专利名称：一种大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法
技术领域：
本发明涉及从红茶提取物中大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法。
背景技术：
茶黄素(Theaflavins，TFs)是红茶中特有的一类多酚类聚合物，它们是在红茶的发酵过程中由一对合适的儿茶素氧化聚合而成的。茶黄素在红茶中的含量很低，大约占干重的2％左右，但是，它们对红茶的色泽和口感有很重要的影响。近年来的研究表明，茶黄素不仅对红茶的品质有着很大的影响，更重要的是它具有多种与人类健康密切相关的生物活性，如抗心血管疾病、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用等。目前在红茶中发现的茶黄素成分有十几种，其中主要的有以下四种茶黄素(TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯(TF-3-MG)、茶黄素-3’-单没食子酸酯(TF-3’-MG)和茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(TFDG)。其中茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-MG)和茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-MG)是两种同分异构体。其结构如式1所示。
Theaflavin R＝R′＝HTheaflavin-3-O-gallate R＝gallate，R′＝HTheaflavin-3′-O-gallate R′＝gallate，R＝HTheaflavin-3，3′-di-O-gallate R＝R′＝gallateA茶黄素(theaflavin，TF)B茶黄素-3-单没食子酸酯(theaflavin-3-O-monogallate，TF-3-MG)C茶黄素-3’-单没食子酸酯(theaflavin-3’-O-monogallate，TF-3’-MG)D茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(theaflavin-3，3’-O-digallate，TFDG)
对茶黄素单体成分的药理活性的深入研究对茶黄素的分离制备方法提出了更高的要求，其中优以TF-3-MG和TF-3’-MG的分离最为困难，目前还未见有特效的分离方法报道。文献报道的茶黄素的分离制备方法主要有两种，即SephadexLH-20凝胶柱层析法或高速逆流色谱法。就这两种方法而言，凝胶柱层析法制备量较大，但所需时间较长，溶剂消耗量大；而高速逆流色谱法分离效率较高，但制备量不及柱层析。目前文献中报道的这两种方法主要是用于小制备量分离(几百毫克上样量)。对于上述四种主要的茶黄素而言，总的来说，TF和TFDG比较容易与其它茶黄素成分分离，而两种TF-MG之间的分离一直以来具有很大的挑战性，单纯使用上述任何一种方法都只能实现其部分分离。在以大量制备分离为目的时，随着上样量的增大，两者的分离选择性更差，纯化难度更大。因此，高纯度茶黄素单体的大制备量分离一直以来具有较大困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种从茶黄素粗提物中分离制备了十克至几十克高纯度的茶黄素单体的方法，该方法制备量大，产物纯度高，时间短，溶剂消耗量少。
为达到上述目的，本发明采用的分离方法及步骤如下1、首先根据拟装填的柱床高度和直径，计算称取一定量的凝胶柱填料，用洗脱液进行溶胀。采用湿法装柱，装好的凝胶柱应均匀、无气泡。本方法中的凝胶填料优选Sephadex LH-20；洗脱液可以采用无水乙醇、50-95％乙醇水溶液或30-70％的丙酮水溶液。
2、取一定量的红茶粗提物，用洗脱液溶解后上样。根据上样后凝胶柱上的颜色段，分段收集。将所收集的的流分经HPLC检测后，将其中只含有TF的第一段F0以及只含有TFDG的最后一段Fn+1分别收集，浓缩干燥后再用凝胶柱层析和高速逆流色谱纯化。而含有TF-3-MG和TF-3‘-MG的中间色段根据其中TF-3-MG和TF-3‘-MG的相对含量的不同，分五个部分收集，分别为F1、F2、F3、F4、…Fn(按洗脱顺序先后排列)。重复上样多次，使F1、F2、F3、F4、…Fn得到富集，浓缩干燥。
其中，n的数量可根据实验需要作调整，n大时，分段更细，但后续工作量加大。
3、将由粗样分离所得的TF-3’-MG相对含量在50％以上的级分分别再上凝胶柱进行分离，将反复分离富集得到的TF-3’-MG相对含量在90％以上的级分用HSCCC进一步纯化，去除其中少量的TF-3-MG和其它杂质。
4、将由粗样分离所得的TF-3-MG相对含量在50％以上的级分与上述分离TF-3’-MG后的相似级分合并，再分别上凝胶柱进行分离，将反复分离富集得到TF-3-MG相对含量在90％以上的级分用HSCCC进一步纯化，去除其中的极性杂质。
5、将上述两步凝胶柱层析分离得到的主要含有TF-3’-MG的级分和主要含有TF-3-MG的级分分别进行HSCCC纯化以除去其中少量的杂质，达到精制的目的。本步骤优选由烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱分离；其中烷烃可以是正己烷、正庚烷、石油醚等，优选正己烷；脂肪酸酯可以是乙酸乙酯、乙酸甲酯等，优选乙酸乙酯；脂肪醇可以是甲醇或者乙醇。流动相优选下相。
6、将第一步分离得到的TF和TFDG两段级分分别用凝胶柱层析去掉一些杂质成分，分别得到C和D两个级分，然后再分别用HSCCC方法纯化得到纯度高的TF和TFDG。其中TFDG的纯化可采用步骤5中相同的溶剂体系和分离方式。而TF的纯化需要对溶剂体系配比进行调整并分别采用上相和下相为流动相的正相和反相两种分离方式才能将一些极性杂质最终去除。
7、对上述分离制备所得茶黄素单体经旋转蒸发浓缩、真空干燥、冷冻干燥后进行HPLC纯度分析和MS、1HNMR和13CNMR结构确认。
本发明的优点是茶黄素单体的分离制备量大(几十克)，纯度高。高效液相色谱分析表明，采用该方法分离制备的茶黄素单体纯度可达97％以上。
图1 为实施例1中茶黄素单体的分离制备流程2 为实施例1中茶黄素混和标样(A)和粗提物(B)的HPLC谱3 为实施例1中TF级分段(F0)、TFMG级分段(F1-F5)和TFDG级分段(F6)的HPLC分析谱4 为实施例2中富含TF-3’-MG的A1、A2和A3级分的HPLC分析谱5 为实施例2中富含TF-3’-MG的A1、A2和A3级分的HSCCC分离谱6 为实施例2中经HSCCC纯化所得TF-3’-MG的HPLC纯度分析7 为实施例3中富含TF-3-MG的B1、B2级分的HPLC分析谱8 为实施例3中富含TF-3-MG的B2级分的HSCCC分离谱图及所得TF-3-MG的HPLC纯度分析9为实施例4中从TFDG级分段(F6)得到的D级分的HSCCC分离谱图(a)及分离所得TFDG的HPLC纯度分析谱图(b)图10为实施例4中从TF级分段(F0)得到的C级分的HPLC谱图(a)、HSCCC纯化谱图(b，c)及所得TF的HPLC纯度分析图(d)图11分离所得四种茶黄素单体的的鉴定结构具体实施方式
实施例1茶黄素粗提物的第一步柱层析分离(参看图1的流程图)取红茶粗提物40g，用70ml洗脱液溶解后上凝胶色谱柱1(Sephadex LH-20，900g，100×10cm i.d.)进行分离。无水乙醇为洗脱液，平均流速为18ml/min。根据上样后凝胶柱上的颜色段，分段收集。经HPLC检测后，将所收集的流分合并为三段7个级分，分别为主要含有TF的F0，含TF-3-MG和TF-3’-MG的F1、F2、F3、F4、F5(按洗脱顺序先后排列)，和主要含有TFDG的F6级分。图2中给出了Sigma混和标样和茶黄素粗提物在两个波长下的HPLC分析谱图。分析条件色谱柱Waters Xterra RP-C18柱(5μm，150×4.6mm i.d.)；流动相∶乙腈-水(28∶72)(在乙腈和水中分别添加2％的乙酸)；流速1mL/min；检测波长280nm，374nm。通过对比保留时间和各峰的UV光谱图，确定了粗提物中的茶黄素的目标组分，可以看出粗提物中除主要的四种茶黄素成分外，还有大量的杂质与其共存。经凝胶柱1层析分离后得到的三段7个级分的HPLC分析谱图如图3所示。通过比较可以看出，经过一步柱层析，粗提物中TF和TFDG段基本上可以和第二段中的TFMG完全分离，只是其中仍含有其它杂质，需要进一步纯化。而第二段中的TF-3-MG和TF-3’-MG只能实现部分分离，还需要通过进一步的柱层析分离。处理红茶粗提物480克，共得到F0(70克)，F1(7.5克)，F2(29.17克)，F3(32.72克)，F4(21.32克)，F5(10.33克)和F6(80克)。
实施例2TF-3’-MG级分的进一步分离和纯化将由粗样分离所得的TF-3’-MG相对含量在50％以上的F2，和F3级分分别再上凝胶柱进行二次分离，所采用的柱层析条件与实施例1相同。所得级分中TF-3’-MG含量在50％-90％级分分别进行第三次柱层析分离，此次分离中改用35％-丙酮水溶液洗脱，此时TF-3-MG和TF-3’-MG洗脱顺序与乙醇的洗脱顺序相反，TF-3-MG在先，TF-3’-MG在后，这样可以从拖尾部分得到更多纯度较高的TF-3’-MG。将反复柱层析分离富集得到的TF-3’-MG相对含量在90％以上的三个级分A1(7.83g)，A2(7.89g)和A3(6.93g)(其中已将FL级分与类似级分合并)分别用HSCCC进一步纯化，去除其中少量的TF-3-MG和其它杂质。
A1、A2和A3三个级分的HPLC分析如图4所示，可以看出，其中A1中主要含有TF-3’-MG(90％)及少量的TF-3-MG(10％)，此外还含有大量的7.4min的杂质；A2的成分与A1基本相同，只是7.4min的杂质的含量有所降低；A3中7.4min的杂质的含量进一步降低。
图5给出了用HSCCC分别对A1、A2和A3三个级分进行纯化的分离谱图。所采用的分离条件为溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，v/v/v/v)，上相为固定相，下相为流动相。可以看出，经过HSCCC分离，少量的TF-3’-MG、7.4min的杂质以及一些少量的其它杂质都可以同时去除，且HSCCC的上样量达到了克量级，这已基本达到目前HSCCC仪器(柱容量220mL，内径1.6mm)的制备量上限。从图6的HPLC谱图可以看出，经精制所得TF-3’-MG在不同检测波长下(280nm和374nm)的HPLC纯度(以HPLC峰面积计算)均已达到97％以上。共得到高纯度TF-3’-MG近10克。
实施例3TF-3-MG级分的进一步分离和纯化将由粗样分离所得的TF-3-MG相对含量在50％以上的F4和F5与上述分离TF-3’-MG后的相似级分合并，再分别上凝胶柱进行二次分离，所得级分中TF-3-MG相对含量在50％-90％的级分，分别进行第三次柱层析分离，所采用的柱层析条件同实施例1。将反复分离富集得到TF-3-MG相对含量在90％以上的级B1(0.52g)，B2(17.27g)分别用HSCCC进一步纯化，去除其中的极性杂质。
经HPLC分析(如图7所示)可以看出，其中B1含有大约90％的TF-3-MG和10％的TF-3’-MG；而B2则主要含有TF-3-MG，TF-3’-MG含量很低，但是在每一个级分中都含有大量的极性杂质。图8上给出了B2级分的HSCCC分离谱图，所采用的分离条件为同实施例2。HPLC分析(图8下)显示，经过HSCCC分离，极性的杂质可以完全去除，且HSCCC的上样量也达到了克量级。经精制所得TF-3-MG在不同检测波长(280nm和374nm)下的HPLC纯度(以HPLC峰面积计算)也已达到了97％以上。共得到高纯度TF-3-MG近10克。
实施例4TF和TFDG的HSCCC纯化茶黄素粗提物经过一步柱层析分离得到的第一段级分F0和第三段级分F6中分别主要含有TF和TFDG，它们与其它的茶黄素成分基本实现了完全分离，但其中仍含有其它杂质(如图3的F0和F6的HPLC分析结果所示)。对它们的进一步纯化可以采用柱层析的方法，但是柱层析所得级分中往往仍会残留少量极性杂质，因此，需采用了HSCCC进一步纯化。
取8克F6级分，上凝胶色谱柱2(Sephadex LH-20，400g，70×5cm i.d.)，以无水乙醇为洗脱液，进行分离。得到含TFDG的级分D(约5克)，采用HSCCC对其进一步纯化。图9给出了D级分的HSCCC纯化谱图和最终所得TFDG的HPLC分析谱图。所采用的分离条件为溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，v/v/v/v)，上相为固定相，下相为流动相，上样量为1克。TFDG在不同检测波长(280nm和374nm)下的HPLC纯度(以HPLC峰面积计算)也达到了98％以上。从8克F6级分中共得到高纯度TFDG约2克。
8克F0经同样的二次柱层析后得到的C级分(约5克)，HPLC分析(图10a)显示其中含有保留时间在2.3min和2.5min的两个极性杂质很难去除。在HSCCC纯化中首先采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶2∶5，v/v/v/v)，下相为固定相，上相为流动相，上样量为0.9克，进行第一步纯化(如图10b所示)，然后再采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶7∶1∶7，v/v/v/v)，上相为固定相，下相为流动相，上样量为0.7克进行二次HSCCC纯化(如图10c所示)。这样通过正相和反相两种HSCCC分离方式的结合，最终将两个极性杂质去除，得到高纯度的TF(如图10d所示)，在不同检测波长(280nm和374nm)下的HPLC纯度(以HPLC峰面积计算)也达到了98％以上。从8克F0级分中共得到高纯度TF约1克。
实施例5分离纯化所得TF、TF-3-MG、TF-3’-MG和TFDG的核磁共振氢谱(1HNMR)和碳谱(13CNMR)分析对分离所得的四种茶黄素单体进行了核磁共振氢谱(1HNMR)和碳谱(13CNMR)分析，采用氘代丙酮(CD3OCD3)为氘代试剂，结果表明与文献报道的数据基本吻合(如表1至表4所列)。其中C和H所对应的位置如图11所示。
表1 TF-3’-MG和TF-3-MG的13CNMR数据(CD3OCD3，600MHz)
*Davis，A.L.，Cai，Y.，Davies，A.P.(1995).Magn.Reson.Chem.，33，549-552.
表2 TF-3’-MG和TF-3-MG的1HNMR数据(CD3OCD3，600MHz)
*Davis，A.L.，Cai，Y.，Davies，A.P.(1995).Magn.Reson.Chem.，33，549-552.
表3 TF和TFDG的13CNMR数据
(CD3COCD3，600MHz)
*Davis，A.L.，Cai，Y.，Davies，A.P.(1995).Magn.Reson.Chem.，33，549-552.
表4 TF和TFDG的1HNMR数据(CD3COCD3，600MHz)
*Davis，A.L.，Cai，Y.，Davies，A.P.(1995).Magn.Reson.Chem.，33，549-552.
权利要求
1.一种大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)、用洗脱液将红茶粗提物溶解后上凝胶柱柱层析，根据上样后凝胶柱上的颜色段，分段收集，将其中只含有TF的第一段F0以及只含有TFDG的最后一段Fn+1分别收集，浓缩干燥后再用凝胶柱层析和高速逆流色谱纯化；而含有TF-3-MG和TF-3‘-MG的中间色段根据其中TF-3-MG和TF-3‘-MG的相对含量的不同，分多个级分收集，分别为F1、F2、F3、F4、…Fn，重复上样多次，使F1、F2、F3、F4、…Fn，得到富集，浓缩干燥；(2)、将由粗样分离所得的TF-3’-MG相对含量在50％以上的级分分别再上凝胶柱进行分离，将反复分离富集得到的TF-3’-MG相对含量在90％以上的级分用高速逆流色谱分离进一步纯化，去除其中少量的TF-3-MG和其它杂质；(3)、由粗样分离所得的TF-3-MG相对含量在50％以上的级分与上述分离TF-3’-MG后的相似级分合并，再分别上凝胶柱进行分离，将反复分离富集得到TF-3-MG相对含量在90％以上的级分用高速逆流色谱分离进一步纯化，去除其中的极性杂质。
2.根据权利要求1所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于所述的凝胶填料Sephadex LH-20，所述的洗脱液为无水乙醇、50-95％乙醇水溶液或30-70％的丙酮水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于所述的TF-3’-MG和TF-3-MG相对含量在90％以上的级分的高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成的溶剂体系。
4.根据权利要求3所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚；脂肪酸酯是乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇是甲醇或乙醇；其配比为1∶5∶1∶5到1∶10∶1∶10范围内。
5.根据权利要求4所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于优选下相为流动相的反相洗脱方式。
6.根据权利要求1或2所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于其中，TF的高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成的溶剂体系。
7.根据权利要求6所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚；脂肪酸酯是乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为2∶5∶2∶5到1∶10∶1∶10范围内；采用上相和下相为流动相的正相和反相两种分离方式去除极性杂质。
8.根据权利要求1或2所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于其中，TFDG高速逆流色谱分离的溶剂体系为烷烃-脂肪酸酯-脂肪醇-水组成的溶及剂体系。
9.根据权利要求8所述的大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法，其特征在于其中烷烃是正己烷、正庚烷或石油醚；脂肪酸酯是乙酸乙酯或乙酸甲酯，脂肪醇是甲醇或乙醇，其配比为1∶5∶1∶5到1∶10∶1∶10范围内；优选下相为流动相反相两种分离方式去除极性杂质。
全文摘要
本发明公开了一种从红茶提取物中大批量分离制备四种高纯度茶黄素单体的方法。采用了凝胶柱层析和高速逆流色谱相结合的方法，将凝胶色谱柱层析制备量大的特点和高速逆流色谱分离效率高的特点结合起来，二者优势互补，实现了红茶提取物中四种主要的茶黄素单体茶黄素(TF)、茶黄素－3－没食子酸酯(TF－3－MG)、茶黄素－3′－没食子酸酯(TF－3′－MG)、茶黄素－3，3′－双没食子酸酯(TFDG)高纯度分离制备。该方法可用于从茶黄素粗提物中分离制备十克至几十克高纯度的茶黄素单体，单体纯度可达97％以上。该方法具有制备量大，产物纯度高，时间短，溶剂消耗量少等特点。
文档编号C07D311/74GK101081844SQ200610083828
公开日2007年12月5日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者曹学丽, 董银卯, 黄丹凤, 李攀, 李挺 申请人:北京工商大学