专利名称：：溶杆菌素片段的特定制备方法溶杆菌素片段的特定制备方法
技术领域：
：本发明涉及通过组合的化学的和酶促修饰，靶向制备溶杆菌素衍生物的方法。特别是，本发明涉及通过化学还原以及将所得产物用胰凝乳蛋白酶促裂解而制备溶杆菌素片段4-11的方法。溶杆菌素是环酯肽，其来源于发现新抗生素的筛选程序，在细菌细胞壁的生物合成中起作用。(O'Sulli靈J.等.(1988)J.Antibiot.41(12),1740-1744和Bonner，D.R等.(1988)J.Antibiot.41(12),1745-1751;Tymiak，A.A.etal.(1989)J.Org.Chem.54，1149-1157)。它针对革兰氏阳性好氧和厌氧菌显示强活性。不寻常的特征是所述分子中高数量的非-蛋白原氨基酸。除了三种p-羟基氨基酸(2S，3R)-P-羟基亮氨酸、(2S，3R)-P-羟基苯丙氨酸和(2S,3S)-(3-羟基天冬酰胺，还存在D-氨基酸D-亮氨酸和D-精氨酸还有异-苏氨酸(allothreonine)。天然产物溶杆菌素的这个复杂性和尺寸是靶向化学修饰的巨大障碍。因此本发明的一个目的是提供新的和备选的溶杆菌素片段靶向合成用的合成方法，以便可以利用溶杆菌素片段制备新的抗生素。通过耙向酶促裂解、靶向酶的生产和随后的溶杆菌素片段的连接与化学修饰例如加氢过程组合而提供解决方案。通过用酶类诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和粘膜肽酶水解获得的溶杆菌素和开链形式("开-链溶杆菌素"；式(I)的化合物)的酶消化实验显示没有(诸如在胃蛋白酶情况下，例如)或仅有不充分的酶消化(R.A.Blackbum等.(1993)DrugMetab.Dispos.21(4)，573-579)。非常缓慢的效率低的溶杆菌素酶裂解仅发生在使用的缓冲液中通过水解的环打开以后。这导致在(2S,3SH3-羟基天冬酰胺对于侧链脱酰胺基作用所不希望的副反应。即(3-羟基天冬酰胺单元转化成(3-羟基天冬氨酸盐或酯。令人意外的是，已经发现，可以利用来自二氢溶杆菌素(式(II)的化合物)和八氢溶杆菌素(式(ni)的化合物)以及来自两个组分混合物的胰凝乳蛋白酶，通过酶促裂解高效率地并定量地产生溶杆菌素片段4-11。所述裂解发生如此迅速以致在反应伴侣(底物和酶)的结合以后实际上形成了片段1-3和4-11。在所述氨基酸侧链中不发生不希望的副反应。通过用氢将溶杆菌素氢解打开而获得二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素，由此将(28，311)-P-羟基苯丙氨酸单元转化成苯丙氨酸或3-环己基丙氨酸单元。然后将合成的溶杆菌素片段二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素用于酶促消化。令人意外地是，二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素对于其它酶类也是良好的底物，以致通过所述酶的选择也可以高收率地产生其它片段。本发明涉及制备二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的方法，其中通过在溶剂中用氢在氢化催化剂存在下的氢解开环(hydrogenolyticringopening)将溶杆菌素转化成二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素。氢化催化剂是，例如，钯、钌、铑、铱和铂催化剂，或阮内镍。可以将这些催化剂用作盐(例如二氧化铂、氯化铑(III))或用作载体催化剂(例如碳载钯(碳载钯)(5-30。/。)或碳载铑(rhodiumoncarbon)(5%))。对于载体催化剂适合的载体材料是，例如，活性炭、硅藻土、硅胶、膨润土、高岭土、浮石、铝硅酸盐或氧化铝。优选的载体材料是活性炭。还可以使用双金属催化剂或其它多组分催化剂。优选钯催化剂，例如碳载钯(5-30%)，特别优选碳载钯(10%)。氢解开环一般发生溶剂中，优选在室温至150°C的温度范围中，优选在室温至80。C的温度范围中，在大气压至200巴的大气压范围中，优选在3至80巴的压力中。溶剂是，例如，醇类诸如甲醇、乙醇、或异丙醇，或醇与水的混合物，或乙酸或乙酸的水溶液，或THF-水混合物，或二噁烷-水混合物，或其它上述溶剂的三元混合物，例如异丙醇-水-乙酸。优选异丙醇-水混合物。本发明还涉及制备溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3的方法，其中将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素是酶法裂解而提供溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3。优选二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶裂解，其中将真核的丝氨酸蛋白酶或微生物的丝氨酸蛋白酶用作酶。真核的丝氨酸蛋白酶是，例如，胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G、糜蛋白酶或其它胰凝乳蛋白酶族的酶类，或其它在芳族氨基酸之后裂解的真核丝氨酸蛋白酶，优选胰凝乳蛋白酶。微生物丝氨酸蛋白酶是，例如，枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶A或在芳族氨基酸之后裂解的其它酶类，优选枯草杆菌蛋白酶。本发明还涉及二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶裂解以产生较小的溶杆菌素片段的方法。本发明因此还涉及制备溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶裂解而提供溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9。优选二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶促裂解，其中将金属蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶用作酶。金属蛋白酶是，例如，嗜热菌蛋白酶或mycolysin。半胱氨酸蛋白酶是，例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶。所述酶裂解一般发生在加入CrC4醇或乙腈的水裂解缓冲液中，优选在10°C至40。C的温度范围中，优选在6至9的pH中，在大气压下。水裂解缓冲液含有，例如，碳酸氢铵和脲，或磷酸钠，半胱氨酸和EDTA，或四硼酸钠，或其它包括pH6至9缓冲范围的添加剂，优选碳酸氢铵和脲。Q-C4醇是，例如，甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇。特别优选，所述酶裂解发生在30。C至37。C的温度范围中。所述反应介质中的乙醇浓度是0%至40%，优选10%至15%。酶对底物(二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素)的比例是1:1至1:4000，优选1:25至1:100。本发明还涉及溶杆菌素片段4-11用于溶杆菌素衍生物的合成。这些溶杆菌素衍生物是其中将溶杆菌素的环状体系中的一个或多个氨基酸取代的衍生物。本发明还涉及制备开链溶杆菌素衍生物的方法，其中将溶杆菌素片段4-ll与具有C-末端芳族或疏水性氨基酸的三肽在加入CM醇的缓冲液介质中反应，其中所述三肽以游离酸或酯的形式存在并且其中Cm醇在所述反应介质中的浓度大于40%。所述C广C4醇是，例如，甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇。优选从溶杆菌素片段4-11和三肽H-D-X-Y-Phe-OR或H-D-X-Y-(3-环己基)Ala-OR在加入甲醇的缓冲液介质中酶促合成开链溶杆菌素衍生物的方法，其中在反应介质中的甲醇浓度大于40%，R表示氢或CKV烷基，优选乙基或甲基，特别优选甲基，D-X表示天然的或合成的D构型的oc-氨基酸禾口Y表示天然的或合成的L构型的ot-氨基酸。特别优选从溶杆菌素片段4-11和三肽H-D-Leu-Leu-Phe-0甲基、H-D-Leu-Leu-Phe-OH、H-D-Leu-Leu-(3-环己基)Ala-0甲基或H-D-Len-Leu-(3-环己基)Ala-OH酶促合成开链溶杆菌素衍生物的方法，其中将胰凝乳蛋白酶用作加入甲醇的缓冲介质中的酶，在所述反应介质中的甲醇浓度大于40%。图l:用胰凝乳蛋白酶的预备酶促裂解的时间过程(实施例11)。用胰凝乳蛋白酶预备酶促裂解二氢-和八氢溶杆菌素混合物的HPLC图的重叠。分离条件如实施例30下的描述中所报道(UV检测210nm)。图2:用胰凝乳蛋白酶酶促裂解八氢溶杆菌素的时间过程(实施例5)。用胰凝乳蛋白酶酶促裂解八氢溶杆菌素的CZE图的重叠。分离条件如实施例31下的描述中所报道(UV检测210nm)。定义二氢溶杆菌素D-Leu-Leu-Phe-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-异-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser八氢溶杆菌素D-Leu-Leu-Ala(3-环己基)-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-异-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser溶杆菌素片段4—11:Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser溶杆菌素片段1-3:D-Leu-Leu-PheorD-Leu-Leu-Ala(3-环己基)在化学和酶促反应的过程中使用的方法和分析表征在下文列出。实施例缩写aq.水的atm大气压(压力单位)cone.浓縮的CZE毛细管区带电泳DCI直接化学电离(在MS中)DCM二氯甲烷DMSO二甲基亚砜EDTA乙二胺四乙酸EI电子碰撞电离(在MS中)ESI电喷雾电离(在MS中)h小时(小时的复数)HPLC高压，高效液相色谱HR高分辨率LC-MS液相色谱耦合的质谱法LL(3-环己基)AD-Leu-Leu-(3-环己基)AlaIXFD-Leu-Leu-Phemin分钟/分钟的负数MS质谱法neg.负的画R核磁共振光谱法Pd钯Pd-C碳载钯pos.正的PTFE聚四氟乙烯quant.定量的RP-HPLC反相HPLCRT室温Rt保留时间(在HPLC中)TFA三氟乙酸TOF飞行时间UV紫外线的Vis可见的参考文献对于肽和环酯肽的命名法，参考:1.AGuidetoIUPACNomenclatureofOrganicCompounds(Recommendations1993》1993,BlackwellScientificpublications.2.Nomenclatureandsymbolismforaminoacidsandpeptides.Recommendations1983.IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature,UK.BiochemicalJournal1984,219,345—373,aswellascitedliterature.一般方法，GC-MS,LC-MS，HR-MS和HPLC方法1(LC-MS):仪器类型MS:MicromassZQ;仪器类型HPLC:HP1100系列；UVDAD;柱PhenomenexSynergi2nHydro陽RPMercury20mmx4mm;洗脱液A:11水+0.5ml的50%甲酸，洗脱液B:11乙腈+0.5ml的50%甲酸；梯度0.0min90%A~>2.5min30%A^3.0min5%A—4.5min5%A;流动0.0min1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min2ml/min;炉50。C;UV检测210nm。方法2(制备的HPLC;对称；三氟乙酸)仪器GilsonAbimedHPLC;UV检测器210■;双泵系统；柱SymmetryPrepTMC18,Waters,7pm;300x19mm;洗脱液A:水中0.05%三氟乙酸，洗脱液B:乙腈中0.05%三氟乙酸；梯度0-5min5%B以流速20ml/min，5-30min梯度斜线从5至60%B具有下列流速的增加从6min的22ml/min，从10min的23ml/min，从15min的24ml/min;30-35min梯度斜线从60%至98%B流速从38min减少到21ml/min;40-45min10%B。方法3(通过HPLC的二氢-和八氢-溶杆菌素的制备分离的方法)柱:SymmetryPrepTMC18,Waters,7|im300x19mm;流动25ml/min;RT;洗脱液A:水中0.2%TFA，洗脱液B:乙腈，0-10min梯度80%A,20%B至35%A,65%B;10.01-15min:80%A，20%B;翻210跳经由LC-MS监控级分(方法1),在旋转蒸发器上除去乙腈并冷冻干燥。方法4(分析的HPLC1100，ZQ2,Phenomenex,Synergi,Hydro-RP):仪器类型HPLC:HP1100系列；UVDAD;柱Phenomenex,MercuryMS,Synergi2pHydro-RP20x4mm;洗脱液A:水/0.05%甲酸，洗脱液B:乙腈；梯度0.0-2.5min，90—30%A，流动1-2ml/min，2.5—3.0min,30—5%A,流动2,0ml/min，3.04.5min，5%A;炉50。C;UV检领U:210nm。方法5(TOF-HR-MS):利用MicromassLCT仪器(毛细管电压3.2kV，区带电压42V,源温度120°C,去溶剂化温度280°C)记录TOF-HR-MS-ESI+光谱。为此，将注射泵(HarvardApparatus)用于样品引入。将亮氨酸脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)用作标准。方法6(HPLC):仪器类型HPLC:HP1100系歹U;UVDAD柱ZorbaxEclipseXBD-C8(Agilent),150mmx4.6mm,5pm;洗脱液A:5ml的HC104/1水，洗脱液B:乙腈;梯度0-1min10%B,1-4min10-90%B,4-5min90%B;流动2.0ml/min;炉30°C;UV检测:210and254亂方法7(HPLC):柱KromasilRP-18,60mmx2mm,3.5拜;洗脱液A:5ml的HC104/1水，洗脱液B:乙腈;梯度0min2%B,0.5min2%B,4.5min90%B，9min90%B;流动0.75ml/min;炉30。C;UV检测:210nm。方法8(HPLC):柱KromasilRP-18，250mmx4mm,5拜;洗脱液A:5ml的HC104/1水，洗脱液B:乙腈；梯度0min5%B,10min95%B;流动1ml/min;炉40。C;UV检观U:210nm。方法9(HPLC):柱KromasilRP-18,250mmx4mm,5pm;洗脱液A:2ml的HC104/1水，洗脱液B:乙腈；等度45%B,55%A;流动1ml/min;炉40。C;UV检测210nm。方法10(HPLC):仪器具有DAD(G1315B)，双泵(G1312A)，自动取样器(G1313A)，溶剂除气器(G1379A)和柱恒温器(G1316A)的Agilent1100;柱AgilentEclipseXDB-C84.6x150x5mm;柱温40。C;洗脱液A:水中0.05%的70%高氯酸;洗脱液B:甲醇；流动2.00ml/min;等度0-7min55%B。方法11(HPLC):分析的HPLC方法菠萝蛋白酶/胰凝乳蛋白酶裂解。将约20jig的酶促裂解产物或起始化合物在300SB-C18柱(4.6mmx125mm;3.5材料；300Angstr6m孔径)上色谱。作为洗脱液，使用乙腈/TFA梯度。洗脱液A:水中的0.1。/。TFA，洗脱液B:60。/。乙腈/40。/。水中的0.1%TFA;梯度0min0%B,2min10%B,50min80%B,52min100%B,55min0%B，60min0%B;流动0.7ml/min;柱温40。C;銜则210nm。二氢-,八氢溶杆菌素和酶促裂解产物的蛋白质化学表征仪器利用来自AppliedBiosystems的蛋白质序列分析仪ProciseTM进行序列分析。使用标准的序列测定程序。序列分析仪，多种序列测定程序还有PTH检测系统详细描述在操作手册User'sManualSet,ProteinSequencingSystemProcise(1994)，AppliedBiosystemsForsterCity,CA94404，U.S.A.中。从AppliedBiosystems获得操作序列分析仪和PTH检测用的HPLC柱的试剂。利用来自Agilent的HP1100HPLC系统进行HPLC分析。将来自Agilent(D-Waldbronn)的Zorbax300SB-C18柱(4.6匪x150mm;3.5|am材料；300Angstr6m孔径)用于分离。使用的试剂是HPLC品质并且是从Merck(D-Darmstadt)获得。毛细管电泳型号270A-HT是来自AppliedBiosystems。一般将样品经过不同时期流体地注入。使用的毛细管柱(50直径x72cm长度)是来自AppliedBiosystems。分离程序和分析仪的功能充分描述在所述仪器的手册中(User'smanualcapillaryelectrophoresissystemmodel270AHT;AppliedBiosystemsForsterCity,CA94404,U.S.A.;1989)。使用的试剂是生物化学品质的并且从Merck(D-Darmstadt)或Sigma(D-Deisenhofen)获得。利用来自Eppendorf/Biotronik的LC3000氨基酸分析仪进行氨基酸分析。使用来自Eppendor犯iotronik的稍微修改的标准分离程序。分离程序和分析仪的功能充分描述在所述仪器的手册中(HandbuchdesAminosSureanalysatorsLC3000[handbookoftheLC3000aminoacidanalyzer],WissenschaftlicheGerSteGmbHBiotronik，Maintal,1996)。使用的试剂是生物化学品质的并且从Merck(D-Darmstadt),Fluka(D-Neu-Ulm)或Sigma(D-Deisenhofen)获得。利用来自Micromass(Manchester,UK)的ZQ-1系统测定分子量。由此经由RP-18-HPLC色谱(HP1100system)分离片段并且通过电喷雾电离(ESI)测定分子量。进行外部校准。在仪器的手册中充分描述了所述系统的校准和机能。使用的酶和化学品是生物化学品质的并且从Fkika，Calbiochem(D-Heidelberg)和Sigma获得。制备色谱源15RPC的材料是从AmershamBioscience(D-Freiburg)获得。利用来自AmershamBioscience的AKTATM系统进行制备分离。本发明中提到的化合物还可以是盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物的形式。为了本发明目的优选的盐是所述化合物的生理可接受的盐，可以根据本发明制备或使用所述盐。然而，也包含其自身不适于制药应用但是可以使用的盐，例如，用于所述化合物的离析或纯化，其可以根据本发明制备或使用，或者混盐。可以根据本发明制备或者使用的化合物的生理可接受的盐包含无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。可以根据本发明制备和使用的化合物的生理可接受的盐也包括通常的碱的盐诸如，例如并优选，碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)和从氨或具有1至16个碳原子的有机胺衍生的铵盐，诸如，例如并优选，乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、普鲁卡因、二苄基胺、iV-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1，2-乙二胺和iV-甲基哌啶。用于本发明目的的MM^，指通过与溶剂分子的配位作用以固态或液态形成配合物的根据本发明生产或使用的化合物的那些形式。水合物是特定形式的溶剂合物，其中与水发生所述配位作用。实施例l0-亮氨酰-^-{(38，68,128，158，1811，218，248,278,2811)-6-[(18)-2-氨基-1-羟基-^氧代-乙基]-is-(H[M"(亚氨基)甲萄氨基》丙基)-u-[(is)-i-羟乙基]-3-(羟甲基)-24-[(lR)-l-羟基-2-甲基丙基]-21-异丁基-15-[(lS)-l-甲基-丙基]陽2，5，8，11,14，17，20,23，26-九氧代-28-苯基-1--4,7,10,13，16,19,22，25-八氮杂-环二十八烷-27-基}丄-亮氨酸酰胺双三氟乙酸盐(D-亮氨酰-L-亮氨酰-[(3R)-3-羟基-L-苯丙氨酰)H(3R)-3-羟基-L-亮氨酰]-L-亮氨酰-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-异苏氨酰-甘氨酰-[(3S)-3-羟基-L-天冬酰胺酰基]-L-丝氨酸-d'U-OW-内酯双三氟乙酸盐)(溶杆菌素)发酵培养基XM:酵母-麦芽琼脂D-葡萄糖(4g/1)，酵母提取物(4g/1),麦芽提取物(10g/l)，1升离子交换水(Lewatitwater)。在灭菌(在121°C，20分钟)之前，将pH调节到7.2。HPM:甘露糖醇(5.4g/1)，酵母提取物(5g/1)，肉蛋白胨(3g/1)。工作保藏物:将冷冻干燥的菌株(ATCC53042)生长在50ml的YM培养基中。烧瓶发酵:将11锥形烧瓶中的150ml的YM培养基或100ml的HPM培养基用2ml的工作保藏物接种，并且在28°C在240rpm的振荡器上进行生长30-48小时。301发酵:将300ml的烧瓶发酵(HPM培养基)用于接种无菌的301营养培养基溶液(lml消泡剂SAG5693/1)。将该培养物在28°C进行生长21小时，300rpm并且用0.3vvm的无菌空气通气。用1M盐酸将pH在pH=7.2保持恒定。总之，在培养期间加入880ml的1M盐酸。主培养〖200D:将15x150ml的11锥形烧瓶中的YM培养基用2ml的工作保藏物接种并在28°C和240rpm在振荡器上进行生长48小时。将2250ml的该培养物用于接种无菌的2001营养培养基溶液(YM)(1ml的消泡剂SAG5693/1)并且将其在28°C、150rpm并用0.3vvm的无菌空气通气而进行生长18.5小时。进行每小时取样(50ml)以检验发酵过程。将1ml甲醇(0.5%三氟乙酸)加入到2ml的该培养液并且将混合物通过0.45|im过滤器过滤。将30pi的该悬浮液用HPLC分析(方法6和方法7)。在18.5小时后，将主培养的培养液分离成上清液并在17000rpm沉积。离析利用浓縮的三氟乙酸或氢氧化钠溶液将^MM(183l)调节到pH6.5-7并且装料到Lewapol柱(OC106+601容量)。接着用纯水、水/甲醇1:1并且随后用纯甲醇(含有0.1%三氟乙酸)进行洗脱。将该有机相真空浓縮成11.51的残余水残渣。将残留的水相结合到硅胶d8并分离(MPLC,BiotageFlash75，75x30cm,KP-C18-WP，15-20pm,流动30ml;洗脱液含有0.1%三氟乙酸的乙腈/水；梯度10%，15%和40%乙腈)。将含有主要量的实施例1A的40%乙腈相真空浓缩并接着冷冻干燥(约13g)。首先在制备的HPLC(方法l)上，接着在SephadexLH-20(5x70cm,乙腈/是1:1，每一个情况中含有0.05%三氟乙酸)上通过凝胶过滤和进一步制备的HPLC(方法8)，将固体的混合物分离成1.2g的部分。该过程得到2250mg的实施例1。将沉积物吸收在41的丙酮/水4:l，加入2kg的C盐，利用三氟乙酸将所述混合物调节到pH=6，搅拌并离心。将所述溶剂真空浓縮并将残渣冷冻干燥。将获得的冻干物(89.9g)吸收在甲醇中，过滤，浓縮并在硅胶上分离(方法9)。然后用凝胶过滤(SephadexLH-20,5x68cm，水/乙腈9:1(含有0.05%三氟乙酸)，流动2.7ml/min,级分大小13.5ml)纯化实施例1A而得到纯的物质。该过程得到447mg的实施例1。HPLC(方法6):Rt=6.19minMS(ESIpos):m/z=1277[M+H]十丄H画R(500.13MHz,d6-DMSO):S=0.75(d,3H),0.78(d,6H)，0.80(t,3H),0.82(d，3H)，0.90(d,3H)，0.91(d，3H)，0.92(d，3H)，0.95(d,3H)，0.96(d3H),1.05(m,1H)，1.19(d，3H)，1.25(m，2H)，1.50(m，4H),1.51(m，2H)，1.55(m,1H),1.61(m，1H),1.65(m,1H)，1.84(m，1H)，1.85(m,1H)，1.86(m，1H)，1.89(m，1H),1.95(m,1H),2.75(m,2H),3.40(m，1H),3.52(m,2H),3.53(dd,1H)，3.64(m,2H)，3.66(m,1H)，3.68(dd，1H),3.73(m，2H),4.00(dd，1H),4.02(br"1H)，4.13(br.,1H),4.32(dd,1H),4.39(t,1H)，4.55(m,1H),4.75(dd,1H)，5.19(t，1H)，5.29(d，1H)，5.30(br.，1H),5.58(m，2H)，6.68(m,3H),6.89(d，1H),6.93(m，3H)，6.94(br.，1H),6.98(d，1H)，7.12(br"1H)，7.20(br"2H)，7.23(m，2H)，7.42(m,2H)，7.54(d,1H),7.58(d，1H)，8.32(br"1H),9.18(br"1H),9.20(m,2H),9.50(br"1H)。13C-NMR(125.77MHz,d6-DMSO):5=10.3，15.3,19.0，19.2,19.6，20.0,20.9,22.0,22,4，23.0,23.2,24.3，24.4，25.0,25.4,26.0,27.8，30.9，35.4，39.5，40.8,40.9,41.6,44.1，51.5，52.7，55.9,56.2，56.4,57.9,58.8,60.2,61.1，62.6,70.1，71.6,71.7,75.5，128.1，128.6,136.7,156.8，168.2,170.1,170.4,171.2，171.5,171.9,172.2,172.4，173.7。根据文献中描述的测定进行信号的测定(T.Kato，H.Hinoo,Y.Terui，J.Antibiot.，1988,61,719-725)。实施例2和实施例3D國Leu-Leu-Phe-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile扁aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser-三氟乙酸盐(二氢溶杆菌素)禾口D-Leu-Leu-Ala(3-环己基)-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser-三氟乙酸盐(八氢溶杆菌素)氢化方法1:将来自实施例1的化合物(溶杆菌素，250mg,170pmol)溶解在异丙醇/水(2:1，60ml)中并且在200mg的Pd(在碳上10%)存在下在1atm的氢气下氢化。反应过程之后是用LC-MS(方法1)。在实际上实现转化(>95%)以后，滤去所述催化剂，用异丙醇洗涤并且将滤出液冷冻干燥。在粗产物中，根据LC-MS，将所述产物分布如下二氢溶杆菌素约74%，八氢溶杆菌素约12%。将残渣通过HPLC纯化(方法2)。在适合级分的冷冻干燥后，获得纯化合物实施例2(81.5mg，理论的31%)。LC國MS:(方法1):Rt=1.56minES+:m/z=1279[M+H]+,640.1[M+2H]2+;ES-:m/z=1277[M-町，638.1[M-2H]2-。参见氢化溶杆菌素肽序列的表1。氢化方法2:通过在3atm的氢气压力的氢化，在其它等同于氢化方法l的方法中，用LC-MS获得粗产物中的下列分布二氢溶杆菌素约80%，八氢溶杆菌素约17%。在HPLC纯化(方法2)后，获得纯化合物实施例2(86mg,理论的33%)。氢化方法3:在3巴氢气下用延长的氢化时期或者利用更高的压力(直到80巴的氢气压力)，可以成比例地获得更多八氢溶杆菌素。在大多数情况中，不分离二氢-和八氢溶杆菌素的粗混合物，而将其直接用在酶促裂解中。氢化方法4:在下列情况下，同样以纯形式获得化合物八氢溶杆菌素将溶杆菌素(实施例1，1.04g,0.69mmol)溶解在异丙醇/水(2:l，90ml)中并且在200mg的Pd(碳上的10%)存在下在3atm氢气下氢化7天。滤去催化剂，用异丙醇洗涤并且将滤出液在旋转蒸发器上除去异丙醇并且然后冷冻干燥。在该粗产物中，产物按照LC-MS(方法l)分布如下二氢溶杆菌素约65%，八氢溶杆菌素约35%。将残渣用HPLC(方法2，接着是方法3)纯化。获得二氢溶杆菌素(实施例2)(280mg,理论的27%)和八氢溶杆菌素(实施例3)(212mg,理论的20%)。LC-MS:(方法1):Rt=1,63minESIpos.:m/z=643.3(100)[M+2H]2+;ESIneg.:m/z=1283[M-H]-，641.2[M-2H]2、氢化方法5:作为在高压氢气下氢化的实施例，在40。C和50巴氢气的4天后，根据LC-MS(方法l)获得下列粗混合物:45%二氢溶杆菌素和45%八氢溶杆菌素。氢化方法6:将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1，500mg，0.33mmol)溶解在异丙醇/水2:1(30ml)中。在氩气保护气氛下，加入10个百分比的碳载钯(100mg)。将所述反应混合物(在脱气后)在压力高压釜中在80-70巴氢气和RT下搅拌48h。将10。/。碳载钯(100mg)再次加入到所述反应。将反应混合物(脱气后)再次在压力高压釜中在80-70巴氢气和RT下搅拌48h。现在通过HPLC(例如方法4)不再检测到溶杆菌素。将反应混合物通过玻璃粉过滤(孔径2或3)，真空浓縮，再次吸收在甲醇/0.2%冰乙酸中，通过注射过滤器过滤(Biotage,PTFE)，真空浓縮并在高真空下干燥。获得496mg(定量的)的产物(80%二氢溶杆菌素，20%八氢溶杆菌素)。氢化方法7:将溶杆菌素单三氟乙酸盐单乙酸盐(5mg,3.45nmol)在异丙醇(2ml)，水(0.25ml)和乙酸(0.05ml)的混合物中在二氧化铂(20mg)存在下在80钯和50。C氢化。17h后，释放压力，将系统用氩气通风并且通过微滤器使悬浮液清除出催化剂。滤出液的LC-MS分析(方法4)显示理论的7%的八氢溶杆菌素(Rt=1.54min，方法4)。氢化方法8:将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1A,10g，6.65mmol)溶解在异丙醇/水9:2(110ml)中。在氩气保护气氛下，加入碳载钯(10%;5g)。将反应混合物(脱气后)在压力高压釜中在80-70巴氢气压力和40°C搅拌12h。将碳载钯(10%;5g)再次加入到所述反应。将反应混合物(脱气后)再次在压力高压釜中在80-70巴氢气压力和40°C搅拌12h。将反应混合物(脱气后)再一次在80-70巴氢气压力和40。C搅拌12h。现在通过分析的HPLC(方法10)不再检测到溶杆菌素。将反应混合物通过硅藻土过滤，真空浓縮并在高真空下干燥。获得9.17§(理论的99%)的产物(60%二氢溶杆菌素，40%八氢溶杆菌素)。氢化方法9:将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1A,5g，3.32mmol)溶解在异丙醇/水9:2(110ml)中。在氩气保护气氛下，加入碳载钯(10%;5g)。将反应混合物(脱气后)在压力高压釜中在80巴氢气压力和40°C搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土过滤，真空浓缩并在高真空下干燥。将氢化再重复三次，每次使用5.0g的溶杆菌素双三氟乙酸盐(总共4轮)。作为合并的级分，获得18.27g的产物(二氢溶杆菌素:八氢溶杆菌素，约5:4)。实施例4二氢溶杆菌素的胰凝乳蛋白酶裂解，酶/底物比是1:50将200pig的二氢溶杆菌素溶解在10^甲醇中并然后加入190Ml的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入4pg胰凝乳蛋白酶(l:50)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5，1，3，6和24h后取30pl的等分部分并用30pl的乙腈/l。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到用HPLC，毛细管区带电泳，序列分析，氨基酸分析，或MS研究进行分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例5八氢溶杆菌素的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1:50将200吗八氢溶杆菌素溶解在10^tl甲醇中并然后加入190pl裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入4pig胰凝乳蛋白酶(l:50)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5,1,3,6和24h后取30(il的等分部分并用30^的乙腈/l。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例6二氢-/八氢-溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1:25将200吗二氢-(59%)和八氢溶杆菌素(34%)溶解在10pl甲醇中并且然后加入190^的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入8吗胰凝乳蛋白酶(l:25)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5,1，3h后取30pl的等分部分并用30^il的乙腈/l。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例7二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1:400将150吗二氢-(59%)和八氢溶杆菌素(34%)溶解在15pl乙醇中并且然后加入126^的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入0.38Hg胰凝乳蛋白酶(9pl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇/裂解缓冲液，0.2mg/ml;l:400)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5,1,3h后取25pl的等分部分并用25^的30。/。乙腈/0.1。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例8二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解底物浓度6mg/ml将900pg二氢-(59%)和八氢溶杆菌素(34%)溶解在15pl甲醇中并且然后加入99^的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入36pg胰凝乳蛋白酶(36nl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇l:l,lmg/ml;l:25)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5，1，3h后取25pl的等分部分并用25pl的30。/。乙腈/0.1。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例9二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解溶剂浓度30%甲醇将150)ig二氢-(59%)和八氢溶杆菌素(34%)溶解在45pl甲醇中并且然后加入99pl的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入6吗胰凝乳蛋白酶(6^胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1:1,1mg/ml;l:25)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5，1,3h后取25pl的等分部分并用25pl的30。/。乙腈/0.1。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例10二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解在室温裂解将200吗二氢-(59%)和八氢溶杆菌素(34%)溶解在10甲醇中并且然后加入190pl的裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入8吗胰凝乳蛋白酶(8pl胰凝乳'蛋白酶溶液水/乙二醇1:1,1mg/ml;l:25)并且在室温(20-25。C)进行所述反应。在0，0.5，1，3,6h后取30pl的等分部分并用30)il的30。/。乙腈/0.1。/。TFA终止酶裂解。将样品储存在-20。C直到分析。关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。实施例11片段4"11-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser三氟乙酸盐o二氢溶杆菌素的制备的裂解底物浓度1mg/ml将2x80mg二氢溶杆菌素(通过氨基酸分析测定的35.3pmol和33.8limol纯肽)各自溶解在8ml甲醇并且然后各自加入69ml裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37。C。加入3.2mg胰凝乳蛋白酶(3.2ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1:1,lmg/ml;1:25;预热至37。C)并且在37°C进行所述反应。在0.5，lh后取200jil的等分部分并用200pl的30%乙腈/0.1%TFA终止所述酶裂解。将所述样品在15min内用HPLC平行于酶裂解而分析(保留时间片段4-11约3.6min,片段1-3(LLF)约9.6min,条件溶剂A0.1。/oTFA,溶剂B60。/0乙腈/0.1%TFA,梯度0min30%B,10min80%B,11min100%B,12min30%B，15min30%B;流动0.7ml/min，40°C,UV检测210nm)。在大约70min后用3ml乙腈和约0.6ml的TFA终止酶反应。溶液的pH在1和2之间。将溶液储存在-20。C直到制备的分离。片段1-3和4-11的制备分离将2x约80ml的裂解溶液通过过滤器(0.2pm)过滤并然后合并。将所述溶液分成4部分，每一部分约38.5ml(总共154ml)并且将每一个在Source15RPC柱(3ml)上利用乙腈/TFA梯度进行层析。条件溶剂AO.1%TFA，溶剂B0.1。/。TFA/乙腈；梯度40min中的0%B至45%B;流动2ml/min;UV检测210nm。顺序进行四个运行，并且将级分收集在相同的管中。得到的层析谱是相同的。将片段4-11(Rt=约15min)禾卩1—3(LLF)(Rt=约25min)合并，用水l:l稀释并然后冷冻干燥。将200^等分部分的各自池单独冷冻干燥用于氨基酸分析、分析的HPLC、毛细管区带电泳(CZE)、序列分析和质谱法。根据氨基酸分析的片段4-11的收率是68.3pmol(理论的99%)以及片段1—3的收率是67.4pmol(理论的98%)。实施例12二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解1mg/ml批次l将2x700mg二氢-(56%)和八氢溶杆菌素(21%)(682pmol二氢-和八氢溶杆菌素，通过氨基酸分析测定作为纯肽提供)各自溶解在70ml甲醇中并且然后各自加入602ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37。C。加入28mg胰凝乳蛋白酶(28ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1:1，1mg/ml;1:25;37°C预热的)并且在37。C进行反应。在0.5,1h后取200pl的等分部分并且用200pl的30%乙腈/0.1%TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min，片段l-3(LLF)约9.6min,片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min，条件溶齐UA0.1%TFA,溶剂B60%乙腈/0.1%TFA,梯度0min30%B，10min80%B,11min100%B，12min30%B,15min30%B;流动0.7ml/min,40。C,UV检测210nm)。在约60min后用30ml乙腈和约6ml的TFA终止酶反应。溶液的pH在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20。C直到制备的分离。批次2将750mg二氢-(45%)和八氢溶杆菌素(48%)(468|imol二氢-和八氢溶杆菌素，通过氨基酸分析测定作为纯肽提供)溶解在77.5ml甲醇中并且然后加入667ml裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37。C。加入31mg胰凝乳蛋白酶(31ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1:1,lmg/ml;1:25;37°C预热的)并且在37°C进行反应。在0.5,1h后取200pl的等分部分并且用200pl的30%乙腈/0.1%TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min,片段1-3(LLF)约9.6min,片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A0.1%TFA,溶剂B60%乙腈/0.1%TFA,梯度0min30%B,10min80%B,11min100%B,12min30%B,15min30%B;流动0.7ml/min,温度40。C,UV检测210nm)。在60min后用30ml乙腈和约6ml的TFA终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20。C直到制备的分离。片段1-3和4-11的制备分离将裂解批次1和2通过过滤器(0.2pm)过滤并且然后合并。将所述溶液分成数份，并且将每一个在Source15RPC柱上利用如上所述的乙腈/TFA梯度层析。顺序地进行所述运行并且将级分收集在相同的管中。得到的层析谱是相同的。将片段4-11(Rt.约15min)合并，用水1:1稀释并然后冷冻干燥。冷冻干燥后片段4-11的收率是1.1g(1095pmol)。对于起始量的1150pmol可裂解物料，片段4-11的收率是理论的95%。实施例13二氢〃V氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解底物浓度3mg/ml将2x0.995g二氢-(52%)和八氢溶杆菌素(37%)各自溶解在33ml甲醇中并且然后各自加入257ml裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37。C。加入39.6mg胰凝乳蛋白酶(39.6ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1:1，1mg/ml;1:25;37°C预热的)并且在37°C进行反应。在0.5，1h后取200pl的等分部分并且用200^的30%乙腈/0.1%TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min,片段1-3(LLF)约9.6min，片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A0.1。/。TFA,溶剂B60%乙腈/0.1%TFA,梯度0min30%B，10min80%B,11min100%B，12min30%B,15min30%B;流动0.7ml/min,温度40°C,UV检测210nm)。在约60min后用30ml乙腈和约2.5ml的TFA各自终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20。C直到制备的分离。实施例14二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解底物浓度5mg/ml将10g二氢-(约40%)和八氢溶杆菌素(约60%)溶解在200ml甲醇并且然后加入1700ml裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。在酶的加入之前，将溶液在干燥箱中温热至37°C。加入400mg胰凝乳蛋白酶(IOOml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇l:l,4mg/ml;1:25;37°C预热的)并且将所述反应在37。C进行。在0.5，1h后取200^的等分部分并且用200^的30%乙腈/0.1%TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min,片段l-3(LLF)约9.6min，片段1—3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A0.1%TFA,溶剂B60%乙腈/0.1%TFA，梯度0min30%B,10min80%B，11min100%B，12min30%B,15min30%B;流动0.7ml/min,温度40°C,UV检测210腿)。在约60min后用75ml乙腈和约15ml的TFA终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20。C直到制备的分离。如上所述通过制备的HPLC在数个运行中离析片段4-11。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)—Asp(121)/Tyr(124)—Asp(124)(BAYERHealthcareAG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的胰凝乳蛋白酶批次的活性(70U/mg)。实施例15二氢溶杆菌素的枯草杆菌蛋白酶裂解将200pg二氢溶杆菌素溶解在10pl甲醇中并且然后加入190^tl裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入4吗枯草杆菌蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5,1，3,6禾Q24h后取30|il等分部分并用30^乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20°C直到分析。对于枯草杆菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表3。实施例16八氢溶杆菌素的枯草杆菌蛋白酶裂解将200pg八氢溶杆菌素溶解在10^甲醇中并且然后加入190pl裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入4吗枯草杆菌蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5,1，3,6禾Q24h后取30pl等分部分并用30pl乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于枯草杆菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表3。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)->Asp(121)/Tyr(124)—Asp(124)(BAYERHealthcareAG,D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的枯草杆菌蛋白酶批次的活性(约12U/mg)。实施例17二氢溶杆菌素的嗜热菌蛋白酶裂解将200二氢溶杆菌素溶解在10^甲醇中并且然后加入190^裂解缓冲液(0.1M三(羟甲基)氨基甲烷/5mM氯化钙PH7.45)。加入4pg嗜热菌蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5，1,3,6和24h后取30W等分部分并用30^乙腈/l。/。TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于嗜热菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表4。实施例18八氢溶杆菌素的嗜热菌蛋白酶裂解将200吗八氢溶杆菌素溶解在10^il甲醇中并且然后加入190pi裂解缓冲液(O.lM碳酸氢铵/0.5M脲pH8)。加入4)ig嗜热菌蛋白酶(l:50)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5,1,3，6和24h后取30)il等分部分并用30pl乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于嗜热菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表4。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)->Asp(121)/Tyr(124)4Asp(124)(BAYERHealthcareAG,D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的嗜热菌蛋白酶批次的活性(约55U/mg)。实施例19二氢溶杆菌素的木瓜蛋白酶裂解将200pg二氢溶杆菌素溶解在10|Lil甲醇中并且然后加入190^裂解缓冲液(O.lM磷酸钠/10mM半胱氨酸，2mMEDTApH6.5)。加入4(ig木瓜蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5，1,3,6和24h后取30^等分部分并用30乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20°C直到分析。对于木瓜蛋白酶裂解产物的肽序列参见表5。实施例20八氢溶杆菌素的木瓜蛋白酶裂解将200(ig八氢溶杆菌素溶解在10pl甲醇中并且然后加入190^裂解缓冲液(O.lM磷酸钠/10mM半胱氨酸，2mMEDTApH6.5)。加入4吗木瓜蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0，0.5,1，3，6禾n24h后取30^等分部分并用30pl乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于木瓜蛋白酶裂解产物的肽序列参见表5。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)—Asp(121)/Tyr(124)—Asp(124)(BAYERHealthcareAG,D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的木瓜蛋白酶批次的活性C约11U/mg)。实施例21二氢溶杆菌素的蛋白酶K裂解将200>ig二氢溶杆菌素溶解在10^甲醇中并且然后加入190Ml裂解缓冲液(O.lM四硼酸钠pH9)。加入4|ig蛋白酶K(l:50)并且在37。C进行所述反应。在0,0.5,1，3，6和24h后取30pi等分部分并用30pi乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于蛋白酶K裂解产物的肽序列参见表6。实施例22八氢溶杆菌素的蛋白酶K裂解将200八氢溶杆菌素溶解在10^甲醇中并且然后加入190pl裂解缓冲液(O.lM四硼酸钠pH9)。加入4吗蛋白酶K(l:50)并且在37。C进行所述反应。在0，0.5,1，3，6和24h后取30jil等分部分并用30^乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于蛋白酶K裂解产物的肽序列参见表6。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)—Asp(121)/Tyr(124)—Asp(124)(BAYERHealthcareAG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的蛋白酶K批次的活性(约30U/mg)。实施例23二氢溶杆菌素的菠萝蛋白酶裂解将200二氢溶杆菌素溶解在10pi甲醇中并且然后加入190^裂解缓冲液(O.lM磷酸钠，10mM半胱氨酸，2mMEDTApH6.5)。加入4fig菠萝蛋白酶(1:50)并且在37。C进行所述反应。在0，0.5，1,3,6和24h后取30pi等分部分并用30pi乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于菠萝蛋白酶裂解产物的肽序列参见表7。实施例24八氢溶杆菌素的菠萝蛋白酶裂解将200pg八氢溶杆菌素溶解在10pl甲醇中并且然后加入190pl裂解缓冲液(O.lM磷酸钠，10mM半胱氨酸,2mMEDTApH6.5)。加入4jag菠萝蛋白酶(1:50)并且在37°C进行所述反应。在0,0.5,1,3，6禾卩24h后取30^等分部分并用30pl乙腈/1%TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20。C直到分析。对于菠萝蛋白酶裂解产物的肽序列参见表7。利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)—Asp(121)/Tyr(124)—Asp(124)(BAYERHealthcareAG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的菠萝蛋白酶批次的活性(约4U/mg)。实施例25用胰凝乳蛋白酶酶促合成二氢溶杆菌素将800)ig肽Leu-Leu-PheOMe和100吗肽4-11溶解在200|il甲醇并然后加入200(il合成缓冲液(0.1M四硼酸钠pH9)。加入24昭胰凝乳蛋白酶并且在37°C进行所述反应。在0,0.5，1,3，6和24h后取30|il等分部分并用30)il乙腈/1%TFA终止所述合成。将样品保存在-20。C直到分析。利用HPLC和CZE检测二氢溶杆菌素。实施例26用胰凝乳蛋白酶酶促合成二氢溶杆菌素衍生物将800吗的肽Boc-Leu-Leu-PheOMe溶解在200jal四氯化碳并然后加入200含有100吗肽4-11的合成缓冲液(O.lM四硼酸钠pH9)。加入24吗胰凝乳蛋白酶并在37°C进行所述反应。在0,0.5,1，3，6和24h后取30jul等分部分并用30Ml乙腈/1%TFA终止合成。将所述样品保存在-20。C直到分析。用HPLC和CZE检测二氢溶杆菌素衍生物。实施例27用胰凝乳蛋白酶酶促合成八氢溶杆菌素将800吗肽Leu-Leu-Ala(3-环己基)OMe和100吗肽4-11溶解在200|il甲醇并然后加入200^合成缓冲液(O.lM四硼酸钠pH9)。加入24pg胰凝乳蛋白酶并在37°C进行所述反应。在0，0.5,1,3，6禾n24h后取30pi等分部分并用30^乙腈/1%TFA终止合成。将样品保存在-20。C直到合成。用HPLC和CZE检测八氢溶杆菌素衍生物。实施例28TV-末端序列分析将3nmol溶解在60%乙腈/0.1%TFA中的片段加载到用Polybrer^预培养的序列分析仪片上。利用通常的序列分析仪循环测定所述蛋白质序列。经由在线HPLC利用40pmolPTH标准识别PTH-氨基酸。通过它们对于标准氨基酸的相对位置识别非蛋白原的氨基酸。从第一PTH循环的氨基酸估计所述肽的纯度。将不同的肽序列测定4至12阶段。表1至7显示了测定的蛋白质序列。表l:底物的肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3:二氢-和八氢溶杆菌素(l^)的枯草杆菌蛋白酶的不同的肽和肽片段的序列分析。裂解产物4-10仅在24小时后形成到更大程度。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。表4:二氢-和八氢溶杆菌素(l-3)的嗜热菌蛋白酶裂解的不同肽和肽片段的序列分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表7:开链溶杆菌素(l，4)，二氢-(2，4)和八氢溶杆菌素(3，4)的菠萝蛋白酶裂解的不同肽和肽片段的序列分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。实施例29氮基酸分析氨基酸分析是表征蛋白质的重要定性和定量参数。除了蛋白质含量，在己知一级结构的情况下，测定单独的氨基酸的数目。溶杆菌素衍生物和肽片段的氨基酸分析与来自一级结构(表8)的理论值符合好。仅在相应标准存在下定量非蛋白原的氨基酸。将100pg溶杆菌素衍生物和肽片段溶解在200(il的6N盐酸中并在166。C水解lh。将约5nmol样品引入氨基酸分析仪中。经由4nmol氨基酸标准测定氨基酸的量。表8:二氢-，八氢溶杆菌素，二氢-+八氢溶杆菌素，片段4-11和1-3的氨基酸分析。整数是基于Ile-l或Leu二2。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例30反相色谱在化学结合的反相上的蛋白质的HPLC色谱中，经由蛋白质的疏水相互作用形成所使用的对所述相的结合。根据它们结合到固定相的力，将所述肽用有机溶剂(流动相)取代所述肽。为此原因，该方法是评价肽纯度并监控酶促裂解速率和得到的裂解产物的良好标准。所述肽二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素从RP-18相在约35min和约38min洗脱，片段4-11在约16min，1-3(LLF)在约31min和1-3(LLA(3-环己基))在约37min。图1显示用胰凝乳蛋白酶的制备的酶促裂解的时间进程(实施例11)。将约20pg酶促裂解产物和起始化合物二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素或混合物在Zorbax300SB-C18柱(4.6mmx150mm;3.5材料；300angstr6m孔径)上色谱。使用的洗脱液是乙腈/TFA梯度。条件溶剂A0.1%TFA,溶剂B60。/。乙腈/0.1。/。TFA;流动0.7ml/min,柱温度40°C，UV检测210画，溶剂A0.1。/。TFA,溶剂B0.1。/。TFA/60。/。乙腈；梯度0min0。/。B，2min10%B，50min80%B，52min100%B，55min0%B,60min0%B。实施例31毛细管区带电泳(CZE)毛细管电泳可以在它们的电场改变的基础上分离肽和蛋白质。分离的品质取决于使用的缓冲液、pH、温度和添加剂。使用的毛细管被称为内径为50-100nm的熔融石英柱。该方法对于评价肽的纯度以及对于监控酶促裂解产物的形成是非常好的判据。肽二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素在约21min从毛细管柱洗脱，片段4-11在约18min，1-3(LLF)在约24min，1-3(LLA(3-环己基))在约22min，作为双峰的脱去酰氨基的形式在约30min(1-11)和24min(4-ll)。图2显示用胰凝乳蛋白酶的酶促裂解的时间进程(实施例5)。缓冲液中在24h后脱去酰氨基的产物的巨大增加可以清楚地看到。将约4ng酶促裂解产物或起始化合物二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素、或混合物经由毛细管电泳在玻璃柱(长度72cm,内径50pm)上研究。条件电流90fiA,柱温25。C，100mM磷酸盐缓冲液pH3.0,UV检测210nm,压力下装料3秒。实施例32通过HPLC-ESI-MS测定的分子量通过RP-18-HPLC色谱分离肽和酶促裂解产物并且通过电喷雾电离(ESI)测定分子量。将约100pg二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素的混合物的胰凝乳蛋白酶裂解用ZorbaxC18-HPLC柱在下列条件下分离溶剂A0.1%TFA,溶剂B60%乙腈/0.1。/。TFA;流动0.7ml/min，柱温40。C,UV检测210nm,溶剂A0.1%TFA，溶剂B0.1%TFA/60%乙腈;梯度0min0%B，2min10%B，50min80%B,52min100%B，55min0%B，60min0%B。将所述肽转移到质谱仪的大气压离子源并且在那里电离。从那里，将所述离子转移到质谱仪的高真空区域并检测。表9显示测定的分子量。表9:二氢溶杆菌素，八氢溶杆菌素和酶促裂解产物的分子量以道尔顿形式与理论分子量(MW)比较。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例33二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解将18.27g二氢-和八氢溶杆菌素(约5:4)溶解在365ml甲醇中并用胰凝乳蛋白酶(731mg)和裂解缓冲液稀释到3654ml。将所述反应在37°C进行30min并且然后用20ml的TFA和150ml乙腈终止。在加入酶之前，将溶液在干燥箱中温热至37。C。在0和0.5h后取200^的等分部分并用200^1的30%乙腈/70。/。水中的0.1。/。TFA终止所述酶裂解。用HPLC(保留时间片段4-11约3.6min.,片段1-3(LLF)约9.6min.,片段1-3(LL(六氢)F)约11,3min.)(洗脱液A:水中0.1%TFA,洗脱液B:60%乙腈/40%水中0.1%TFA,梯度0min30%B,10min80%B，11min100%B,12min30%B,15min30%B;流动0.7ml/min，柱温40°C，检测:210nm)分析所述样品。备选地，使用方法ll。将溶液分成9x500ml部分并在-70。C冷冻直到制备的RP分离。将片段4-11用制备的HPLC在数个运行中离析。片段1-3和4-11的制备分离将约800ml裂解溶液通过滤筒(0.2nm)过滤并以两部分约400ml在Source15RPC柱(columnsize:2360ml)上利用甲醇/TFA梯度色谱。洗脱液A:水中0.1%TFA,洗脱液B:100%甲醇中0.1%TFA;流动30ml/min.;检测215nm。根据柱体积运行所述梯度在应用后，将所述柱用3.6柱体积的洗脱液A洗涤，然后以18柱体积到45%B,以0.67柱体积到100%B，1.3柱体积100%B,以0.67到0%B,7柱体积的洗脱液A用于平衡。获得了作为产物的10.36g(理论的77。/o)的片段4-11。HPLC/UV-Vis(方法4):Rt=0.5min。LC-MS(方法1):Rt=1.0min;MS(ESIpos.):(%)=453.6(100)[M+2H]2+,906(10)[M+H]+.MS(ESIneg.):w/z(%)=904(100)[M—H]—.权利要求1.制备二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的方法，其特征在于通过用氢在氢化催化剂存在下在溶剂中将溶杆菌素通过氢解开环转化成二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素。2.根据权利要求1的方法，其中将钯催化剂用作氢化催化剂。3.根据权利要求1或2的方法，其中将异丙醇-水混合物用作溶剂。4.制备溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶促裂解而产生溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段l-3。5.根据权利要求4的方法，其中将真核的丝氨酸蛋白酶或微生物的丝氨酸蛋白酶用作酶。6.根据权利要求4或5的方法，其中将胰凝乳蛋白酶用作丝氨酸蛋白酶。7.制备溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶促裂解而产生溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9。8.根据权利要求7的方法，其中将金属蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶用作酶。9.溶杆菌素片段4-ll用于合成溶杆菌素衍生物的用途。10.制备开链溶杆菌素衍生物的方法，其特征在于将溶杆菌素片段4_11与具有C—末端芳族或疏水性氨基酸的三肽在加入CM醇的缓冲液介质中反应，其中所述三肽以游离酸或酯的形式存在并且其中Cm醇在所述反应介质中的浓度大于40%。11.根据权利要求10的方法，其特征在于将甲醇用作Cm醇。全文摘要本发明涉及通过组合化学的和酶促的修饰而靶向生产溶杆菌素衍生物的方法。特别是，本发明涉及通过化学还原和通过胰凝乳蛋白酶裂解所得到的产物而制备溶杆菌素片段4-11的方法。文档编号C07K7/06GK101098884SQ200580044804公开日2008年1月2日申请日期2005年10月22日优先权日2004年11月5日发明者尚塔尔·菲尔斯特纳,弗朗茨·冯努斯鲍姆,维尔纳·施罗德申请人:艾库里斯有限及两合公司