用于制备溶杆菌素衍生物的方法

专利名称：用于制备溶杆菌素衍生物的方法
用于制备溶杆菌素衍生物的方法 本发明涉及制备下式(I)的环状酯肽的方法，
<formula>formula see original document page 12</formula>
其中R'是H或CH3，
其中W是氢，C3-C6-环垸基,Cs-C6-环烯基，C3-C6环烷基甲基，5-到7-元杂环
基甲基，甲基，乙基，正丙基异丙基l-甲基丙-l-基，2-甲基丙-l-基，2，2-二甲基丙-l-基，l,l-二甲基丙-l-基，l-乙基丙-l-基,l-乙基-l-甲基丙-l-基, 正丁基，2-甲基丁-l-基3-甲基丁-l-基l-乙基丁-l-基，叔丁基,4-甲基戊-1-
基，正已基，烯基或芳基，
其中R2可以被0，1,2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由 下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，三甲代甲硅垸基，垸基，烷氧基, 苄氧基，C3-C6-环烷基，芳基，5-到10-元杂芳基，垸基氨基，芳基氨基，垸 基羰基氨基，芳基羰基氨基，垸基羰基，垸氧基羰基，芳基羰基和苄氧基 羰基氨基，其中芳基和杂芳基又可以被O、 1、 2或3个取代基取代，所述取代基彼此 独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，硝基，垸基，垸氧 基和苯基，
其中W是氢或C,-Cr烷基，
或
其中R2和R3与它们键合的碳原子一起形成C3-C6-环烷基环或5到7-元杂 环基环，其中所述环垸基环和杂环基环可以被O、 1、 2或3个取代基取代， 所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组三氟甲基，烷基，烷氧基和 烷基羰基,
其中R"是烷基,C3-C6-环烷基,5-到7-元杂环基，芳基,5-或6-元杂芳基，烷 基羰基，垸氧基羰基，C3-C6-环垸基羰基，5-到7-元杂环基羰基，芳基羰基， 5-或6-元杂芳基羰基或烷基氨基羰基，
其中垸基，环烷基，杂环基，芳基，杂芳基，垸氧基羰基，环垸基羰基，杂 环基羰基，芳基羰基，杂芳基羰基和烷基氨基羰基可以被0、 1、 2或3个 取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨 基,烷基氨基禾口苯基, 且
其中烷基羰基被氨基或烷基氨基取代基所取代， 且
其中烷基羰基可以被另外的0, 1或2个取代基所取代，所述取代基彼此独 立地选自由下列组成的组卤素，羟基，三甲代甲硅垸基，垸氧基，垸硫基， 苄氧基，CVCV环烷基，苯基，萘基，5-到10-元杂芳基，垸基羰基氨基，烷 氧基羰基氨基，芳基羰基氨基，芳基羰基氧基，苄氧基羰基和苄氧基羰基 氨基，
其中苯基和杂芳基又可以被O、 1、 2或3个取代基取代，所述取代基彼此 独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，硝基，垸基，烷氧基和苯基，
或在烷基羰基中的相同碳原子上的两个取代基与它们键合的碳原子一起
形成C3-C6-环垸基环(cycloalkyl ring)或5-到7-元杂环基环(heterocyclyl ring)，
其中，所述环垸基环和杂环基环可以被O、 1、 2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组三氟甲基，烷基和垸氧基， 或
其中所述环烷基环可以是苯并-稠合的(benzo-ftised)， 其中RS是氢,C,-Cr垸基，环丙基或环丙基甲基， 或
其中W和R5与它们所键合的氮原子一起形成5-元至7-元杂环基环，其中 所述杂环基环可以被O, 1,2，或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地 选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，垸基，烷氧基和垸基氨基， 以及在该方法中有用的化合物。
上述环状酯肽特别包括下面描述的两种天然产物，其被称为溶杆菌素 和片野菌素A。这些物质是细胞壁生物合成的抑制剂并且因此具有抗菌活 性。
溶杆菌氣R-CH3
片野菌素A,R = H 细菌细胞壁是通过许多酶合成的(细胞壁生物合成)并且对微生物的生 存和繁殖是必要的。该大分子的结构，还有涉及它的合成的蛋白质和生物 合成中间体("前体")在细菌内是高度保守的。由于它的关键本性和一致性，细胞壁生物合成是新型抗生素理想的攻击点。
万古霉素和青霉素是细菌细胞壁生物合成的抑制剂并且代表该作用原 理的抗生素功效的成功实例。它们已经在临床上使用了数十年，用于治疗 细菌感染，特别是革兰氏阳性病原体的细菌感染。由于耐抗生素微生物的
不断出现，例如耐甲氧西林的葡萄球菌(staphylococci)、耐青霉素的肺炎双 球菌(pneumococci)和耐万古霉素的肠球菌(enterococci)以及最近也首次出 现的耐万古霉素的葡萄球菌，这些物质正日益丧失它们的治疗功效。
到目前为止，溶杆菌素通过使用例如溶杆菌属物种SC 14067进行发 酵获得。进一歩在WO 2004/099239 Al中了解到去除形成线性片段的两个 亮氨酸单位并将它们用其它的基团取代。通过完全合成制备溶杆菌素、片 野菌素A或其在线性片段中具有变化的衍生物的方式到目前为止尚不知 道。
因此，本发明的一个目的是描述用于制备上述式(I)的环状酯肽的方法。
该目的是通过包括下列步骤的制备式(I)的环状酯肽的方法来实现
进行下式(n)的化合物的分子内环化，
<formula>formula see original document page 15</formula>其中R、R5如上定义，
其中X是OH,活性酯，拟卤素(例如叠氮化物(azide))或卤素，且 其中PG是H或适合的保护基，
和随后对环状中间体进行去保护以形成式(I)的环状酯肽。
所述方法的特征在于在O3上被酯化的(3-羟基oc-氨基酸(在本文中l3-苯 基丝氨酸=P-羟基苯丙氨酸)在环化步骤中被化学活化，接着充当酰基供 体。所述环化作用通过酰胺键合(内酰胺形成)而不是通过酯化反应(内酯形 成)而发生。
所述方法的特征进一步在于酯肽套索(lasso)结构的环状片段是通过在 桥头氨基酸(在本文为P-羟基苯丙氨酸)的环化而制备。
为了本发明的目的，除非另外指出，取代基具有下述含义 烷基本身和烷氧基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧羰基、烷基氨基羰基 和烷基羰基氨基中的"烷基(alk)"和"烷基(alkvl)"表示直链或支链烷基原子 团，其通常具有1至6个，优选地1至4个，特别优选地1至3个碳原子，作为 实例并且优选地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正戊基和正已 基。
烷氧基，作为实例并且优选地，表示甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异 丙氧基、叔丁氧基、正戊氧基和正已氧基。
烯基表示具有2-6个碳原子的直链或支链烯基原子团。优选具有2-4 个碳原子，特别优选具有2-3个碳原子的直链或支链烯基原子团。可以优 选地提及的实例是乙烯基，烯丙基，正丙-l-烯-l-基，正丁-2-烯-l-基，2-甲 基丙小烯小基和2-甲基丙-2-烯-l-基。
^fi^表示具有一个或两个烷基取代基(彼此独立地选择)的烷基氨 基原子团，作为实例并且优选地，表示甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、 异丙基氨基、叔丁基氨基、正戊基氨基、正己基氨基、iV，A^-二甲基氨基、 AUV-二乙基氨基、iV-乙基-AT-甲基氨基、AT-甲基-AL正丙基氨基、AT-异丙基 -W-正丙基氨基、A^-叔-丁基-7V-甲基氨基、iV-乙基-7V-正戊基氨基和W-正已基 -,甲基氨基。
^fi^表示具有一个芳基取代基和任选地另外的取代基如例如芳 基或垸基的芳基氨基原子团，作为实例并且优选地表示苯基氨基，萘基氨基，苯基甲基氨基或二苯基氨基。
烷基羰基,表示具有一个烷基取代基的烷基羰基原子团，作为实例并且 优选地表示甲基羰基，乙基羰基，正丙基羰基，异丙基羰基，叔丁基羰基， 正戊基羰基和正已基羰基。
烷氧基羰基,表示具有一个垸氧基取代基的烷氧基羰基原子团，作为实 例并且优选地是甲氧基羰基，乙氧基羰基，正丙氧基羰基，异丙氧基羰基， 叔丁氧羰基，正戊氧基羰基和正己氧基羰基。
环烷基羰基表示具有一个环烷基取代基的环烷基羰基原子团，作为实 例并且优选地表示环丙基羰基，环丁基羰基，环戊基羰基和环已基羰基。
杂环基羰基表示具有一个杂环基取代基的杂环基羰基原子团，作为实
例并且优选地表示四氢呋喃-2-基羰基，吡咯垸-2-基羰基吡咯烷-3-基羰 基，吡咯啉基羰基，哌啶基羰基，吗啉基羰基和全氢化氮杂萆基羰基。
^K表示具有一个芳基取代基的芳基羰基原子团，作为实例并且 优选地表示苯基羰基，萘基羰基和菲基羰基。
^MS^表示具有一个杂芳基取代基的杂芳基羰基原子团，作为实 例并且优选地表示噻吩基羰基，呋喃基羰基，吡咯基羰基，噻唑基羰基, 噁唑基羰基，咪唑基羰基，吡啶基羰基，嘧啶基羰基，哒嗪基羰基，吲哚基 羰基，吲唑基羰基，苯并呋喃基羰基，苯并噻吩基羰基，喹啉基羰基和异 喹啉基羰基。
烷基羰基氨基表示具有一个烷基取代基的烷基羰基氨基原子团，作为 实例并且优选地表示甲基羰基氨基，乙基羰基氨基，正丙基羰基氨基，异 丙基羰基氨基，叔丁基羰基氨基，正戊基羰基氨基和正已基羰基氨基。
芳基羰基氨基表示具有一个芳基取代基的芳基羰基氨基原子团，作为 实例并且优选地表示苯基羰基氨基，萘基羰基氨基和菲基羰基氨基。
垸基氨基羰基表示具有一个或两个烷基取代基(彼此独立地选择)的烷 基氨基羰基原子团，作为实例并且优选地表示甲基氨基羰基，乙基氨基羰 基，正丙基氨基羰基，异丙基氨基羰基，叔丁基氨基羰基，正戊基氨基羰 基，正已基氨基羰基，iV，M二甲基氨基羰基，WiV-二乙基氨基羰基，iV-乙基 -W-甲基氨基羰基，A^甲基-A^-正丙基氨基羰基，A^异丙基-7V-正丙基氨基羰 基，W-叔丁基-iV-甲基氨基羰基，iV-乙基-7V-正戊基氨基羰基和W-正已基-iV-甲基氨基羰基。
环烷基表示通常具有3-6个碳原子的环烷基基团，作为实例并且优选 地表示环丙基，环丁基，环戊基和环已基。
3MM表示通常具有5-6个碳原子和一个或两个双键的环烯基，作为 实例并且优选地表示环戊-l-烯-l-基，环戊-2-烯-l-基，环戊-3-烯-l-基，环 已-l-烯-l-基，环已-2-烯-l-基和环已-3-烯-l-基。
皿表示通常具有6-14个碳原子的单-到三-环芳香族碳环原子团，作 为实例并且优选地表示苯基，萘基和菲基。
杂环基表示通常具有5-7个环原子和来自系列N, 0, S， SO, S02的至多 3个、优选地至多2个杂原子和/或杂基团的单环或多环的优选地单环或二 环杂环原子团。所述杂环基原子团可以是饱和的或部分饱和的。优选具有 至多两个来自O,N和S系列的杂原子的5-7元单环饱和的杂环基原子团， 如作为实例并且优选地四氢呋喃-2-基，吡咯烷-2-基，吡咯烷-3-基，吡咯啉 基，哌啶基，吗啉基和全氢化氮杂萆基。
杂芳基表示通常具有5-10个，优选地5-6个环原子，和至多5个、优 选地至多4个来自S， O和N系列的杂原子的芳香族单环或二环原子团， 作为实例并且优选地表示噻吩基，呋喃基，吡咯基，噻唑基，噁唑基，咪 唑基，吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，吲哚基，吲唑基，苯并呋喃基，苯并噻 吩基，喹啉基和异喹啉基。
羰基-键合的氨基酸表示通过氨基酸官能团的羰基键合的氨基酸。与此 有关优选L或D构型的a-氨基酸，特别是天然存在的oc-氨基酸，如例如甘 氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙 氨酸，L-色氨酸或以非天然D-构型存在的天然存在的a-氨基酸，如，例如, D-丙氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸，D-异亮氨酸，D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-色 氨酸或具有与氨基酸的oc-碳原子键合的侧基的非天然氨基酸，所述侧基如， 例如，C3-C6-环院基甲基，C3-CV环烷基,乙基，正丙基,2，2-二甲基丙基, 叔丁基,3-甲基丁基，正已基或烯丙基，或所述侧链与氨基酸的a-碳原子一 起形成环，如，例如，环丙基(氨基酸l-氨基-l-环丙垸羧酸)，环丁基，环戊 基或环已基，或P-氨基酸(对于命名参见.D. Seebach， M. Overhand, F. N. M. Kiihnle, B. Martinoni, L. Oberer， U. Hommel, H. Widmer， //e/v. C7 'w.爿加1996, 79， 913-941)，如，例如，(3-丙氨酸，卩-苯丙氨酸，P-Aib (oc-甲基丙氨酸) 或2,3-二氨基丙酸的衍生物(例如2,3-二氨基-3-苯基丙酸)。 卤素表示氟，氯，溴和碘，优选氟和氯。
术语活性酯包括本领域技术人员已知的所有的活性酯。本发明优选的 活性酯的实例包括氰基甲基酯，对硝基苯基酯，邻硝基苯基酯，2,4-二硝基 苯基酯，2,4,5-三氯苯基酯，五氯苯基酯，五氟苯基酯(Pfj)), W-羟基苯邻二 甲酰亚胺酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯(O-Su), 1-羟基哌啶酯，5-氯-8-羟基喹啉酯。
分子内环化包括形成酰胺键，其原则上可以通过本领域技术人员己知 的任何方法实现。
环化由此通过下述的亲核攻击发生。
PG O
如果X表示活性酯，拟卤素或卤素，反应通常在惰性溶剂中，如果 适合在碱存在下，优选地在从-30。C到50。的温度范围内，在大气压下发生。
惰性溶剂的实例是四氢呋喃，二氯甲烷，吡啶，二噁烷，氯仿，二乙醚， 叔丁基甲醚，乙酸乙酯或二甲基甲酰胺，优选二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
碱的实例是三乙胺，三异丙基乙胺，或丛甲基吗啉，优选三异丙基乙胺。
如果X表示OH，反应通常在溶性溶剂中，在脱水剂存在下，如果 适合时在碱存在下，优选地在-30。C到50°C的温度范围内，在大气压下 发生。
惰性溶剂的实例是卤代烃如二氯甲烷或三氯甲烷，烃诸如苯、硝基甲 垸、二噁烷、二甲基甲酰胺或乙腈。还可以使用溶剂的混合物。特别优选 的溶剂是二氯甲垸和二甲基甲酰胺。
适合的脱水剂的实例是碳二亚胺诸如，例如W7V'-二乙基-，W7V-二丙基 -，^1二异丙基-,7\^-二环已基碳二亚胺，^-(3-二甲基氨基异丙基)-^'-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，TV-环已基碳二亚胺-TV'-丙氧基甲基-聚苯乙烯(PS-碳二亚胺)，或羰基化合物诸如羰二咪唑，或l，2-噁唑鎗(oxazolium)化合物 诸如2-乙基-5-苯基-l,2-噁唑織3-硫酸盐或2-叔-丁基-5-甲基异噁唑鑰高氯 酸盐，或酰基氨基化合物诸如2-乙氧基-l-乙氧基羰基-l,2-二氢喹啉，或丙 烷膦酸酐，或氯甲酸异丁酯，或二(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯，或苯并三 唑基氧基三(二甲基氨基)磷鑰六氟磷酸盐，或0-(苯并三唑-1-基)-^ ,-四甲基脲鑰六氟磷酸盐(HBTU), 2-(2-氧代-l-(2H)-吡啶基)-l，l，3，3-四甲基 脲鐺四氟硼酸盐(TPTU)或(9-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-AW;V',-四甲基脲鑰 六氟磷酸盐(HATU),或l-羟基苯并三唑(HOBt)或苯并三唑-l-基氧基三(二 甲基氨基)磷鑰六氟磷酸盐(BOP),或苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷子基)磷 鑰六氟磷酸盐(PyBOP)或W-羟基琥珀酰亚胺或这些与碱的混合物。
碱的实例是碱金属碳酸盐，诸如例如，碳酸钠或碳酸钾，或碳酸氢钠 或碳酸氢钾，或有机碱，诸如三垸基胺，例如三乙胺，AT-甲基吗啉，4-甲 基吗啉，AL甲基-呢啶，4-二甲基氨基吡啶或二异丙基乙胺。
反应优选地在4-甲基吗啉存在下与HATU进行。
式(II)的化合物如果适合时含有保护基，因此在这些情况下在式(II)化 合物的分子内环化后根据本领域技术人员已知的方法除去所述保护基。
用于本文时术语"适合的保护基"包括本领域技术人员己知的所有的 保护基，其可以用于掩蔽特异官能团，并且随后可以被去除，而不在被去 保护的分子内引起另外的改变。
例如，伯羟基或仲羟基可以作为可裂解的醚进行保护，特别作为甲氧基甲基醚，苄氧基甲基醚，对甲氧基苄氧基甲基醚，苄基醚，叔丁基醚，四 氢吡喃基醚，烯丙基醚，对氯苯基醚，对硝基苯基醚或三苯基甲基醚进行 保护。甲硅垸基醚代表保护羟基的另外的可能性，例如三甲代甲硅垸基
(TMS)醚，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚，三异丙基甲硅烷基(TIPS) 醚，叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)醚或三苯基甲硅烷基醚。羟基还可以 也被酯基团保护，例如被乙酰基，苯甲酰基，丙酰基，氯乙酰基，三氯乙 酰基，三氟乙酰基或巴豆酰基酯保护。除此之外，碳酸酯如例如碳酸甲酯， 碳酸烯丙酯，碳酸苄酯也适合于保护醇。还可以使用硫酸或磺酸的酯如例 如硫酸酯，烯丙基磺酸酯，对甲苯磺酸酯(甲苯磺酸酯)或磺酸甲酯作为保 护醇的保护基。
对于羟基优选的保护基是叔丁基醚或甲硅烷基醚，尤其是叔丁基二甲 基甲硅烷基醚。
适合用于胍基的保护基原则上与羟基的相同，在该情形下优选 (2,2，5,7，8-五甲基-3,4-二氢-2i7-色烯-6-基)磺酰基(PMC基团)。
羧基可以以它们烷基，甲硅烷基，芳基垸基或芳基酯的形式被保护， 例如作为甲基酯，乙基酯，叔丁基酯，三甲代甲硅烷基酯，叔丁基二甲基 甲硅烷基酯，苄基酯，吡啶甲基酯，三氯乙基酯或三甲代甲硅烷基酯。羧 基也可以以各种酰胺，AK某)酰苯胺或酰肼的形式被保护，例如作为A^V-二甲基酰胺，吡咯烷基酰胺，哌啶基酰胺，o-硝基AK某滩苯胺，豕7-硝基 吲哚基酰胺或7V-苯基酰肼的形式被保护。除了这些之外，它们还可以作为 原酸酯形式被保护，例如作为原酸三甲酯被保护。羧酸优选地以它们的酯 的形式被保护，尤其作为甲酯或三甲代甲硅烷基乙酯的形式被保护。
特别适合用于保护氨基的基团是提供可裂解的氨基甲酸酯的那些，例 如甲氧基羰基，叔丁氧羰基(Boc),苄氧基羰基(CBz或Z),烯丙氧基羰基 (alloc), 9-药基甲氧基羰基(Fmoc), 2-三甲代甲硅烷基乙基羰基1-金刚垸基 羰基，间硝基苯基。氨基还可以进一步以容易裂解的酰胺或酰亚胺的形式 被保护，例如作为甲酰胺，氯乙酰胺，三氯乙酰胺，三氟乙酰胺，苯甲酰 胺，邻硝基苯基乙酰胺，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺或硝基苯 邻二甲酰亚胺的形式被保护。保护氨基的另外的可能性是与特定的垸基， 如例如，叔丁基，甲基，三苯基甲基，二茂铁基甲基或烯丙基，或与芳基如例如2,4-二硝基苯基形成可裂解的胺。
氨基甲酸酯优选地用于保护氨基，并且在这些中特别是叔丁氧羰基
(Boc),节氧基羰基(CBz或Z)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。.
在本文列出的保护基仅是作为实例并且不代表所有可能性的穷尽性 列表。该领域的更广泛的处理特别见于T. W. Greene, P. G. M. Wuts 尸ra&c"w /" Ogam'c ^"/;2M&(有机合成中的保护基)，3rd EdMon(第
3版)，John Wiley & Sons Inc. 1999。
在本文使用的由PG表示的基团在一个分子中可以是相同的或不同的 适合的保护基，或相同的或不同的保护基与H的组合或完全是H。
式(II)的化合物优选地是下式(IIa)的化合物
PG Q
其中X和R1如上定义，
其中W是异丙基甲基，叔丁基甲基，2,2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁 -l-基，2,2-二乙基丁-1-基，2,2-二甲基戊-1-基，3-吡啶基甲基4-三氟甲基-3-
吡啶基甲基，苄基或三甲代甲硅垸基甲基，
其中R"是异丙基甲基，叔丁基甲基，2,2-二甲基丁-1-基2-乙基-2-甲基丁 -l-基，2,2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基三甲代甲硅烷基甲基或苄基, 并且其中PG是H或适合的保护基。
W优选地是异丙基甲基，叔丁基甲基或3-吡啶基甲基并且特别地R6
是异丙基甲基。
W优选地是异丙基甲基，叔丁基甲基或三甲代甲硅垸基甲基并且特别 地W是异丙基甲基。 X优选地是OH。 R1优选地是CH3。
在本发明的另外的实施方案中，所述化合物(ii)通过将下式(m)的化合
物与下式(IV)的化合物偶联进行制备
<formula>formula see original document page 23</formula>(III)
<formula>formula see original document page 23</formula>
(IV)
其中W到R5如上定义，
其中Y是0H，活性酯，拟卤素或卤素，并且
其中PG是H或适合的保护基，
并且，当适合时，将中间体部分地或完全地去保护，和当适合时，将3-羟基 苯基丙氨酸的羧基转化为式-C(K))X的基团，其中X如上定义。
HN o-p式(m)的化合物特别是下式(nia)的化合物，
(Ilia)
其中RS和R7如上定义，并且 其中PG是H或适合的保护基。
偶联可以在如上关于分子内环化所述的相同或不同的条件下发生。由 此，偶联通过下面所述的亲核攻击发生。
可以通过本领域技术人员已知的方法，将3-羟基苯丙氨酸的羧基转化 为式-C(K))X的基团。
在中间体中存在的保护基可以完全地，部分地或根本不对应于所需产 物的那些。当适合时，这些可以通过本领域技术人员己知的方法去除，替 代或连接。
在本发明的另一个实施方案中，式(m)的化合物通过将下式(v)的化合
物与下式(VI)的化合物偶联，和当适合时，将中间体部分地或完全地去保护进行制备:
<formula>formula see original document page 25</formula>
其中R2到R5如上定义，
其中Z是OH,活性酯，拟卤素或卤素，并且 其中PG是H或适合的保护基。
由此化合物(V)特别是下式(Va)的化合物:<formula>formula see original document page 25</formula>其中R6和R7如上定义，并且 其中PG是H或适合的保护基。
偶联可以在如上关于上述偶联或分子内环化所述的相同或不同条件 下进行。其中，偶联可以通过下述的亲核攻击进行。在中间体中存在的保护基可以完全地、部分地或根本不对应于所需产 物的那些。当适合时，这些可以通过本领域技术人员已知的方法连接，去 除或替代。
本发明还涉及下式(in)的化合物
其中W到R5如上定义，并且 其中PG是H或适合的保护基， 特别地，下式(IIIa)的化合物
<formula>formula see original document page 26</formula><formula>formula see original document page 27</formula>(Ilia)
其中W和R7如上定义，并且
其中PG是H或适合的保护基，
并且尤其是下式(IIIb)的化合物。<formula>formula see original document page 27</formula>
(nib)
本发明涉及通过将式(V)的化合物与式(VI)的化合物偶联和当适合时，
将中间体部分或完全去保护来制备式(m)的化合物的方法。 本发明还涉及下式(vi)的化合物，其中Z是OH,活性酯，拟卤素或卤素，并且
其中PG是H或适合的保护基， 特别是下式(VIa)的化合物
NH，
O' HO、
OH
O
O
0、
CH,
O CH，
(Via)
以及通过使下式(VII)的化合物与下式(VIII)的化合物偶联，和当适合时进 行中间体的完全或部分去保护来制备式(VI)的化合物的方法
PG O
O
PG—O
O—PG
NH，
0 (VII)
其中PG是H或适合的保护基。
(VIII)
其中，式(vn)和(vin)的化合物特别分别是下式(viia)和(vnia)的化合
物:
NH，
o
HO
NH，
0 HCI
(Vila)
o
o
o
o
CH,
0
0 CH
CH，
3 (VIIIa)
28本发明的制备方法和本发明的化合物的制备通过下面涉及合成溶杆 菌素的合成方案更加详细的解释。
所述方法基于各种片段的单元结构，所述单元结构接着组合以得到式
(II)的化合物。式(n)的化合物接着进行分子内环化并且当适合时，去保护
以获得需要的最终产物。
与此相关出人意料地发现，受构造单元的选择和其偶联的顺序的影
响，可以制备已经在它们链中具有酯键的式(n)的开链分子。还发现，在存 在酯键的情况下，可以将这些开链化合物进行环化以得到的需要的环状酯肽。
根据合成方案l，从(2S，3S)-2-氨基-3-羟基-4-甲氧基-4-氧代丁酸和&o
甘氨酸iV-羟基琥珀酰亚胺酯开始合成片段1 。
<formula>formula see original document page 29</formula>
合成方案i
根据合成方案2从3-羟基苯基丙氨酸开始制备片段2(
<formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula>片段2
合成方案2
根据合成方案3从根据合成方案3的A^-(苄氧基羰基)-D-亮氨酸和L-亮氨酸甲酯合成片段3。可以通过在该步骤中替代所述两种亮氨酸衍生物 来制备具有任何R2到R5原子团的式(I)的化合物。
接着，根据合成方案4偶联片段2和3，进行部分去保护并且将得到 的中间体与A^-(叔丁氧羰基)-0、叔丁基-L-丝氨酸反应以在进一步去保护 后获得部分去保护的片段4。
片段3<formula>formula see original document page 30</formula>
合成方案3<formula>formula see original document page 31</formula> 合成方案4
以该方式获得的片段4与根据合成方案5的片段}偶联从而在部分去 保护后获得片段5。合成方案5
<formula>formula see original document page 32</formula>接着，将片段5与根据合成方案6的片段6偶联。该片段6是五肽。
其可以通过已知方法制备。可以通过在片段6的位置2中用缬氨酸替代亮 氨酸来制备片野菌素A而不是溶杆菌素。将得到的中间体去保护而得到片 段7，其表示式(II)的化合物。根据合成方案7分子内环化和随后去保护得 到所需的环状酯肽，在该情形中为溶杆菌素。<formula>formula see original document page 34</formula>合成方案6<formula>formula see original document page 35</formula>实施例
溶杆菌素的从头合成 缩写PA087666
abs. 无水的
aq. 水性
Boc W-叔丁氧羰基
cone. 浓縮的
DCC 二环已基碳二亚胺
DIEA A/;iV-二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF W-二甲基甲酰胺
EDC l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
EDTA 乙二胺四乙酸
叫 当量
fmoc 9-荷基甲氧基羰基
h 小时
HATU 0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-7\^ -四甲基脲鑰六氟磷酸盐
HOBT l-羟基-l/f-苯并三唑水合物
LHMDS 六甲基二硅基胺基锂
min 分钟
MTBE 甲基叔丁醚
NMM W-甲基吗啉
org. 有机的
RT 室温
sat. 饱和的
TBAF 氟化四丁基铵
TBTU 7\4(1//-1,2，3-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基氨基)亚甲基]-^甲
基甲铵(methanaminium)四氟硼酸盐
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TMG MWWiV-四甲基胍
XPHOS 二环已基(2，,4，，6，-三异丙基联苯基-2-基)膦PA087666 材料和方法
分析方法-HPLC/UV
方法1
HPLC仪器类型HP 1100系列；UV DAD;柱Phenomenex Synergi 2 |i Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm;洗脱剂A: 1 1的水+ 0.5 ml的50%甲 酸，洗脱剂B: 1 1的乙腈+ 0.5 ml的50%甲酸；梯度0.0分钟90%A ^ 2.5分钟30%A + 3.0分钟5%A + 4.5分钟5%A;流速0.0分钟1 ml/分钟，2.5分钟/3.0分钟/4.5分钟.2 ml/分钟；烘箱50°C; UV检测210 nm. 方法2
仪器具有DAD检测的HP 1100;柱Kromasil 100 RP-18, 60mm x 2.1 mm, 3.5 pm;洗脱剂A = 5 ml的HC104 (70%)/l的H20， B = ACN;梯度0 分钟2%B， 0.5分钟2%B, 4.5分钟90%B, 9分钟90%B, 9.2分钟.2%B, 10分钟2%B;流速0.75 ml/分钟；柱温.30°C;检观!j: UV 210 nm. 方法3
仪器具有DAD的Agilent 1100 (G1315B)，双泵(G1312A),自动取样器 (G1313A),溶剂脱气装置(G1379A)和柱自动调温器(G1316A);柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 x 5 mm;柱温30°C;洗脱剂A: 0.05%在 水中的70%高氯酸；洗脱剂B:乙腈；流速2.00 ml/分钟；梯度0-1分钟 10% B，斜升，4-5分钟90% B，斜升，5.5分钟10% B. 方法4
HPLC仪器类型HP 1050系歹iJ;UVDAD;柱Zorbax 300 mSB-C18 3.5 |i， 4.6 mm x 150 mm;洗脱剂A: 1 1的水+0.1%TFA，洗脱剂B:在具有0.P/。 TFA的水中的60%乙腈；梯度0.0分钟10%B,斜升，18.0分钟80%B, 20.0分钟100。/。B，25.0分钟100%B.流速1 ml/分钟；烘箱40°C; UV检 湖U: 210亂 方法5
HPLC仪器类型HP 1050系歹U;UVDAD;柱Zorbax 300 mSB-Cl8 3.5 4.6 mm x 150 mm;洗脱剂A: 1 1的水+ 0.1% TFA,洗脱剂B:在具有 0.1。/。TFA的水中的60。/。的乙腈;梯度0.0分钟10%B，2.00分钟10°/。 B，斜升，50.0分钟80。/。B，52.0分钟100%B, 55分钟100% B.流速0.7 ml/
分钟；烘箱40。C;UV检测210nm.
方法6
具有DAD的Agilent 1100 (G1315B)，双泵(G1312A)，自动取样器 (G1313A)，脱气装置(G1379A)和柱自动调温器 (G1316A);柱 Phenomenex Gemini 5 (i C-18, 50 x 2 mm;烘箱温度40。C;洗脱剂A:水+ 0.1%甲酸；洗脱剂B:乙腈；流速2.00ml/分钟；梯度0-1分钟0% B， 斜升，0-5分钟100% B， 5.50分钟100% B. 方法7
Daicel Chiralpak AD-H 5 |im 250 mm x 2.0 mm,正庚烷/乙醇95+5,流速 0.2 ml/分钟，在220nm的UV检测。
分析方法—HPLC/MS, MALDI, HR-MS
方法8
MS仪器类型Micromass ZQ; HPLC仪器类型Waters Alliance 2795/HP 1100;柱Phenomenex Synergi 2 p氢-RP Mercury 20 mm x 4 mm; 洗脱剂A:ll的水+ 0.5 ml的50%甲酸，洗脱剂B: 1 1的乙腈+0.5ml的 50%甲酸；梯度0.0分钟90%A + 2.5分钟30%A + 3.0分钟5%A + 4,5分钟5%A;流速0.0分钟1 ml/分钟,2.5分钟/3.0分钟/4.5分钟 2ml/分钟；烘箱50。C;UV检测210nm. 方法9
MS仪器类型Micromass ZQ; HPLC仪器类型Waters Alliance 2795/HP 1100;柱Phenomenex Gemini 3 p C-18濯A， 30 mm x 3 mm;洗 脱剂A: 1 1的水+ 0.5 ml的50%甲酸，洗脱剂B: 1 1的乙腈+ 0.5 ml的 50%甲酸；梯度0.0分钟90%A ^ 2.5分钟30%A > 3.0分钟5%A今 4.5分钟5%A;流速0.0分钟1 ml/分钟,2.5分钟/3.0分钟/4.5分钟 2 ml/分钟；烘箱50°C; UV检测210 nm. 方法10
UV检测210 nm. MS仪器类型Micromass ZQ; HPLC仪器类型Waters Alliance 2795;柱Phenomenex Synergi 2|a氢-RP Mercury 20 mm x 4 mm;洗脱剂A: 1 1的水+ 0.5 ml的50%甲酸，洗脱剂B: 1 1的乙腈+ 0,5 ml 的50%甲酸；梯度0.0分钟90%A2.5分钟30°/oA ^ 3.0分钟5%A 今4.5分钟5%A;流速0.0分钟1 ml/分钟,2.5分钟/3,0分钟/4.5分钟 2 ml/分钟；烘箱50°C; UV检观U: 210 nm. 方法11
仪器具有HPLC Agilent系歹U 1100的Micromass Platform LCZ;柱 Thermo Hypersil GOLD 3|u 20 mm x 4 mm;洗脱剂A: 1 1的水+ 0.5 ml的 50%甲酸，洗脱剂B: 11的乙腈+ 0.5ml的50%甲酸；梯度0.0分钟 100%A ^ 0.2分钟100%A ^ 2.9分钟30%A ^ 3.1分钟10%A ^ 5.5分 钟10%A;烘箱50。C;流速0.8 ml/分钟；UV检测210nm. 方法12
仪器具有HPLC Agilent系歹lj 1100的Micromass Platform LCZ;柱 Thermo HyPURITY Aquastar 3|a 50 mm x 2.1 mm;洗脱剂A: 1 1的水+ 0.5 ml的50。/。甲酸，洗脱剂B:ll的乙腈+ 0.5 ml的50%甲酸；梯度0.0分 钟100%A ^ 0.2分钟100%A + 2.9分钟30%A + 3.1分钟10%A ■> 5.5分钟10%A;烘箱50。C;流速0.8 ml/分钟；UV检测210nm. 方法13
仪器Micromass LCT;离子化ESI正/负；具有DAD和自动取样器的 HPllOO;烘箱40。C;柱Waters Symmetiy C-8, 50 x 2.1匪，3.5 pm;洗 脱剂A: 0.1%甲酸/乙腈，洗脱剂B: 0.1%甲酸/水；流速0.5 ml/分钟；梯 度0-l分钟0%A, 1-6分钟90% A, 6-8分钟100% A, 8-10分钟100% A, 10-15 0%A. 方法14
用Micromass LCT仪器(毛细管电压3.2 KV，椎体电压42 V，源温 度:120。C,解溶剂化温度280。C)记录rOF-i/i -MS-E57+光谱。将注射器泵 (Harvard Apparatus)用于为此目的的样品递送。将亮氨酸-脑磷脂 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)用作标准。
制备分离方法-HPLC,凝胶色谱法
方法15仪器Gilson Abimed HPLC;双泵系统；柱Nucleodur C18 Gravity, Macherey-Nagel, 5 ,; 250 x 21 mm;洗脱剂A:水/0.05%-0.1% TFA，洗脱 剂B:乙腈；梯度0画8分钟5%B, 8-40分钟5-60%B， 40-60分钟60%B, 60-75分钟60-100%B, 75-80分钟100%B，并接着再生色谱柱；流速 7-15 ml/分钟；UV检测器210 nm. 方法16
仪器Gilson Abimed HPLC;双泵系统；柱K匪asil-100A C18, 5 ,; 250 x 30 mm;洗脱剂A:水/0.05-0.5% TFA,洗脱剂B:乙腈；梯度0-5分钟 5%B, 5.01-10分钟10%B， 10.01-20分钟40%B, 20.01-27分钟50%B, 27.01-40分钟60%B， 40.01-45分钟90%B, 45.01-60分钟100%B;流速 15-60 ml/分钟；UV检测器210 nm. 方法17
Gilson Abimed HPLC; UV检测器210證；柱Kromasil RP-18 5 pm， 100 A, 250 x 20 mm;洗脱剂A:水+0.05% TFA,洗脱剂B:乙腈+ 0.05% TFA: 流速10 ml/分钟;0-3分钟5% B，斜升，35分钟90% B. 方法18
Gilson Abimed HPLC; UV检测器210 nm;柱Gromsil ODS-4HE 10 pm, 250 x 40 mm;洗脱剂A:水+ 0.05% TFA，洗脱剂B:乙腈+ 0.05% TFA: 流速20ml/分钟;0-3分钟10% B，斜升，30-35分钟90% B， 35-40分钟 90% B.
方法19
Gilson Abimed HPLC; UV检测器210 nm;柱Waters Symmetry-Prep C-18， 7pm， 300 x 19 mm;洗脱剂A:水+ 0.05% TFA,洗脱剂B:乙腈+ 0.05% TFA:流速10ml/分钟;0-3分钟10% B，斜升，30-38分钟90% B， 38-45分钟10% B. 方法20
凝胶色谱法在没有压力的SephadexLH-20 (Pharmacia)上进行。根据 UV活性(UV检测器，254 nm, Knauer)取级分(ISCO Foxy 200级分收集器)。 柱体积32 x 7 cm (1000—100 pmol规模)；30 x 4 cm (100—10 pmol规模); 25 x2cm(10-l pmol规模)。将甲醇用作洗脱剂。方法21
Gilson Abimed HPLC; UY检测器210 nm;柱Biotage Flash40 RP-18或相 容的模块可变(module Varian)Metaflash C18 40M, 35 pm， 150 x 40 mm;洗 脱剂A:水+0.05。/oTFA，洗脱剂B:乙腈+ 0.05% TFA:流速40 ml/分钟; 0-3分钟10% B,斜升，30-38分钟90% B, 38-45分钟10% B.
通用工作方法 方法l
将原材料吸收在30% TFA (在二氯甲烷中的溶液)中并在室温搅拌30 分钟。接着，将溶剂在真空中蒸馏除去，在此过程中，水浴温度不应该超 过30。C。接着，将产物在油泵真空下干燥到恒定重量。
A.化合物的制备
示例性化合物1A: A^-(叔丁氧羰基)-L-别苏氨酸
将L-别-苏氨酸(3.15 g, 26.44 mmol)溶解于水-二噁垸(l+2， 75 ml)，加 入二碳酸二叔丁酯(6.35 g, 29.09 mmol， 1.1当量)和三乙胺(4.79 ml, 34.38 mmo1，1.3当量)，并将所述混合物在室温搅拌过夜。接着将溶剂在真空下 去除。将所述残余物吸收在乙酸乙酯中并用1M柠檬酸提取。将水相用 乙酸乙酯再提取数次，直到产物在其中不再能检测到(HPLC，方法3)。接 着，将合并的有机提取物通过硫酸钠进行干燥，进行浓縮并在油泵真空下 干燥到恒重。将产物进行反应，而不需要进一步纯化。产率6.5g的粗制 产物。
HPLC (方法3): Rt = 3.23分钟.LC-MS (方法11): Rt = 2.51分钟，MS (ESIneg): m/z (%) = 217.8 (100) [M-H]-.'H丽R (400固z， ^-DMSO) 5 (ppm) = 1.08 ((!， /= 5.4 Hz, 3H)， 1,38 (s, 9H)， 3.72-3.84 (m, 2H)， 6.77 (d, /= 7.4 Hz， 1H).
示例性化合物2A: A^-(叔丁氧羰基)-L-别苏氨酸苄酯
<formula>formula see original document page 42</formula>
所述方法以类似于下列文献中的方式进行S. B. Cohen, R. Halcomb， / 爿w. C/zew. 5bc 2004, /2《2534-2543. W, Jiang， J. Wanner, R. J. Lee， P,Y. Bounaud， D. L. Boger, / ^m. CTzem. 5bc 2003， "5, 1877-1887.
将示例性化合物1A (6.8 g的粗制产物，26.44 mmol)置于甲醇(177 ml) 中，加入碳酸铯(5.56 g, 17.06 mmol, 0.63当量)并搅拌混合物直到完全溶 解。接着通过蒸馏除去溶剂DMF(42ml)，接着加入苄基溴(4.06 ml， 34.12 mmol, 1.26当量)。将混合物搅拌16小时，接着在真空中去除大部分的 DMF。将残余物吸收在水中并用3份的二氯甲烷提取。将合并的有机相通 过硫酸钠进行干燥，过滤并在真空中浓縮。在BiotageRP18-Flash(水-乙腈 梯度0-5分钟10%ACN,3-30分钟10-90% ACN, 30-35分钟90%ACN; 流速:20 ml/分钟)上纯化粗制产物。合并包含产物的级分并冷冻干燥。 产率5.00 g (16.16 mmol，理论值的52%)的标题化合物。 HPLC (方法3): Rt = 4.36分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2,39分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 332.6 (25) [M+H]+.
'H NMR (400 MHz, ^-DMSO) S (ppm) = 1.09 ((!， /= 6.4, 3H), 1.37 (s, 9H)， 3.82 (m, 1H)， 3.95 (dd, ■/= 6.4, /= 8.1 Hz)， 4.98 (d, /= 5.4 Hz， 1H), 5.09 (d, / =12.7 Hz, 1H), 5.16 (d, 12.7 Hz， 1H), 7.10 (d, /= 8.1 Hz， 1H)， 7.31-7.37 (m， 5H).示例性化合物3A: L-别苏氨酸苄酯三氟乙酸盐
NH,
根据方法1 ，将530 mg的示例性化合物2A与8.0 ml的TFA溶液反 应。使粗制产物反应(589mg,定量)，而不需要进一步纯化。 HPLC(方法3):R「3.18分钟.
LC-MS (方法11): Rt = 2.24分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 210.0 (100) [M+H]+.
NMR (400 MHz, c^-DMSO) S (ppm) = 1.15 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 4.09-4.10 (m, 2H)， 5.26 (s, 2H)， 7.36-7.44 (m， 5H)， 8.34 (br. S, 2H).
示例性化合物4A: [A^-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酰]-L-别苏氨酸苄酯
将示例性化合物3A(2.30 g, 7.12 mmol)和7V-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸 (2.14 g， 9.25 mmol， 1,3当量)溶解于DMF (21.0 ml)。加入4-甲基吗啉(1.3 ml， 12.02 mmol， 1.7当量)和HATU (3.52 g, 9.25薩ol， 1.3当量)，并将混合 物在室温搅拌达16小时。接着首先根据方法20和随后根据方法21，通过 色谱法纯化全部混合物。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率1.75 g (4.14mmo1,理论值的58%),其为浅米色无定形固体。 HPLC (方法3): Rt = 4.59分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2.56分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 423.8 (70) [M+H]+,
'H雨R (400 MHz, A-DMSO) 5 (ppm) = 0.74-0.78 (m, 6H), 1.01-1.07 (m, 2H), 1.10 (d， 《/= 6.3 Hz, 3H), 1.37 (s， 9H), 1.64-1.66 (m, 1H)， 3.86-3.94 (m， 1H), 4.28 (dd， 《/= 7.3， /= 7.3 Hz， 1H), 5.05 (d, /= 5.6 Hz), 5.09 (d, /= 12.7Hz, 1H)， 5.13 (d，J= 12.7 Hz， 1H)， 6,70 (d，《/=9.0Hz, 1H), 7.31-7.36 (m， 5H), 8.11 8.1 Hz).
HR-TOF-MS (方法14): C22H35N206计算值423.2490，实测值423.2489 [M+H]+.
示例性化合物5A: L-异亮氨酰-L-别苏氨酸苄酯三氟乙酸盐
*TFA
根据方法1 ，将示例性化合物4A (224 mg, 0.53 mmol)用8.0 ml的TFA 溶液处理。获得253 mg的实施例5A的粗制产物(约9P/。纯，0.53mmo1，定
量)并进行反应而不需进一步纯化。 HPLC(方法3):R「3.51分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 1.58分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 323,6 (100) [M+H]+.
画R (400 MHz， ^j-DMSO) 5 (ppm) = 0.77-0.86 (m， 6H), 1.02 (m, 1H), 1.15 (d， J= 6.4 Hz, 3H), 1.45 (m, IH)， 1,77 (m， IH)， 3.97 (m， IH)， 4.34 (m， 1H), 5.11 (d， 《/= 12.5 Hz， 1H), 5.16 ((!， /= 12.5 Hz， 1H), 7.37-7.39 (m, 5H)， 7.47 (m， 1H), 8.07-8.08 (m, 3H)， 8.69 (d， 7.3 Hz， 1H).
示例性化合物6A: [A^-(叔丁氧羰基)-D-精氨酰]-L-异亮氨酰-L-别苏氨酸苄
酯示例性化合物5A(253 mg 91%纯，0.53 mmol)和A^-(叔丁氧羰基)-D-精 氨酸(145 mg, 0.53 mmol， 1当量)溶解于DMF (3.0 ml)中。加入4-甲基吗啉 (76 pl， 0.70 mmol， 1.3当量)和HATU (221 mg, 0.58 mmol, 1.1当量)，并将混 合物在室温搅拌16小时。接着，将全部混合物置于HPLC柱上并通过色 谱法进行纯化(方法18)。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率364 mg (0.53mmo1,理论值的99%)的标题化合物。 HPLC(方法3):R「3.91分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2,04分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 579.9 (100) [M+H]+.
'H NMR (權MHz， ^-DMSO) S (ppm) = 0.72-1.16 (m， 8H)， 1.37 (s, 9H)， 1.46 (m, 2H)， 1.60 (m, 1H)， 1.69 (m, 1H)， 3.06 (m， 2H)， 3.93-4.01 (m, 2H), 4,25 (m, 1H), 4.33 (m, 1H), 5.07-5.14 (m， 2H)， 6.96 (d, 7.8, 1H)， 7.35 (m, 5H)， 7.45 (m, 1H), 7.66 (d, 8.8)， 8.33 (m， 1H).
示例性化合物7A: D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏氨酸苄酯双三氟乙酸盐
<formula>formula see original document page 45</formula>
根据方法1 ，将示例性化合物6A (237 mg, 0.34 mmol)用2.0ml的TFA 溶液处理。获得255 mg的示例性化合物7A的粗制产物(94%纯的， 0.34mmo1,定量)并进行反应而不需进一步纯化。 HPLC (方法3): Rt = 3.42分钟.
LC-MS (方法11): Rt = 2.42分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 479.3 (50) [M+H]+.
NMR (400MHz， ^-DMSO) 5 (ppm) = 0.73-0.81 (m， 5H), 1.11-1.19 (m, 5H)， 1.33-1.49 (m, 3H), 1.74 (m, 3H), 3.10 (m， 2H), 3.88-3.95 (m， 2H)， 4.25 (dd, /= 6.8, /= 7.1 Hz， 1H)， 4.46 (dd, 7.3, /= 8.8 Hz, 1H)， 5.09 (d, / =12.5 Hz, 1H)， 5.15 (dd, /= 12.5 Hz), 7.36 (m, 5H)， 7.61 (m, IH)， 8.10 (m, 2H), 8.51 (d, /=7.6Hz， IH)， 8.57 (d， 《/= 9.0 Hz, 1H).
示例性化合物8A: [A^-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酰]-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别
苏氨酸苄酯三氟乙酸盐
*TFA
将示例性化合物7A (240 mg, 0.34 mmol)和iV-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸 (79 mg, 0.34 mmol, 1当量)溶解于二氯甲垸-DMF(5+l， 6 ml)。加入二异丙基 乙胺(296 pi, 1,70 mmol， 5当量)和HATU (194 mg， 0.51 mmol， 1.5当量)，并 将混合物在室温搅拌24小时。接着，将完全的混合物放置于凝胶色谱柱 上并通过色谱法进行纯化(方法20，洗脱剂是甲醇)。合并包含产物的级分 并进行浓縮。产率146 mg (0.18 mmol，理论值的53%)的标题化合物。 HPLC(方法3):R^4.15分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 1.92分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 692.8 (100)， [M+H]+.
'H NMR (400 MHz， ^-DMSO) 5 (ppm) = 0.72-1.23 (m， 22H)， 1.37 (s， 9H), 1.38-1,71 (m， 3H), 3.08 (m， 2H), 3.91-4.00 (m, 2H), 4.26 (m, 1H)， 4.33-4.42 (m, 2H)， 5.07-5.15 (m, 2H), 6.92 (d, 7.8 Hz, 1H), 7.35 (m, 5H)， 7.47 (m, 1H)， 7.88 (d, /= 8.1 Hz， 1H)， 7.93 (d， 9.0 Hz， 1H)， 8.35 ((!，■/= 7,3 Hz, 1H).
示例性化合物9A: L-亮氨酰-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏氨酸苄酯双三氟
乙酸盐<formula>formula see original document page 47</formula>
根据方法1 ，将示例性化合物8A (220 mg, 0.27 mmol)用2.0 ml的TFA 溶液处理。获得223 mg的实施例9A的粗制产物(0.27mmo1,定量)并进行
反应而不需进一步纯化。 HPLC (方法2):Rf3.80.
LC隱MS (方法11): Rt = 2.54分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 592,4 (2) [M+H]+. 'H丽R (400 MHz, ^-DMSO) 5 (ppm) = 0.73-1.11 (m， 13H), 1.22-1.74 (m， 12H)， 3,11 (m， 4H)， 3.60 (m, 2H)， 3.87 (m， 1H)， 3.95 (m, 1H)， 4.25 (m, 1H), 4.38 (dd, /= 7.8， 8.6 Hz, 1H)， 4.64 (dd, /= 7.8, 13.7 Hz， 1H), 5.09 (d， J= 12.7 Hz， 1H)， 5.13 (d, /= 12,7 Hz, 1H), 7.35 (m， 5H), 7.58 (m， 1H)， 8.07 (m， 2H), 8.25 (d, /= 8,8 Hz, 1H)， 8,39 (d， /= 7.6 Hz, 1H)， 8.77 (d, /= 8.3 Hz， 1H).
示例性化合物10A: [(3/ )-^-(叔丁氧羰基)-3-羟基丄-亮氨酰]七-亮氨酰-0-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏氨酸苄酯三氟乙酸盐
将示例性化合物9A(223 mg, 0.27 mmol)和AK叔丁氧羰基)隱(^)-3-羟 基-L-亮氨酸(89 mg， 0.33 mmol， 1.22当量)溶解于DMF(6 ml)，并将所述溶液冷却到-20。C。加入4-甲基吗啉(150 nl， L36mmo1，5当量)和HATU(165 mg, 0.44 mmol, 1.6当量)，并将混合物在室温搅拌达16小时。接着将完全 的混合物置于凝胶色谱柱上并通过色谱法进行纯化(方法20,洗脱剂是甲 醇)。合并包含产物的级分并进行浓縮。产率188 mg (0.20 mmol，理论值 的74%)的标题化合物。 HPLC (方法3): Rt = 4.24分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 1.99分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 821.9 (100) [M+H]+.
'H NMR (400 MHz， (DMSO) S (ppm) = 0.71-0,90 (m, 15H), 1.00 (m, IH)， U0 (d， /= 6.4 Hz， 3H), 1,24-1.26 (m, 3H)， 1.38 (s, 9H)， 1.42-1.71 (m, 6H), 3,06-3.17 (m， 3H), 3.45 (m, IH)， 3.61 (m， IH)， 3.93 (m， IH)， 4.05 (m, IH)， 4.26 (m, IH)， 4.35 (m, 2H)， 4.54 (d, 7.8 Hz， IH)， 5.07-5.15 (m， 2H)， 5.45 (d, J= 9.0 Hz， IH)， 7.35 (m, 5H)， 7.46 (m, IH)， 7.85 (d, /= 7.8 Hz, 1H), 7.89 (d, ■/= 8.8 Hz， IH)， 7,97 (d， /= 8.1 Hz， 1H), 8,35 (d, 7.6 Hz, 1H).
示例性化合物11A: [(3/0-^2-(叔丁氧羰基)-3-羟基丄-亮氨酰]丄-亮氨酰-0-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏氨酸三氟乙酸盐<formula>formula see original document page 48</formula>
将示例性化合物IOA(IOO mg， 0.11 mmol)溶解于冰醋酸(4.3 ml)，加入 10。/。的披钯碳(22mg)，并将所述混合物在大气压下在室温氢化2小时。将 催化剂滤去并将滤液冷冻干燥。通过色谱法纯化粗制产物(方法17)。合并 包含产物的级分并冷冻干燥。获得58mg(60 pmol,理论值的55%)的标题 化合物。
HPLC(方法3):R,3.75分钟.LC-MS (方法9): Rt = 1.80分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 731.8 (100) [M+H]+.
示例性化合物12A: [A^(叔丁氧羰基)-甘氨酰H35V3-羟基-0、甲基-L-天冬
根据G. Cardillo, L. Gentilucci， A. Tolomelli， C. Tomasini， 1999, 1727-1730的方法制备C5Q-3-羟基天冬氨酸，并将其以类似于P. G. Mattingly, M, J. Miller，Og. Ozem. 1983,银3556-3559的方法，使用微波辐射在紧 闭的反应器中转化为(2&35)-2-氨基-3-羟基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐。
将(2&3Q-2-氨基-3-羟基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(447 mg， 2.24 mmol)溶解于DMF (9 ml)。并将所述溶液冷却到0°C，加入Boc-甘氨酸 iV-羟基琥珀酰亚胺酯(763 mg， 2.91 mmol, 1.3当量)，DMAP(14mg， 0.11 mmol，0.05当量)并最终加入DIEA (1170 |al， 6.72 mmol, 3当量)。容许 所述混合物缓慢加温到室温并接着再搅拌2小时。将所述混合物用冰醋酸 酸化，与乙腈混合并在Sephadex LH 20上进行色谱分离(方法20)。合并包 含产物的级分，浓缩并再次进行色谱分离(方法21)。合并包含产物的级分 并冷冻干燥。将得到的产物(761mg,定量)进行反应而不需要进一步纯化。 对于分析目的，通过HPLC获得纯的样品(方法19)。 HPLC(方法3):R「3.15分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 1.17分钟，MS (ESIpoS) = 321.2 [M+H]+, [a]20Na = + 39。 (c = 0.55， MeOH).
!H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 (ppm) = 1.40 (s， 9H)， 3.49-3.60 (m， 2H)， 3.61 (s, 3H)， 4.29 (m, IH)， 4.73 (<!, /= 6.6 Hz, 1H), 7.01 (m, 1H), 7.49 (d， J = 6.99 Hz, 1H).
13C-NMR (d6匿丙酮，126画z， DEPT) 5 (ppm) = 28,5 (CH3), 42.2 (CH2)， 51.8(CH3)， 53.7 (CH)， 56.0 (CH), 79.2 (quat)， 169.6 (quat)， 169.7 (quat)， 172.8 (quat)， 173.8 (quat).
HR-TOF-MS (方法14): C12H22N208 [M+H]+计算值321.1298，实测值: 32U299.
示例性化合物13A: [A^(叔丁氧羰基)-甘氨酰]-(3Q-3-羟基-L-天冬酰胺
将示例性化合物12A (353 mg， 1.10 mmol)溶解于25%氨水(1.70 ml), 并将混合物在室温搅拌约2小时。一旦反应结束(通过HPLC检测，方法3)， 将混合物在油泵真空下浓縮到干燥，并将残余物通过HPLC (方法17)纯化。 合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率172mg(理论值的51%)的标题化 合物，其为无色固体。 HPLC (方法3): Rt = 2.70分钟.<formula>formula see original document page 50</formula>
LC-MS (方法11): Rt = 2.21分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 306 (70) [M+H]+, 示例性化合物14A: (3i )-3-羟基苯基丙氨酸<formula>formula see original document page 50</formula>根据Belokon (Y. N. Belokon, K. A. Kochetkov， N. S. Ikonnikov, T. V. Strelkova, S. R. Harutyunyan， A. S. Saghiyan, refna/^ra":爿s戸we^y 2001， W，481-485)的方法，合成该示例性化合物。<formula>formula see original document page 50</formula>LC-MS (方法12): Rt = 0.41分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 182.1 (100) [M+H]+.20Na =画21。 (c = 0.1， MeOH). Lit (D. Alker， G. Hamblett， L. M. Harwood, S. M. Robertson, D. J. Watkin, C. E. Williams, 7^ra/ edra"(四面体)1998, 5《6089-6098): [a]22Na = -20。 (c = 0.8, MeOH).
'H画R (400 MHz， D20) 5 (ppm) = 3.84 (d, J= 4.5 Hz， 1H)， 4.64 (d, J =4.5 Hz, 1H)， 7.30-7.36 (m, 5H).
示例性化合物15A: A^-丁氧基羰基-(3/ )-3-羟基苯基丙氨酸
将示例性化合物14A (0.5 g, 2.76 mmol)置于1,4-二噁烷-水(2+1， 9 ml) 中，并加入三乙胺(500 pl， 3.59 mmol， 1.3当量)和二碳酸二叔丁酯(660 mg， 3.04mmo1, 1.3当量)。将混合物在室温搅拌16小时，接着使用1M柠檬酸 终止。将所述混合物用数份乙酸乙酯提取直到在水相中通过HPLC (方法3) 不能再检测到产物。将合并的有机相通过硫酸钠进行干燥并进行浓缩。在 残余物中获得759 mg (2.70 mmol, 98%的理论值)的标题化合物，其为无色 的油。
HPLC(方法3):R「3.89分钟.
LC画MS (方法8): Rt = 1.87分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 282.3 (40) [M+H]+.
NMR (400 MHz, d6-DMSO) 5 (ppm) = 1.27 (s, 9H， COC(C//3)3), 4.21 (m, 1H)， 5.09 (s, 1H), 6.30 (d, /= 9.8 Hz), 7.22-7.34 (m， 5H). 手性HPLC(方法7):e.e. 94.1%.
示例性化合物16A: iV-丁氧基羰基-(3"-3-羟基苯基丙氨酸甲酯将示例性化合物16A (331 mg， 1.11 mmol)溶解于二氯甲垸-甲醇(5+l， 12 ml)，并冷却到0。C,并将三甲代甲硅烷基重氮甲烷(在THF中2M, 1.66 ml, 3.32 mmol, 3当量)逐滴加入。将所述混合物在0°C再搅拌30分钟， 接着加入数滴TFA直到发生脱色。将所述溶剂蒸馏除去，残余物留下，获 得定量产率的标题化合物(345 mg，根据HPLC， 95%纯的)。其为微黄色的 油。
HPLC (方法3): Rt = 4.26分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2.11分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 296.3 (50) [M+H]+. ■H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 (ppm) = 1.27 (s， 9H， COC(C//3)3)， 3.60 (s, 3H, OC//3)， 4.31 (dd, J= 3.8， ■/= 9.3 Hz， IH)， 5.03 (d, 3.4 Hz， IH)， 5.68 (br s, IH)， 6.62 (d， /= 9.1 Hz, IH)， 7.23-7.34 (m, 5H).
示例性化合物HA: (3/0-3-羟基-苯基丙氨酸甲酯三氟乙酸盐
将示例性化合物16A (345 mg， 1.17 mmol)溶解于在二氯甲垸(10 ml) 中的30。/。TFA并在室温搅拌15分钟。接着，将所述溶剂蒸馏除去。在油 泵真空下将所述残余物干燥到恒重。产率401 mg (定量)黄色的油，在接 下来的步骤中不经过进一步纯化使用。 HPLC (方法3): Rt = 2.51分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 0.30分钟，MS (ESIpos): m/z (%)= 196.1 (20) [M+H]+.示例性化合物18A: [i^-(苄氧基羰基)-D-亮氨酰]-L-亮氨酸甲酯
在0°C，将A^-(苄氧基羰基)-D-亮氨酸(BACHEM目录号z13351.) (6.37 g, 24mmol)和L-亮氨酸甲酯(3.49 g， 24 mmol, 1 eq.)溶解于DMF (75ml)，接着加入NMM (5,28 ml, 48 mmol, 2叫)禾口 HATU (13.69g， 36 mmol, 1.5叫.)。将混合物在室温搅拌3小时。加入MTBE和饱和的碳 酸氢钠溶液，进行提取。再次用第二份MTBE来提取水相并接着将合并的 有机相用1M柠檬酸洗涤，并再次用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，通过硫酸 钠进行干燥，过滤和在真空中浓縮。将所述残余物以两份通过色谱法进行 纯化(Biotage 40M,环已烷/乙酸乙酯3+1)。合并包含产物的级分并冷冻 干燥。产率7.85 g (80%的理论值)的标题化合物。 HPLC (方法3): Rt = 4.82分钟.
LCMS (方法8): Rt = 2.65分钟；MS (ESIpos.): w/z (%) = 393 (100) [M+H]+. [a]20Na = -5.2。 (c = 0.52, MeOH),
'H NMR (400 MHz, ^j-DMSO) 5 (ppm) = 0.77—0.92 (m, 12H), 1,31-1.66 (m， 6H)， 3.60 (s, 3H), 4.10 (m, 1H), 4.28 (m, IH)， 5.02 (s, 2H)， 7.25-7.38 (m, 6H), 8.23 (d, 1H).
13C-NMR (126 MHz, ^-DMSO) S (ppm) = 21.1 (CH3)， 21.5 (CH3), 22.8 (CH3): 22.9 (CH3)， 24.2 (CH)， 41.0 (CH2), 50.0 (CH)， 51.8 (CH3, OCH3)， 52.9 (CH)， 65.3 (CH2， OCH2Ph), 127.6 (CH, ar-C), 127.7 (CH, ar-C), 128.3 (CH， ar-C), 137.1 (C quat， ar-C)， 155.8 (C quat， NCOC(CH3)3), 172,4 (C quat， OO)， 172.9 (Cquat, C=0).
示例性化合物19A: [A^-(苄氧基羰基)-D-亮氨酰]-L-亮氨酸将示例性化合物18A (7.70 g, 19.62 mmol)置于200 ml的THF/水(3+l) 中，冷却到0。C，加入一水合氢氧化锂(1.65g, 39.24mmo1, 2叫)。将所述 混合物在0°C搅拌直到根据HPLC监测(方法3)，反应已经进行结束(约 45分钟)。在真空中蒸馏出去大部分的THF，并将混合物通过加入柠檬酸 调节到pH4，将所述混合物用2份的乙酸乙酯提取。将合并的有机相通过 硫酸钠进行干燥，过滤并进行浓縮。获得作为无色无定形物质的产物，标 题化合物的产率为6.87 g (89%的理论值)。 HPLC(方法3):R,4.45分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2.39分钟，MS (ESIpos) m/z (%) = 379 (100) [M+H]+,
757 (40) [2M+H]+.20Na = +4.7° (c = 0.50, MeOH).
'H NMR (300 MHz， ^j-DMSO) S (ppm) = 0.77-0.92 (m， 12H)， 1.34-1.68 (m， 6H)， 4.04~4.26 (m, 2H), 5.02 (s, 2H), 7.25-7.38 (m， 6H), 8.12 (d, 1H), 12.50 (br. s， 1H).
HR-TOF-MS (方法14): C2QH31N205 [M+H]+计算值379.2228，实测值 379.2216.
示例性化合物20A: [A^(苄氧基羰基)-D-亮氨酰]-L-亮氨酰-(3"-3-羟基苯
基丙氨酸甲酯在0°C将示例性化合物19A (550 mg, 1.45 mmol)和示例性化合物17A (449 mg, 1.45 mmol， 1当量)溶解于DMF (12 ml)。接着加入4-甲基吗啉 (320 pi, 2.9 mmol， 2当量)和HATU (663 mg， 1.74 mmol， 1,2当量)，并将混 合物在0。C搅拌15分钟。随后再加入4-甲基吗啉(160 1.45 mmol， 1
当量)。并将混合物在室温搅拌16小时。接着，将所述混合物在乙酸乙酯 和浓缩的碳酸氢钠之间进行提取并将有机相用0.5M柠檬酸洗涤，并再次 用浓碳酸氢钠洗涤，通过硫酸钠进行干燥并进行浓缩。将所述残余物通过 色谱法进行纯化(方法17)。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率626 mg (1.13 mmol, 78%的理论值)的标题化合物 HPLC (方法3): Rt = 4.69分钟.
LC-MS (方法8): Rt = 2.58分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 556.5 (100) [M+H]+，
'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 (ppm) = 0.76-0.88 (m, 12H), 1.23-1.60 (m, 6H), 3.54 (s， 3H， OC//3)， 4.06-4.11 (m, 1H)， 4.43 (dd, /= 8.3， /= 14.9 Hz, 1H): 4.52 (dd, J= 4.1， /= 7.7 Hz, 1H)， 5.02-5.06 (m, 3H)， 5.87 (d， 《/= 4.5 Hz， 1H), 7.20-7.40 (m, 11H), 8.01 (d,8.7 Hz, 1H)， 8.08 (d,/=8.5Hz， 1H).
示例性化合物21A: [A^-(苄氧基)羰基-D-亮氨酰]-L-亮氨酰-(3/ )-3-羟基苯
基丙氨酸
将示例性化合物20A(650mg， 1.17 mmol)在氩气下溶解于THF-水(2+l， 30ml)中。在0。C，逐滴加入氢氧化锂水溶液(57mg， 2.40mmo1， 4当量， 在8.65 ml的水中)。在45分钟后反应己经进行结束(HPLC，方法1)。加 入冰醋酸，并浓縮混合物。将所述粗制产物通过色谱法纯化(方法16)。合 并包含产物的级分并冷冻干燥。产率618 mg (98%的理论值)的标题化合物。
HPLC (方法1): Rt = 2.44分钟.
LC-MS (方法13) Rt = 6.04; MS (ESIpos) m/z (%) = 542.5 (100) [M+H]+, 183.8 (80) [2M+H]+; MS (ESIneg) m/z (%) = 540.4 (40) [M-H]-; 1081.70 (100) [2M-H]-.
示例性化合物22A: 2-(三甲代甲硅烷基)乙基-A^-[苄氧基羰基-D-亮氨 酰]-L-亮氨酰-(3i )-3-羟基-L-苯基丙氨酸酯
将示例性化合物21A (150 mg, 277 pmol)和2-(三甲代甲硅垸基)乙醇 (790 ^d, 5.54 mmol， 20当量)和一些4 A分子筛溶解于无水二氯甲烷(3.0 ml)中，并在-30。C搅拌约1小时。接着加入DCC (114 mg， 553 mol， 2当量) 和DMAP(34mg,277 pmo1, 1当量)，并将所述混合物搅拌过夜，容许在此 过程中缓慢达到室温。接着，在真空中浓縮所述混合物并进行色谱分离(方 法16)。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率108mg(60。/。的理论值)的 标题化合物。
HPLC(方法l):Rt = 3.14分钟.
LC-MS (方法10): Rt = 2.97分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 642.3 (100) [M+H]+.
示例性化合物23A: A^[(苄氧基潔基]-D-亮氨酰-L-亮氨酰-(3外3-([A^-(叔 丁氧羰基)-C^(叔丁基)-L-丝氨酰]氧基卜L-苯基丙氨酸(alaninate)2-(三甲代 甲硅烷基)乙酯<formula>formula see original document page 57</formula>
将示例性化合物22A (104 mg, 162 pmol)和^-(叔丁氧羰基)-03-叔丁 基-L-丝氨酸(47mg, 178pmo1， 1.1当量)溶解于无水二氯甲垸(2.0 ml)并加 入一些4A分子筛。接着加入DCC(70mg，340mo1，2.1当量)和DMAP(23 mg， 194 |_imol, 1.2当量)，并将所述混合物搅拌过夜，容许在此过程中缓慢 达到室温。接着，在真空中浓縮所述混合物并进行色谱分离(方法16)。合 并包含产物的级分并冷冻干燥。产率120 mg (84%的理论值)的标题化合 物。
HPLC (方法1): Rt = 3.49分钟.
LC画MS (方法10): Rt = 3.38分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 885.6 (100) [M+H]+,
HR-TOF-MS (方法14): C46H73N40 Si计算值885.5040，实测值885.5031 [M+H]+.
示例性化合物24A: A^-[(苄氧基)羰基]-D-亮氨酰-L-亮氨酰-(3"-3-UO^(叔 丁萄-L-丝氨酰]氧基)-L-苯基丙氨酸2-(三甲代甲硅烷基)乙酯三氟乙酸盐将示例性化合物23A(117mg, 132lamol)溶解于二氯甲垸(3 ml)。加入 在二氯甲垸(20 ml)中的15。/。TFA， IO分钟后，将混合物浓縮到干燥。通 过色谱法纯化残余物(方法16)。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率: 100 mg (83%的理论值)。 HPLC (方法1): Rt = 2.40分钟.
LC-MS (方法10): Rt = 2.28分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 785.4 (100) [M+H]+.
示例性化合物25A: A^-[(苄氧基)羰基]-D誦亮氨酰-L-亮氨酰画(3i )-3誦UA^画(叔 丁氧羰基)甘氨酰-(3Q-3-羟基-L-天冬酰胺酰基-"-(叔丁基)丝氨酰]氧 基)-L-苯基丙氨酸2-(三甲代甲硅烷基)乙酯<formula>formula see original document page 59</formula>
将示例性化合物24A (96 mg, 107 pmol)和示例性化合物13A (33 mg, 107 pmol, 1当量)溶解于DMF(2.0 ml)并冷却到-30。C。加入HATU (122 mg, 320 pmol, 3当量)和4-甲基吗啉(86 mg, 854 pmol, 8当量)，接着容许所述 混合物缓慢加温到约4°C并在该温度静置12小时。对所述反应溶液进行 色谱分离(方法15)，合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率92 mg (89% 的理论值)的标题化合物。 HPLC (方法1): Rt = 3,22分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 3.21分钟，MS (ESIpos): m/z (%)= 1072,6 (100) [M+H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 1070.5 (100) [M-H]-.
HR-TOF-MS (方法14): C52H82N7015Si计算值 1072.5633,实测值 1072.5667 [M+H]+.
示例性化合物26A:A^[(苄氧基)羰基]-D-亮氨酰-L-亮氨酰-(3"-3-([甘氨酰 -(35>3-羟基丄-天冬酰胺酰基-^-(叔丁基)丝氨酰]氧基}丄-苯基丙氨酸 2-(三甲代甲硅烷基)乙酯三氟乙酸盐<formula>formula see original document page 60</formula>将示例性化合物25A (90 mg, 84 nmol)溶解于二氯甲烷(3.0 ml)。加入 在二氯甲烷(20ml)中的15% TFA，并且在10分钟后，将所述混合物浓縮 到干燥。通过色谱法纯化所述残余物(方法16)。合并包含产物的级分并冷 冻干燥。产率73 mg (80%的理论值)的标题化合物。 HPLC (方法1): Rt = 2.65分钟.
LC-MS (方法10): Rt = 2.13分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 972.6 (100) [M+H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 970,7 (100) [M隱H]-.
HR-TOF-MS (方法14): C47H74N70,3Si计算值972.5109,实测值972.5103 [M+H]+.
示例性化合物27A: A^-[(苄氧基)羰基]-D-亮氨酰-L-亮氨酰-(3/ )-3-([A^(叔 丁氧羰基H3i )-3-羟基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏 氨酰-甘氨酰-(3Q-3-羟基-L-天冬酰胺酰基-^-(叔丁基)丝氨酰]氧基卜L-苯 基丙氨酸2-(三甲代甲硅烷基)乙酯三氟乙酸盐<formula>formula see original document page 61</formula>将示例性化合物26A (10.0 mg, 9.2 iimol)和示例性化合物11A (8.2 mg， 107 iamol， 1当量)溶解于DMF(0.5 ml)并冷却到-30。C。加入HATU (10.5 mg， 27.6 iamol， 3当量)和4-甲基吗啉(7,5 mg, 74 ,1， 8当量)，并接着将所述 混合物缓慢加温到约4°C，将其在该温度静置12小时。对所述粗制反应溶 液进行色谱分离(方法15)，合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率10.7 mg (65%的理论值)的标题化合物。 HPLC(方法l):Rt = 2.99分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 2.40分钟，MS (ESIpos): m/z (%)= 1685.8 (50) [M+H]+; MS (ESIneg): m/z (%)= 1683.8 (50) [M-H]-， 1728,8 (100) [M+HCOOH]-.
HR-TOF-MS (方法14): C8QH134N15022Si计算值1684.9592，实测值 1684.9573 [M+H]+.示例性化合物28A: A^[(苄氧基)羰基]-D-亮氨酰-L-亮氨酰-(3iO-3-UA^-(叔 丁氧羰基)-(3i )-3-羟基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-别苏 氨酰-甘氨酰-(3。-3-羟基-L-天冬酰胺酰基-"-(叔丁基)丝氨酰]氧基)-L-苯
基丙氨酸三氟乙酸盐
<formula>formula see original document page 62</formula>
方法A:
将示例性化合物27A(10 mg, 5.6 pmol)溶解于无水THF (0.5 ml)。加入 TBAF(17.4 mg, 67 pmol, 12当量)，并将混合物在室温搅拌1小时。根据 HPLC分析(方法1)，反应完全，并用冰醋酸(6 W)终止反应，将所述混合 物浓縮并进行色谱分离(方法15)。合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率: 2.5 mg (约69%纯的，18%的理论值)的标题化合物。 方法B:
将化合物27A (25 mg, 13.9 nmol)溶解于无水THF (2.5 ml)。加入硫酸 钠(无水，200mg, 1.4mmol)并将混悬液搅拌30分钟。加入TBAF溶液(1M 在THF中的无水TBAF， 84 pl， 6当量)，并将混合物在室温搅拌45分钟。 根据HPLC分析(方法1)，反应结束。用冰醋酸(16nl)终止反应，并过滤混合物，浓缩并进行色谱分离(方法15)。产率21 mg (>95%纯的，89%的理
论值)的标题化合物。
HPLC (方法6): Rt = 2.99分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 2.34分钟，MS (ESIpos): m/z (%)= 1585.6 (20) [M+H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 1583.4 (100) [M-H]-.
HR-TOF-MS (方法 14): C75H121N15023计算值 1584.8884,实测值 1584.8843 [M+H]+.
示例性化合物29A: ^-[(苄氧基)羰基]-0-亮氨酰丄-亮氨酰-(3/ )-3-{
氧基}丄-苯基丙氨酸双三氟乙酸盐
o
使示例性化合物28A (2.5 mg, 1.5 pmol)与三异丙基硅垸(12.5 pl)和水 (2.8pl)反应，并加入0.5ml的TFA。接着，将所述混合物在室温搅拌1小 时，最终在真空中去除溶剂。将残余物进行色谱分离(方法15)。合并包含 产物的级分并冷冻干燥。产率:2 mg (82%的理论值)的标题化合物。HPLC (方法6): Rt = 2.00分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 1.60分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 714.9 (100) [M+2H]2+; MS (ESIneg) m/z (%) = 1427.7 (100) [M-H]-. HR-TOF-MS (方法14): C66H1Q6N1502Q计算值 1428.7734，实测值 1428.7700 [M+H]+.
示例性化合物30A: iV-苄氧基羰基-溶杆菌素三氟乙酸盐
o
NK
将示例性化合物29A (1,0 mg, 1.1 pmol)溶解于DMF (0.9 ml)并冷却 到-15。C。加入HATU (1.2 mg, 3.3 pmol, 3当量)和4-甲基吗啉(11 pi的在 0.9mlDMF中的100 ^的4-甲基吗啉溶液，8.7 pmol, 8当量)，接着使所 述混合物缓慢加温到约4°C并在室温搅拌3小时。将所述粗制反应溶液进 行色谱分离(方法15)，合并包含产物的级分并冷冻干燥。产率1.2 mg(73% 的理论值)的标题化合物。 HPLC(方法l):Rt = 2.17分钟.
LC-MS (方法9): Rt = 2.00分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 1410.8 (100)[M+H]+; MS (ESIneg) m/z (%) = 1408.7 (100) [M-H]-.
HR-TOF-MS (方法14): C66H1Q4N15019计算值 1410.7628，实测值 1410,7639 [M+H]+.
示例性化合物31A:溶杆菌素双三氟乙酸盐
将示例性化合物30A (1.0 mg, 0.66 pmol)溶解于二噁垸(0.5 ml),加入 0.75 ml的0.1% TFA水溶液和1刮刀尖的10% Pd/C，将所述混合物在大 气压下在室温氢化15分钟。过滤产物以除去催化剂，浓縮并通过色谱法 进行纯化(方法15)。产率0.6mg(61。/。的理论值)的标题化合物。 HPLC (方法4): Rt = 16.31分钟.通过与真正的溶杆菌素(通过在WO 2004/099239 (Al)中所述的方法获得)共注射证实合成的产物31A的本性。 HPLC (方法5) Rt = 38.10分钟.通过与真正的溶杆菌素(通过在WO 2004/099239 (Al)中所述的方法获得)共注射证实合成的产物31A的本性。 LC-MS (方法9): Rt = 1.40分钟，MS (ESIpos): m/z (%) = 638.9 (100) [M+2H]2+, 1276,8 (5) [M+H]+; MS (ESIneg): m/z (%) = 637.0 (100) [M-2H]2',1274.7 (40) [M-H]-,
HR-TOF-MS (方法14): C58H98N15017计算值1276.7260,实测值1276.7264 [M+H]+.
B.评估生理活性
本发明化合物的体外效果可以在下列测定中显示
最小抑制浓度(MIC)的测定
根据NCCLS指导在液体稀释测试中测定MIC。将金黄色葡萄球菌 (5V。/ /z>7。coccM:y awre—133， 粪肠球菌(五"^cococcwsy^eca嗣ICB27159禾口 肺炎链球菌(5^eptococcw p"ewmom'ae) G9a的过夜培养物与所述的测试物 质以1:2稀释系列进行温育。在Isosensitest培养基(Difco， Irvine/USA)中， 以10M敖生物/ml的细胞计数进行MIC测定，肺炎链球菌除外，其是在具 有10%牛血清的BHI肉汤(Difco， Irvine/USA)中，以1()6微生物/ml的细 胞计数进行的测试。将所述培养物在37°C温育18-24小时，肺炎链球菌 的温育在10%(:02存在下进行。
将MIC定义为不再发生可观察到的细菌生长的每种物质的最低浓度。 将MIC值以pg/ml报道。
在通过完全合成制备的溶杆菌素和发酵的溶杆菌素之间，在生理活性 方面没有出现明显的差异。
权利要求
1. 制备下式(I)的环状酯肽的方法其中R1是H或CH3，其中R2是氢，C3-C6-环烷基，C5-C6-环烯基，C3-C6环烷基甲基，5-到7-元杂环基甲基，甲基，乙基，正丙基，异丙基，1-甲基丙-1-基，2-甲基丙-1-基，2，2-二甲基丙-1-基，1，1-二甲基丙-1-基，1-乙基丙-1-基，1-乙基-1-甲基丙-1-基，正丁基，2-甲基丁-1-基，3-甲基丁-1-基，1-乙基丁-1-基，叔丁基，4-甲基戊-1-基，正已基，烯基或芳基，其中R2可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，三甲代甲硅烷基，烷基，烷氧基，苄氧基，C3-C6-环烷基，芳基，5-到10-元杂芳基，烷基氨基，芳基氨基，烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，烷基羰基，烷氧基羰基，芳基羰基和苄氧基羰基氨基，其中芳基和杂芳基又可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，硝基，烷基，烷氧基和苯基，其中R3是氢或C1-C4-烷基，或其中R2和R3与它们键合的碳原子一起形成C3-C6-环烷基环或5-到7-元杂环基环，其中所述环烷基环和所述杂环基环可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组三氟甲基，烷基，烷氧基和烷基羰基，其中R4是烷基，C3-C6-环烷基，5-到7-元杂环基，芳基，5-或6-元杂芳基，烷基羰基，烷氧基羰基，C3-C6-环烷基羰基，5-到7-元杂环基羰基，芳基羰基，5-或6-元杂芳基羰基或烷基氨基羰基，其中烷基，环烷基，杂环基，芳基，杂芳基，烷氧基羰基，环烷基羰基，杂环基羰基，芳基羰基，杂芳基羰基和烷基氨基羰基可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，烷基氨基和苯基，并且其中烷基羰基被氨基或烷基氨基取代基取代，并且其中烷基羰基可以被另外的0，1或2个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，三甲代甲硅烷基，烷氧基，烷硫基，苄氧基，C3-C6-环烷基，苯基，萘基，5-到10-元杂芳基，烷基羰基氨基，烷氧基羰基氨基，芳基羰基氨基，芳基羰基氧基，苄氧基羰基和苄氧基羰基氨基，其中苯基和杂芳基又可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，硝基，烷基，烷氧基和苯基，或在所述烷基羰基中的同一的碳原子上的两个取代基与它们键合的碳原子一起形成C3-C6-环烷基环或5-到7-元杂环基环，其中所述环烷基环和所述杂环基环可以被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组三氟甲基，烷基和烷氧基，或其中所述环烷基环可以是苯并-稠合的，其中R5是氢，C1-C4-烷基，环丙基或环丙基甲基，或其中R4和R5与它们所键合的氮原子一起形成5-到7-元杂环基环，其中所述杂环基环可以被0，1，2，或3个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自由下列组成的组卤素，羟基，氨基，氰基，烷基，烷氧基和烷基氨基，其中将下式(II)的化合物分子内环化，其中R1到R5如上定义，其中X是OH，活性酯，拟卤素或卤素，并且其中PG是H或适合的保护基，和随后将环状中间体去保护以形成式(I)的环状酯肽。
2.<image>image see original document page 5</image>
3. 根据权利要求2的方法，其特征在于 W是异丙基甲基，叔丁基甲基或3-吡啶基甲基，并且 W是异丙基甲基，叔丁基甲基或三甲代甲硅垸基甲基。
4. 根据权利要求3的方法，其特征在于仗6 = ^并且是异丙基甲基。
5. 根据权利要求l-4任一项的方法，其特征在于X是OH。
6. 根据权利要求l-5任一项的方法，其特征在于R'是CH3。
7. 根据权利要求1的方法，其特征在于通过下列步骤制备式(II)的化合物:将下式(III)的化合物与下式(IV)的化合物偶联: 其中R1到R5如权利要求1中所定义， 其中Y是OH,活性酯，拟卤素或卤素，并且 其中PG是H或适合的保护基，和当适合时，将中间体部分或完全去保护，以及当适合时将3-羟基苯基 丙氨酸的羧基转化为式-C(K))X的基团，其中X如权利要求1中所定义。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于所述式(in)的化合物是下式(IIIa)的化合物<formula>formula see original document page 7</formula>其中W和R7如权利要求2-4中所定义，并且其中PG是H或适合的保护基。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于通过下列步骤制备式(III)的化合物:<formula>formula see original document page 7</formula>将下式(V)的化合物与下式(VI)的化合物偶联，<formula>formula see original document page 7</formula>其中W到RS如权利要求1中所定义， 其中Z是OH,活性酯，拟卤素或卤素，且 其中PG是H或适合的保护基， 禾口，当适合时，将中间体部分或完全去保护。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述式(V)的化合物是下式(Va)的化合物<formula>formula see original document page 8</formula>其中W和W如权利要求2-4中所定义，并且 其中PG是H或适合的保护基。
11.下式(III)的化合物，
12.<formula>formula see original document page 8</formula>(IIIa)其中尺6和f如权利要求2-4中所定义，并且其中PG是H或适合的保护基。
13.根据权利要求12的化合物，其具有下式(IIIb):<formula>formula see original document page 9</formula>其中W到W如权利要求1中所定义， 其中Z是OH，活性酯，拟卤素或卤素，并且 其中PG是H或适合的保护基，以及当适合时，将中间体部分或完全去保护。
14.制备根据权利要求11的化合物的方法, 合物与式(VI)的化合物偶联，(nib)。所述方法包括将式(V)的化
15.下式(VI)的化合物，其中Z是OH,活性酯，拟卤素或卤素，并且其中PG是H或适合的保护基。
16.根据权利要求15的化合物，其具有下式(VIa):<formula>formula see original document page 10</formula>
17.制备根据权利要求15的化合物的方法，所述方法包括下列步骤:将下式(vn)的化合物与下式(vin)的化合物偶联，O—PGN一O0/n) u (VIII) 其中PG是H或适合的保护基，和当适合时，将中间体完全或部分去保护。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于所述式(VII)的化合物是下式(VIIa)的化合物 ，(Vila)
19.根据权利要求17或18的方法，其特征在于所述式(VIII)的化合物是 下式(VIIIa)的化合物<formula>formula see original document page 11</formula>(Villa)
全文摘要
通过分子内环化制备具有式(I)的环状酯肽的方法。
文档编号C07K7/64GK101421291SQ200780012932
公开日2009年4月29日 申请日期2007年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者弗朗茨·冯努斯鲍姆, 索尼亚·安劳夫, 约翰内斯·克贝林, 约阿希姆·泰尔塞, 迪特尔·黑比希 申请人:艾库里斯有限及两合公司