化合物46(被保护的氨基多元醇G7)将Pd-C10％(300mg)加入到45(0.46g，2.0mmol)的甲醇(20mL)溶液中，混合物在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到46，为白色固体。收率0.4g(92％).MS2162.6(M+H).
流程Z-M 化合物48 将二异丙基乙胺(0.22g，0.32mL，1.7mmol)加入到冷却的aazta-酸47(0.27g，0.35mmol)与HATU(0.12g，0.31mmol)在DMF(3.0mL)中的混合物中，将混合物搅拌5min。向活化aazta-酸加入化合物46(0.45g，0.21mmol)的DMF(3mL)溶液，将溶液在RT下搅拌12h。在真空下除去DMF，所得浓稠的油用饱和碳酸氢钠溶液处理(2×10mL)。过滤所得黄色固体，干燥。所得粗产物经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱。收集含有产物的级分(Rf 0.5)，蒸发，得到偶联产物，为泡沫状固体。收率320mg(52％).MS2924.6(M+H)，1473.3(M+2H)/2。
化合物49 将Pd-C10％(50mg)加入到四-苄基酯48(30mg，0.01mmol)的甲醇(5mL)溶液中，溶液在45psi下氢化6h。过滤除去催化剂，浓缩甲醇溶液，得到四元酸，为白色泡沫状固体。收率0.22mg(88％).MS2563.3(M+H)，1282.3(M+2H)/2化合物50 向四元酸49(20mg，0.008mmol)加入饱和氨的甲醇溶液(～25％，0.5mL)，将溶液在冰箱中放置48h。过滤所生成的白色固体，用氨的甲醇溶液洗涤(2×0.5mL)，在真空下干燥，得到化合物50。收率7.0mg(58％).MS1552(M-H)，775.7(M-2H)/2实施例32化合物10b(下称化合物54)的制备 化合物52 将二异丙基乙胺(35mg，g，45μL，0.27mmol)加入到冷却的酸47(0.2g，0.24mmol)与HATU(0.1g，0.26mmol)在CH2Cl2(2mL)中的混合物中，将混合物搅拌5min。向活化酸加入化合物46(0.43g，0.2mmol)的CH2Cl2(2mL)溶液，将溶液在RT下搅拌12h。在减压下除去二氯甲烷，所得浓稠的油用饱和碳酸氢钠溶液处理(2×10mL)。过滤所得黄色固体，干燥，经过硅胶柱色谱纯化，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱。收集含有产物的级分(Rf 0.5)，蒸发，得到偶联产物，为泡沫状固体。收率350mg(56％).MS2981.9(M+H)，1502.6(M+Na)/2化合物53 向化合物52(30.0mg，0.1mmol)加入TFA(0.75mL)，搅拌8h。除去TFA，将所得糊状固体溶于CH3CN/水(1∶3，2.0mL)，冷冻干燥，得到化合物53，为白色固体。收率23mg(87％).MS2645.6(M+H)，1323.2(M+H)/2化合物54 向乙酸酯53(20mg，0.0075mmol)加入饱和氨的甲醇溶液(～25％，0.5mL)，将溶液在冰箱中放置48h。过滤所生成的白色固体，用冷氨的甲醇溶液洗涤(2×0.5mL)，在真空下干燥，得到化合物54。收率8.0mg(66％).MS1634.4(M-H)，816.8(M-2H)/2实施例33Gd配合物制备本发明化合物的顺磁性配合物可以按照熟知的方法制备(关于参考文献，参见EP 230893和EP 71564)。
作为非限制性实例，下面说明螯合配体的钆配合物1b(Gd-1b)的制备。
向化合物1b(如实施例4所述所制备)的水溶液加入化学计算当量的Gd-Cl3.6H2O和1N NaOH，保持pH在6-7的范围内。用HPLC检查反应的进程。18h后，通过Millipore_滤器过滤溶液，纳米过滤，浓缩。使脱盐溶液缓慢通过Dowex_CCR3LB柱(Na+型)渗滤，得到所需产物。
实施例34弛豫测定为了更好地评价本发明试剂的弛豫性质和影响弛豫的参数，进行了一些对比试验。在第一项实验中，比较了大量具有不同分子量的Gd-类螯合化合物的弛豫，它们都是从下式[Gd(DTPA-单膦酸)]3-基本骨架结构(20MHz和298K下的r1p6.1mM-1s-1)衍生的
并且都含有一个配位水分子(q＝1)。
供试化合物包括本发明螯合化合物1b和2b的Gd-配合物(下称Gd-1b和Gd-2b)以及大量上述骨架部分的不同衍生物，选择的目的是覆盖高达约1800道尔顿的分子量范围。所有供试化合物的弛豫都是在298K、20MHz和pH7下测量的。所得数值列在下表5中(与化合物的结构一起)，并且对配合物的MW作图(参见图1)。
表5
除Gd-1b和Gd-2b以外所有供试配合物的弛豫都显示与它们的MW呈线性关系。Gd-1b对弛豫提供＞2.5mM-1s-1的额外贡献，在其MW的基础上就这种化合物而言确实是意外的。在这种程度上，由化合物Gd-2b的配合物所显示的提高作用甚至更高。
进行第二项实验，以测试本发明不同化合物、市售NSA、已知LDA和其他系统的弛豫，它们都含有一个配位水分子(q＝1)。在298K、20MHz和pH＝7下记录数据，对它们相应的MW作图。所得结果包括在下表6中，也如图2所示。涉及LDA P760和P792(LDA造影剂)的弛豫数据基于下面引用的文献。
表6

(1)Vander Elst L，Port M，Raynal I，Muller RN等人European Journal of Inorganic Chemistry，2003，13，2495-2501(2)Port M，Corot C，Rousseaux O，等人Magnetic ResonanceMaterials in Physics Biology and Medicine，2001，12，121-127。
进行另一项试验，其中将在20MHz和298K下测量本发明化合物的弛豫值r1p对该化合物的分子重取向值τR作图。所得结果如图3所示。
测试了本发明化合物的弛豫性质的稳定性。在第一项实验中，在从0.01至130MHz的磁场强度范围获取一些本发明化合物的1/T1 NMRD特性。本发明Gd-1b螯合化合物的特性包括在图4中，而螯合化合物Gd-1c、Gd-2c和Gd-3c的相应特性包括在图5和5副中。也对化合物Gd-2b与GD-DTPA(Magnevist_)(一种市售NSA)和GD-DOTA-BSA(一种熟知的血液池试剂)的相应特性进行了比较。
比较的结果显示，本发明化合物的确具备高弛豫，所述弛豫在一定的磁场强度范围内得以保留(参见图6)。
有趣地，在3特斯拉(和298K)下测量的Gd-2b的弛豫仍然接近20mM-1s-1。这显然表明作为本发明的代表性化合物，Gd-2b的弛豫性质在高于0.5特斯拉(ca.20MHz)和高达3特斯拉的场强度下也得以维持。相反，由血液池试剂所显示的弛豫提高作用在相同磁场强度范围内迅速下降。
除了上述以外，请看下表7如上所示测量的本发明一些其他代表性化合物的其他弛豫值。
表7

实施例35药动学测定方案概述按照下列方案可以测试本发明Gd-类造影剂静脉内给药后钆的血浆动力学。
介绍本研究的目标是评价Gd-类造影剂对大鼠单次静脉内(i.v.)给药后钆的血浆动力学。在0.05-0.1mmol/kg的剂量下静脉内处置动物。在不同的时间处死大鼠，最晚且包括给药后24h。收集血样，借助感应偶联等离子体-原子发射分光计(ICP-AES)测定血浆和组织中的钆浓度。而且，收集肝、脾、股骨和肾，评价器官中钆的残留含量。研究采用Gd-DTPA或ProHance(细胞外造影剂)作为对照品，供分布数据比较。
材料供试品本发明化合物对照品Gd-DTPA(Magnevist)或ProHance制剂水溶液0.5M试验系统对大鼠进行实验，因为以前已经对这种动物模型进行过供试品成像实验。
动物大鼠，体重150-200g方法实验工艺-动物处置在实验阶段动物可“随意”饮水。静脉内处置大鼠，因为这是供试品在临床应用中预计采用的给药途径。在室温下给予供试品。在处置之前、之后不久和给药当天的若干时候分别检查动物。
实验设计-处置期研究可以这样进行，使用36只大鼠，随机分配至每一处置组。可以按0.05或0.1mmol/kg的剂量给予供试品。可以按0.1mmol/kg的剂量给予对照品。
预定处死(时间点)可以在处置后0(空白)、2、5、10、20、30、60、120、240、360、480min和24h进行。每次处死三只大鼠。在处死之前1至2min，肌内注射氯胺酮(Ketavet)_0.7mL/kg加赛拉嗪(Rompun)_0.35mL/kg麻醉动物，通过颈动脉放血。将血液收集到含有肝素钠溶液(5000UI/mL)的试管中，肝素钠溶液与血液的比例为约1∶50(v/v)。血样离心(15min，1800g)后得到血浆样品。放血后，切除肝、肾、脾和两侧股骨，称重。所有生物样品都贮存在+4℃下直至分析。
生物样品中钆的测定-设备在Jobin-Yvon Mod 24分光计上进行测定，在下列仪器参数下操作样品流速1mL/min；等离子火焰6000至10000℃；波长342.247nm；氩流雾化器0.3L/min，载气0.2L/min，冷却气12L/min。借助微波系统(MDS-2000 CEM Corporation)进行样品溶解。
样品制备和分析条件将1mL血浆悬浮在1.5mL硝酸(65％v/v)中，制备血浆溶液。借助冷冻干燥过程干燥肝脏，然后在研钵中研磨匀化。将精确称重的200mg组织粉末悬浮在1.5mL硝酸(65％v/v)中，制备肝溶液。将精确称重的每只肾悬浮在1.5mL硝酸(65％v/v)中，制备肾溶液。将精确称重的每只股骨悬浮在1.5mL硝酸(65％v/v)中，制备股骨溶液。将精确称重的脾悬浮在1.5mL硝酸(65％v/v)中，制备脾溶液。利用微波炉系统对这种样品进行湿灰化过程，进行有机基质的破坏。
最后，将干燥残余物溶于3.0mL HCl 5％(w/v)，然后用ICP-AES分析。
数据加工评价三种标准的线性，分别从0.00至20mg(Gd)/L(HCl5％(w/v))。利用仪器校准直线计算供试样品中钆的总含量，以μg(Gd)/mL表示。
数据处理结果的表示钆的浓度表示为组织重量(μg或μmol Gd/g组织)、全器官(μmol/器官)和注射剂量(％ID/器官)。
就骨而言，在计算后者数值时假定骨重量为机体重量的9％。
计算％ID/器官的平均值和标准偏差。
在计算每一时间点血浆中注射剂量的比例时，假定大鼠中的血浆体积为40mL/kg体重。
血液/血浆浓度的时间过程的统计学分析利用计算机程序WIN-NONLIN V2.1(SCI Software，Lexington，KE，USA)，借助非参数方法可以分析注射B22956/1，C(t)后钆的血浆浓度，为时间的函数。利用每一时间点来自3只动物的平均血浆浓度可以进行非区室分析和区室分析。就cmax和相应的tmax而言，所述所观测的数值。借助肉眼估计位于曲线末期的那些数据点的log-线性回归，评估末期消除速率常数(λz)。末期消除半衰期(t1/2λz)被计算为t1/2λz＝1n2/λz。利用对数梯形法从所观测的数据计算直至最后可观测的血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC(0至t))。借助AUC(0至∞)＝AUC(0至t)+ct/λz评估从零至无限远的血浆浓度-时间曲线下总面积(AUC(0至∞))，其中ct是最后量化时间点的预测浓度。借助剂量/AUC(0至∞)评估总血浆廓清率C1。借助MRT.C1评估稳态分布体积Vdss，其中MRT是用AUC(0至∞)/AUMC(0至∞)计算而来的平均驻留时间，AUMC(0至∞)是血浆浓度-时间曲线的第一时刻。也利用区室分析的宏参数评估表观分布体积Vd、分布和消除半衰期。
实施例36血管渗透性评价其中内皮细胞生长在多孔滤器上的体外渗透性模型已经证实是评价不同本发明化合物的血管渗透性和跨血管通过特征的有价值工具(参见M.Corada等Blood，Vol.100，n.3，pp 905-911；and C.Corotet all.Journal of Magnetic Resonance Imaging，Vol.11，2000，pp.182-191)。
这种评价由三个步骤组成(1)MTT测定法，以测定供试化合物的非毒性浓度；(2)选自步骤1的浓度对内皮细胞单层中细胞回缩的影响的评价(回缩被视为非常轻微的和可逆的细胞毒性的迹象)；和(3)利用选自步骤2的浓度，化合物穿过生长在多孔滤器上的内皮细胞单层的评价。
材料供试品本发明化合物；对照品ProHance_，0.5M水溶液；Omniscan_，0.5M水溶液。
试剂生物制品人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由Cambrex BioScienceWalkersville供应，小鼠内皮瘤H5V由Prof.Tiribelli，Centro Studi Fegato，Trieste供应。使HUVEC生长在内皮基础培养基2(EBM-2)和补体与生长因子(EGM-2 Single Quots)中。使H5V生长在90％DMEM培养基与10％胎牛血清中，如C.Garlanda等Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.91，pp 7291-7295 July 1994所述。
化学品青霉素/链霉素(10000μg/mL)，贮存-20℃；L-谷氨酰胺(200mM)，贮存-20℃；胎牛血清(FCS)，贮存-20℃；DMEM培养基，贮存+4℃；EBM-2培养基，贮存+4℃；EGM-2 Single Quots，贮存-20℃；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)，贮存+4℃；FITC葡聚糖，P.M.约40.000，贮存+4℃，暗处；人血清白蛋白，贮存+4℃，暗处。
试验系统选择内皮细胞单层是因为它最适合在体外模型中测试具有血管外性质的Gd-类化合物的体外渗透性和外渗。
方法实验过程细胞毒性将细胞用盐水洗涤两次，重新悬浮在培养基中，接种在96-孔平板中，密度为15000至30000细胞/200μL/孔(依赖于细胞类型)，至少24小时后开始MTT试验。
供试品工作溶液的制备将供试品和对照品稀释在无胎牛血清的培养基中，得到20mM溶液。
微量平板处理从细胞接种后24小时开始，向小孔加入供试品，浓度为0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10和20mM，每种浓度6只孔。
MTT向每孔加入MTT，细胞在37℃下温育4小时。除去温育介质，用1∶1 DMSO/乙醇溶液增溶被活细胞结合的染剂。在570nm下，在微量平板读数器中测定每孔的光密度。
回缩测定法将转孔滤器用无胎牛血清的培养基冲洗一次，在该转孔滤器的下部区室加入600μL生长介质。
将H5V细胞接种在滤器上，体积为100μL，密度为15000细胞/滤器，也接种在96-孔平板中，密度和体积相同，以监测细胞生长。每隔一天更换上部和下部培养基，接种后至少4天，细胞单层用于实验，此时96-孔平板中的细胞紧密融合。
在进行测定之前，将至少两只转孔滤器用结晶紫染色，以检查单层条件。
向上部区室加入葡聚糖-FITC(100μL 0.1mg/mL溶液)以及非毒性剂量的供试化合物，含有或不含人血清白蛋白(3.5％w/v)。在进行测定之前用EGTA 5mM温育4小时，得到渗透化单层。
就葡聚糖-FITC剂量而言，在温育30和60分钟后，从下部和上部区室除去培养基(每个时间至少4只转孔)，将样品按1∶6稀释在PBS中，利用荧光计测定荧光，激发和发射波长分别为492和520nm。
渗透性将滤器用无胎牛血清的培养基冲洗一次，在该转孔滤器下部区室加入600μL生长介质。
将H5V细胞接种在滤器上，体积为100μL，密度为15000细胞/滤器，也接种在96-孔平板中，密度和体积相同，以监测细胞生长。每隔一天更换上部和下部培养基，接种后至少4天，细胞单层用于实验，此时96-孔平板中的细胞紧密融合。
在进行测定之前，将至少两只转孔滤器用结晶紫染色，以检查单层条件。向上部腔室加入从回缩测定法所得无回缩效应浓度的供试化合物，含有和不含人血清白蛋白(3.5％)。在相同条件和浓度下加入ProHance_。在进行测定之前用EGTA 5mM温育4小时，得到渗透化单层。
在温育15和30分钟后，从下部和上部区室除去培养基(每个时间至少4只转孔)，借助感应偶联等离子体-原子发射分光计(ICP-AES)分析测定钆的含量。
数据分析数据以每组光密度值的平均±标准偏差表示。利用参数检验(Dunnett’s检验)比较参数。
通过如上所述操作，测试了本发明的代表性化合物(Gd-2b)，以评估渗透性。所收集的数据正如图7所述，清楚地表明G2-2b被赋予与ProHance_相当的外渗性质，后者是一种熟知的(NSA)钆类顺磁性造影剂。
实施例37C6细胞诱发神经胶质瘤的正位大鼠模型的鉴别利用磁共振成像(MRI)评价新颖的本发明造影剂鉴别脑肿瘤的好处和评价它们的外渗作用。
本研究的目标是开发神经胶质瘤的大鼠模型，目的是利用体内MRI评估本发明化合物相对于常用于中枢神经系统疾病的造影剂(MultiHance和ProHance)的有效性。为此，评价置于大鼠脑中不同数量C6细胞的肿瘤生长。
在接种106C6细胞的动物组中，2周时的肿瘤大小和组成比其他组更均匀。在脑肿瘤的信号增强方面，造影剂(CA)之间没有观察到显著差异。
本研究提示，106C6细胞接种大鼠后2周是适当的条件，目的是获得适合于评价新CA的早期脑肿瘤形成。
介绍造影剂习惯上在磁共振成像(MRI)中用于评价脑血管系统的完整性和鉴别脑损伤(Fonchy E.等人，J.of Magnetic Resonance Imaging，2001，14，97-105.1)。MRI是最有用的脑肿瘤诊断方法之一，因为它能够揭示组织特征。
本研究的目标是开发在大鼠脑中接种C6细胞诱发神经胶质瘤的模型。借助MRI监测这种实验性脑肿瘤的肿瘤生长和渗透性，反映在不同造影剂(CA)的动态信号增强。
为此，在早期肿瘤形成的C6神经胶质瘤大鼠模型上，借助体内MRI比较高弛豫造影剂与标准化合物(ProHance和MultiHance)(Zhang T.等人，AJNR，2002，23，15-18.2)。
材料供试品本发明化合物，0.25M水溶液；对照品MultiHance_；ProHance_0.5M；均贮存在室温下。
化学品青霉素/链霉素(10000mg/mL)，贮存＜-20℃；L-谷氨酰胺(200mM)，贮存＜-20℃；胎牛血清(FBS)，贮存-20℃；马血清(HS)，贮存-20℃；Ham′s F12K培养基，贮存+4℃；Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS)，贮存室温。
试验系统选择大鼠作为试验系统，因为它是适合于这种研究的模型。
动物种属和品系Wistar大鼠Crl(WI)BR和Fischer大鼠CrlBR；38只Wistar和12只Fischer雄性；到达时的体重和大小106与151g之间，4-5周；供应商Charles River LaboratoriesItalia S.p.A.，Calco(LC)，Italy。
动物饲养饲料4RF21-GLP TOP CERTIFICATE颗粒，由Mucedola，Settimo Milanese(MI)，Italy供应，被证明没有雌激素活性，杂质水平在Toxic Substances Control Act in the Federal Register partIV，July 26，1979所建议的限度内。饲料可“随意”获得，直至实验前一天。水来自Milan市政水供应的自来水，通过1.0和0.2μm滤器过滤。水可“随意”获得。基床材料Sano-Chip_，由Charles River供应，被证明没有毒性浓度的杂质。居住在检疫期间动物居住(至多3只动物/笼)在Makrolon_笼(Tecniplast Gazzada，Italy)中。
环境条件在整个研究阶段，使动物维持在受调节的和有限的活动环境中。参数设置如下平均相对湿度(最小-最大值)55.0％(45-65％)；平均温度(最小-最大值)21.0℃(18-24℃)；空气更换15至20h-1。
光照受自动时钟控制，每天12h光照期。
每30秒监测温度和相对湿度数据，每5分钟记录在计算机数据库中；计算每日平均值。
所有牵涉动物的过程都是按照国家和国际有关实验动物的法律进行的。已知没有经过验证的非动物替代品可满足本研究的目的。
方法实验设计供脑内注射的细胞制备物将C6细胞用PBS洗涤两次，按三种不同的浓度(1.104；1.105；1.106)重新悬浮在10μL PBS中，利用Hamilton注射器接种在三组动物中。
供皮下注射的细胞制备物将C6细胞用盐水洗涤两次，按下列浓度重新悬浮在200μL PBS中1.106、1.5×106和1.10×106。
脑内肿瘤接种大鼠已被麻醉后，剪去头部的毛，消毒，切开皮肤，暴露出头颅。将动物置于大鼠趋实体工具中，在两只耳/管和上颚中固定头部。在头颅中钻孔，利用Hamilton注射器向右侧纹状体中注射神经胶质瘤细胞，坐标如下距前侧0.8mm，前囟旁侧3.2mm，骨腹侧4mm。细胞注射后，监测动物的神经病学临床迹象发生。
皮下肿瘤接种将不同浓度的细胞悬液皮下注射到12只Fisher和12只Wistar雄性大鼠中(每组4只动物，4-5周龄)。
从第3天开始，每3-5天检查所有动物的肿瘤块发育。用卡尺测量肿瘤块，计算肿瘤体积肿瘤体积＝(D×d2)/2，其中D＝最大直径，d＝最小直径。
MRI程序在C6注射后从第7天开始到第10天，肌内注射剂量为0.2mL/kg的tiletamine/zolazepam(Zoletil)_和剂量为0.25mL/kg的Xilazine(Rompun)_，麻醉大鼠。
静脉内给予本发明化合物和参照造影剂(ProHance和Multihance)，剂量为0.1mmol/kg(B22956/1为0.05mmol/kg)，为单次注射。
以下列方式进行MRI检测利用T1加权的梯度回声(GE)顺序获得探测(Scout)图像，供解剖定位。
在三个方向使用高分辨率T2加权的快速自旋回声(FSE)(TR/TE/TEeff＝2300/30/60ms，4次回声，4次平均，像素＝281μm，切片厚度＝1.5mm)，以定位和鉴别肿瘤，特别是坏死区域。
在造影之前和之后获取高分辨率轴向T1加权的自旋回声(SE)图像(TR/TE＝380/13ms，4次平均，像素＝281μm，切片厚度＝1.5mm)。每±3分钟获取连续T1SE造影后图像，直至注射后40分钟。将一支3.75mM NiCl2-6H2O水溶液的试管放置在动物头部水平，用作信号归一化的标准参照。
在实验结束时，肌内注射tiletamine/zolazepam(Zoletil)_0.2mL/kg加Xilazine(Rompun)_0.25mL/kg处死动物，肉眼验证可能的宏观脑转移瘤发育。
利用SMIS扫描软件分析图像。从在覆盖全脑肿瘤的有关区域(ROI)和正常脑区中测量的信号计算信号增强作用。
数据分析如下测定信号强度增强作用(Enh％)Enh％＝100*(SI post-SI pre)/SI pre其中SI pre或SI post是在造影剂之前或之后测量的损伤的平均信号强度。
结果脑内肿瘤鉴别在第一项实验中，借助体内MRI观察接种10,000至1,000,000个C6细胞的三组动物的肿瘤生长。接种后2周，在104细胞组中没有可检测的损伤，而在105和106组中损伤是显著的，如图1和2所示。就104细胞组而言，损伤缓慢增加，在接种后4周达到显著的体积大小，但是动物之间的差异性较高。在105和106细胞动物中观察到肿瘤体积有明显增加。不过在106细胞组中，在2周时肿瘤大小和组成比其他组更均匀。
皮下肿瘤鉴别在Wistar雄性大鼠中植入C6细胞导致从第6天开始100％的动物有肿瘤发育，但是肿瘤的存在及其体积从植入后第17天开始迅速降低，直至完全排斥(第天)。跟踪所有动物直至细胞接种后50天，没有肿瘤复发的迹象。
在Fisher雄性大鼠中植入C6细胞导致100％的动物有肿瘤发育，就10×106细胞而言从第3天开始，就5和1×106细胞而言从第5至8天。
不过，肿瘤的存在及其体积从植入后第15天开始迅速降低，直至完全排斥(第28天)。跟踪所有动物直至细胞接种后35天，没有肿瘤复发的迹象。
造影增强作用在用105和106C6细胞接种的大鼠中，用CA在2周时观察到脑肿瘤的信号增强；脑肿瘤的最大信号增强似乎随肿瘤体积增加。而且，就大型肿瘤而言，信号增强似乎是均匀的。在所测试的造影剂之间没有发现差异。从这些第一结果，对用106C6细胞接种的大鼠进行下列实验，2周后，利用不同的CA借助体内MRI分析它们。
在T2加权的造影前图像上，在一些动物(8/15)中观察到肿瘤中的暗区，这可能相当于坏死内核。在这些动物中，利用任何种类的CA，信号增强都没有不同于其他大鼠。
就全部动物而言，在脑肿瘤的信号增强方面在CA之间没有观察到显著差异。在正常脑组织和在假对照动物中没有观察到增强作用。
结论在大鼠纹状体中正位(orthotopical)注射1.106神经胶质瘤细胞导致从细胞接种后2周开始80％的动物有脑肿瘤。
在本研究中，寻找最佳实验条件，目的是得到适合于体内MRI研究的脑肿瘤模型-发育早期的小肿瘤大小；-可由体内MRI检测；-在合理的时间内获得(接种后2周)；-动物之间肿瘤大小和组成的同质性。
总之，这是一种可用于脑肿瘤MRI成像和评价造影剂血管外分布的模型。
而且，同系繁殖和远系繁殖大鼠品系中的皮下C6注射都没有导致稳定的肿瘤模型。事实上，在100％的动物中有肿瘤发育，但是它们的存在和体积开始迅速降低直至完全排斥。出于这种原因，eterothopical C6植入不适合于成像研究。
在本发明的上述说明中，引用或参考各种专利、文章和其他出版物。每份专利、文章和其他出版物的完整内容都结合在本申请中作为参考。
权利要求
1.下式化合物A(LR)v(I)其中A是线性或环状螯合骨架部分；R独立地是H或者C2-C70氨基多元醇部分，包含直链或支链烷基链，被2至30个羟基取代，所述链可选地被一个或多个选自如下的基团中断-O-、-NH-、-N<、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-CON<或>NCO-；并且可选地被一个或多个C4-C10环状单元取代；L独立地是价键或者A与R之间的二价直链或支链连接基部分，至多包含20个碳原子；v是1至7的正整数；其条件是至少一个R基团不是H；或者这类配体的生理学上可接受的盐。
2.根据权利要求1的式(II)化合物 其中R和L如权利要求1所定义，以及所述膦酸根(-PO3H2)和羧酸根(-COOH)的相应质子化形式。
3.根据权利要求2的式(II)化合物 其中R和L如权利要求1所定义，以及所述膦酸根(-PO3H2)和羧酸根(-COOH)的相应质子化形式。
4.根据权利要求3的式(II)化合物 其中R和L如权利要求1所定义，以及所述膦酸根(-PO3H2)和羧酸根(-COOH)的相应质子化形式。
5.根据权利要求1至4任意一项的式(I)或(II)化合物，其中L代表价键或者包含至多15个碳原子的连接基。
6.根据权利要求5的化合物，其中L代表价键或者下式连接基 其中n和n’独立地是0或者整数1至4，p、q和s独立地是0或1。
7.根据权利要求6的化合物，其中L代表价键或者下式基团 其中n、q和s如权利要求6所定义。
8.根据权利要求1至4任意一项的式(I)或(II)化合物，其中在R的含义内，任何C4-C10环状单元独立地是碳环或杂环，可选地被一个或多个选自羟基、羟甲基和氨基的基团取代。
9.根据权利要求8的化合物，其中该碳环或杂环选自
10.根据权利要求1至4任意一项的式(I)或(II)化合物，其中每个R独立地是H或者选自-NH-(CH2)0-2-C[(CH2)1-2-O-Q]3；-NH-(CH2)1-2-CON[(CH2)1-3-CONH-C[(CH2)1-2-O-Q]3]2；-N[(CH2)1-4-NHCO-(CHOH)4-CH2OH]2；-NH-(CH2)0-2-C[(CH2)1-4-NHCO-(CHOH)4-CH2OH]3；-N[(CH2)1-4-N[(CH2)1-4-COY]2]2；-NH-C[(CH2)1-4-COY]3；-NH-C[(CH2)1-2-O-(CH2)1-3-COY]3；-NH-CH(COY)[(CH2)1-2-COY]；-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2；-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2]2；-NH-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-CH[(CH2)1-2-O-(CH2)0-2-C(R1)(CH2OH)2]2]2]2；其中Q是下式基团 R1是H或甲基；和Y独立地选自
11.根据权利要求10的化合物，其中每个R独立地是H或者选自下式基团A1至A2、B1至B3、G1至G11、C1至C11、D1至D11、E1至E11和F1至F11
12.根据权利要求3的式(II)化合物 其中1b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团B1，R2是H；2b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团B2，R2是H；3b)L1是-CH2CO-，L2是-CH2CO-，R1是基团B1，R2是基团B1；4b)L1是-CH2CO-，L2是-CH2CO-，R1是基团B2，R2是基团B2；5b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团G9，R2是H；6b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团G3，R2是H；7b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团C1，R2是H；8b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团E1，R2是H；9b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团G10，R2是H；10b)L1是价键，L2是-CH2CH2CO-，R1是H，R2是G7；11b)L1是-CH2CO-，L2是价键，R1是基团G8，R2是H；其中任何基团B、C、E和G是如权利要求11所定义的，及其生理学上可接受的盐。
13.根据权利要求1至4任意一项的式(I)或(II)化合物及其生理学上可接受的盐，是与二价或三价顺磁性金属离子的螯合配合物，所述金属离子选自Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)、Mn(3+)和Gd(3+)。
14.根据权利要求13的化合物，其中该顺磁性金属离子是Gd(3+)。
15.根据在先权利要求任意一项的化合物，其中该生理学上可接受的盐是酸或碱加成盐，选自碱金属或碱土金属，例如钾、钠、钙或镁；有机碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡糖胺、N-甲基葡糖胺和N，N-二甲基葡糖胺；无机或有机酸的阴离子，例如氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根、乙酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、富马酸根、马来酸根、草酸根；和氨基酸，例如牛磺酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或者天冬氨酸和谷氨酸的阳离子和阴离子。
16.制备根据权利要求1至4任意一项的式(I)或(II)化合物、权利要求15的生理学上可接受的盐和权利要求13的其螯合配合物的方法，该方法包含1)制备氨基多元醇部分R的适合形式，其中氨基参与与分子其余部分(A-L)的偶联反应，它和羟基可以适当地和独立地被保护或活化；2)制备连接基L的适合形式，其中任何作为其一部分的可选官能团可以独立地和适当地被保护或活化；3)制备骨架螯合部分A的适合形式，其中任何参与或不参与金属配位和与分子其余部分共价结合的官能团可以适当地和独立地被保护或活化；可选地，其中螯合部分A可以是已经与所选择的顺磁性金属离子配位化合；4)在任何A、L和R部分中裂解任何所选择的官能团的任何所选择的保护基团和/或活化，以任意适合的顺序偶联基团A、L和R；5)裂解任何保护基团，分离式(I)或(II)化合物；可选地，6)配位化合式(I)或(II)化合物与所选择的顺磁性金属离子，继之以分离螯合配合物和/或其盐。
17.对应于下式以及如权利要求11所定义的式A2、B2、B3、G1至G11和C1-C11、D1-D11、E1-E11和F1-F11氨基多元醇的胺和酸加成盐
18.用于诊断用途的根据权利要求13的式(I)或(II)化合物的螯合配合物。
19.根据权利要求13的式(I)或(II)化合物的螯合配合物制备药物组合物的用途，该药物组合物用于采用M.R.I.的人或动物体器官或组织的诊断成像。
20.用于诊断用途的药物组合物，包含有效量的根据权利要求13的式(I)或(II)化合物的螯合配合物以及可选的载体、稀释剂和赋形剂。
21.根据权利要求20的药物组合物，包含式(I)或(II)化合物的Gd螯合配合物。
22.采用MRI使人或动物体器官或组织成像的方法，所述方法包含对人或动物体给予权利要求20的药物组合物，并利用MRI使所述人或动物体成像。
23.顺磁性金属离子类非特异性造影剂(NSA)，具有低分子量，特征在于在约0.5至约3MHz的磁场强度下基本上保留高弛豫。
24.根据权利要求23的(NSA)造影剂，具有低于3.5kDa的分子量。
25.根据权利要求23的(NSA)造影剂，其中该顺磁性金属离子选自Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)、Mn(3+)和Gd(3+)。
26.根据权利要求25的(NSA)造影剂，其中该顺磁性金属离子是Gd(3+)。
全文摘要
本发明涉及一类新颖的式(I)顺磁性离子类造影剂，其中在一条或多条多羟基化链的存在下螯合骨架部分是高度官能化的，它们显示类似于常用T1－代血管外试剂(NSA)的药动学行为，但是进一步以高弛豫为特征。下式化合物A(LR)
文档编号C07D233/02GK1993357SQ200580026674
公开日2007年7月4日 申请日期2005年6月28日 优先权日2004年7月2日
发明者S·艾米, M·格里, L·拉图塔, P·莫洛希尼, F·尤吉里, R·康达尔蒂尔 申请人:伯拉考成像股份公司