专利名称：一株产紫杉醇的腐生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法
一株产紫杉醇的腐生真ma^m该菌株^紫杉醇的左法
技术领域：
本发明属于生物工程和生物制药技术领域。具,及一株能产紫杉醇的腐生真 菌拟盘多毛孢，以皿用该菌株发酵^紫杉醇的方法。
背景抜术紫杉IKpaditaxel,商品名Taxol)是一种,的天然的抗癌药物，属于二砲生物 碱，其基本结构由浆果據素HI (baccatinffl)和连接其13位祉一苯丙氨酸衍生物构成。
Xik^紫杉醇的早期策略，a用从^:杉树木原料中直接提取的方法，由于紫杉醇含量
极低，只有树木干重的0.0001-0.008%，加之紫杉醇7X溶解'瞎，平均产M^勺0.015%,妒l公斤 紫杉醇， 一般需要7000公斤、相当于200O2500棵红豆杉树木的原料。以1992年为例， Bristol-Myers-Squibb(BMS)公司为临J^^提供了 16公斤的紫杉醇，消耗了 120万公斤的^m杉。 有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6棵树龄60-100年的^m杉树。随着该药品应用范围的扩大， 所需&M杉数量将十分可观，这也给&S杉资源带来严SI^办，可倉隨成生态环境的严重破坏。
化^^^合成紫杉醇，己于1994，实验，取得了成功。但是，紫杉醇手性基团较多，合 成路线复杂，成本高、产率低，至今无法应用于IDlk妒。游来，国内外学糊行了大量瓶 杉愈伤组织培养和细脱悬浮i^&p5开究，培养的^杉细Mm已超过10个，其中大部分已证实能产
錢杉醇，但是离体培养妒紫杉醇实mx业化妒的关键问顧隹以突破，例如培养物生物量
小，紫杉醇产^^低，妒周期长，并腿需要條细胞生长与^t寺性的稳定磐。
Christen首次利用植物细脱悬浮i歸技术妒紫杉醇后，研究吸引了众多的实^ 微，筋 面的研究也取得了一定的进展。例如ESC Agenetics公司在1992年NCI主持的第二次紫杉II5开 讨会±^布他们用细胞^#&所得产物紫杉醇賴为树皮中含量的2-5倍。中国的甘烦远等发现 云南会lM杉细胞在发酵罐中生长Si5ij12 g/L，紫杉醇含量为0.119%，约为成年WM皮中含量的 12倍，为mt剖直株的40倍。但是这项技术同蹄在一些问题，如i歸细胞的褐化问题，虽有该技 术iSA生物反应器放大阶段的i爐，《妹见实际鹏的J随，失SI月内成功鹏的可能性较小。
国际制药公司当ltf^普3i^用的^fe^:则是生化半合成法。对东北^EM杉(r,o^^te) 紫杉醇 的針生物学研究表明，紫杉醇合成诚可分为三个主要的生物合成阶段1)紫杉烷
环baccatinm母核中间体的合成，2) C-13位侧链中间体的合成，3)紫杉烷环和侧链的酰化反应， 形成識的紫杉醇好。Baccatinffl和C-13位侧链中间術蚊合成，可以稳定存在，而_§^溶性较 好。依据这Ht点，利用生物麟将瓶杉原料进行处理，^baccatinm和C-13位侧链中间^f导到 一定禾號的富集，然后提取鹏较易溶解的前体，最后利用酶法或化学法将^^前体合戯品紫 杉醇。半合鹏虽然提高了紫杉醇产量，但与直觀取紫杉醇的办法并无本质上区别，4鹏需要 消耗大S&S杉树木，为ltteMS公司开辟了3000万株iES杉种植场。
由于紫杉醇的市场供应数IJ于原料来源和制紐术两方面的制约，使得药价昂贵。为此，制
药界和学术界一直在寻找新的更好的原料及方法，来代替现有的^技术，以提高紫杉醇的产量、 满足临床需求。过去十余年中取得的最有意义的进展，是发现了与tS杉^^子木勒直物共生的 一些真菌产生紫杉醇，并且其化学结构和生物活性与瓶杉所产紫杉醇完全相同。
1993年，Stierie等从太平洋红豆杉的韧皮部分离到l株内共生真菌-安德烈紫杉菌(rora/nyce 似n^o^e),经培养，采用质谱、色if(TLC/HPLC)和方Mt性化^fei己等方法，发现该菌的发, 中存在紫杉醇，尽管产量较低，每升发^S含紫杉醇2冬50 ng。同时还证实，这些真菌产生的紫杉
醇与^m杉中紫杉醇结构和i4M完全一样。随后，许多人分离到不同的产紫杉醇的内共生真菌。
我国境内也发现了多种产紫杉醇的内共生真菌。据统计，国内外己报道的产生紫杉醇真菌种类已 超3iH十种，这些真菌绝大多数是子囊菌或半知菌，而且都是内共生真菌。由于目前这些真菌发 酵^中紫杉醇的含量很低，不會继到xika酵^的7ic平，因iih^不能满足市场的需求。
综J^脱，现有紫杉醇生产技术雜的主要问题是(1)采用从^杉树木原料中直觀取 的方法，由于紫杉醇^M极低，红豆杉的大量砍ttit成了生态环境的严重破坏。(2)化学fe^合
成紫杉醇，因为紫杉醇手性基团较多、合成路线鋭、成本高、产率低，至賴法应用于:oik生
产。(3)生化半合成紫杉醇，虽然提高了紫杉醇产量，但与直SJI取紫杉醇的方法并无本质上的
区别，燃需要消耗大量tm杉树木。(4)植物细胞悬浮培养技术妒紫杉醇，培糊生物量小， 紫杉醇产 低，生产周期长，培养细胞易发生褐化，并皿需要 细 长与生产特性的稳
定。(5)利用内共生真菌发酵生产紫杉醇，发酵产物中紫杉醇的含量很低，不倉继到工业发酵生
产的水平，因ith^不能满足市场的需求。
基于紫杉醇^与需彩见状，世界市场急需fM:化^紫杉醇的新方法。
发明内容l本发明的目的是克服现有技术存在的Ji^不足，劍共一株f,产紫杉醇的新菌 株，以及利用 株^紫杉醇的方法。
本发明ii^的能产紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌拟盘多m/^to/o/io;^ w/cm^ora NK-17
(菌种皿号CGMCC2694)。本发明菌株为国内外首次发5见。因此用该种菌株发酵的方法生产紫 杉醇魏有顿前景的途粒一。
本发明纟Si多年大量的深入研究，发现并培养了一种腐生真菌，该，产生紫杉醇，同时本 发明A^ii大量的实验，研究出禾俩该菌种来发酵^紫杉醇的方法。
该菌紫杉醇产量较高，发酵^#容易控制，培养周期短，是一株:oiW七发酵妒紫杉醇的优势菌。
本发明Mil从自然界分离微生物的方法，分离得到这种微生物。对这种1^fe物进份咅养，制
备发酵粗跳舰薄层层析(TLC)，高效液相色if(HPLC》舰糊质i糊斤(LC-MS)和核磁共 振(NMR)等方法对发酵7^tl进行了分析和鉴定。禾拥形态学和肝生物学前树这种微生物进 行了种属鉴定，将其鉴定为拟盘多毛孢属，命名为NK-17。
本发明，了从自然界分离得到这种微生物的方法。
本发明禾,膝学和好生物学方法对这禾f微生物进行了种属鉴定。
本发明,了这,微生物的i咅养方法和发酵粗Jltl的制备方法。
本发明,了对这种微生物发酵产物进行分析和鉴定的方法，证明这种微生物l滩产生紫杉醇。
下面以实施例说明本发明中这种微生物的分离方法、种属鉴定方法、培养方法、发酵粗, 的制备方法和发酵产物分析及鉴定方f縛内容。 本发明的优点和积极鄉
本发明，了一株能够产紫杉醇的腐生真菌NK-17。
本发明 的微生物是国内夕卜发现的第一株产紫杉醇的腐生真菌，属拟盘多毛 &M，与己知 的产紫杉醇内共生真菌相比，具有新颖性和实用性。这种微生物发酵周期短，产量高。己知的产 紫杉醇内共生真菌发酵周期长， 一般是2—3周，紫杉醇产量低，发酵工烈隹于掌握。逸就意M， 用本发明的菌株有可能实现紫杉醇的大规^^酵^。
与其它紫杉醇^方法相比，如从^m杉树木原料中直,取的方法，化学、 M合成和生化
半合成紫杉醇的方法，植物细胞悬浮培养技术^紫杉醇的方法，本发明,的微生物可以iM
发齢咅养直接^紫杉醇，其生产成本低，不会对生态资源造成破坏，发酵工艺易于掌握，后续
的分离纯化步骤简单，产率高，因此在这几点上tPW鲜明的可比性。
图1是本发明,的菌株NK-17的分，子形态；
图2是高^t液相色if(HPLC)分析方法纯化和鉴定NK-17发酵产物中所含紫杉醇，图2-l、紫
杉醇标准品(12.847min)，图2-2、待测样品(12.840min);
图3是液-质TO(LC-MS)分析方法鉴定NK-17发酵^J中所含紫杉醇； 图4是核磁共振(NMR)分析力法鉴定NK-17发酵产物中所含紫杉醇，图4-1、紫杉0t示准品，
图4-2、待测样品。
本发明衝共的能产紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌拟盘多，，已于2008年10月8日^ 于中国普通m:物菌种皿管理中心，^fli也址北京市朝阳区大，甲3号中国科学院微生物 研究所，菌种保藏号CGMCC2694，分类命名尸esto/加b/wiy冊'cms/wraNK17 。
具体实M^:
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发
明的范围。下列实施例中未注明具体斜牛的实验方法，通，照常规斜牛如Sambrook等A0f著的 "分子克隆实验室手册"(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中戶脱条
件，或按照制造r^所建议的劍牛。
实施例l、本发明,的微生物菌株NK-17的分离方法
将来源于我国南部某城市处的废布条剪成lxlcm小块；将该样品駄#|只百分数为75%的乙醇 中浸船射中进行杀菌消毒；用无菌7乂洗净后接种于 0八平板(每船-4±央样品)，28t:培养34天后 观察；待初步长出離时，选择长势微的麟接种于PDA^面培养，纯化，保存。PDA培养基 配方(/L):马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g(固体培养基中添加)。
实施例2、本发明^f共的微生物菌^NK-17的种属鉴定
(1) 形态学施鉴定
舰-17菌鹏养30赵右，待離长出分生孢子后，进行镜检。舰離形态以及分生孢子 的电子显微镜照片(实验结果见图l)表明，这幹微生物与拟盘多^ 包属(尸esto/油'o;^)形态学上 极为相似。
(2) 肝生物学方法鉴定
fflii设计引^UK4F (5'"Cyggttgatcctgccrg-3，)禾PUREV (5'-gytaccttgttacgactt-3，)，我们4顿PCR 方法对该微生物的18SrDNAiS行扩增，得到了一错1631 bp的片段。ffiiii!l序后与Genbank中序列 进行t浏，发现与尸^tofoto戸is w/cray/wra 18S rDNA的相似'(4^5(J 了99% (序列结果见序列表)。
根据鄉例2的结果，我们将这种微生物鉴定为尸e加/加'o;^属，命名为NK-17。
实施例3、本发明麟的微生舰-17的培养方法
培养基的帝U备按^M例1中所涉及的方^a行配制。在固体培养过程中，培^J变为28'C， 如需得到分 子，需3il對咅养30赃右；在液体i咅养过程中，培imS为28。C,織200ipm， 如需大量得到紫杉醇，培养时间需超lj 15 ^￡右，由于^紫杉鹏pH4^8之间是稳定的，因此 需要在发酵过程中监测pH,使其处T^范围之内。
实施例4、本发明^i共的微生物NK-17发酵产,处a31程
将发酵产物进行抽滤，使得菌丝同发,分离棘；4細滤后所得菌丝冷冻千燥，液氮研磨 破碎细lfct后《顿甲驗提l-2天；将浸出液与之前的发^g混合后再 :fci4行抽滤，除去沉淀物，
并调节p瞎7.0;娜旋转蒸发器对上步所得搶液繊后得到粗,物，进行下一步分析和鉴定。
实施例5、本发明iii共的微生tlNK-17发酵产物中所含紫杉醇的分析和鉴定 )^NK-17的发酵/^用下述方法进行分析和鉴定
(1) 薄层层析(TLC)
《顿二氯甲烷乙酸乙酉&=6: l的展层体系，对NK-17发酵粗提产物进行展开，在GF254赚 fchfflii紫外光照射會辦显现出明显的暗点，fflJl与紫杉醇标准品进行t饼，发现两者有相同的 Rf值，证明两者为同1质。
(2) 高效液相色1f(HPLC)
选择分析型C-18 ODS色谱柱(4.6x250 mm^ Kromasil)，色谱条件检测波长227nm, 流速 lmL/min，杜鹏室温，流动相为甲醇水=7: 3。舰实验表明，发酵7^中含有与紫杉0fe准 品保留时间相同的物质(实验结果见图2) 。 (1.紫杉醇标准品，12.847min; 2. NK17发酵产物, 12.840min.)。根据出峰面积，可以计算出发酵产物中紫杉醇的含量。
(3) 质it(LC-MS)
^M例中使用了少S^lHPLC纯化后的样品进行了液-质TO检测。实验结果表明，样品中的 主要成分肝量[M+Na，876，由此可以得出同=853，与紫杉l^示准品的好量相同，可以说明 两者为同1质(实验结果见图3)。
(4) 核磁赚(NMR)
实施例中f顿了大MM3iHPLC纯化后的样品进行了核磁^S检测。舰实验表明，待测样品 同紫杉麟示准品具有相同的响应信号，从^^结构上证实两者为同1质(实验结果见图4)。
序列表
<110〉南开大学
<120〉一株;^^醇的腐生真菌^ffl滅株妒驟醇的施 <勝1 <，1 〈211〉 1631 〈212〉腿
〈213〉 ^多^& (尸e对afoft'cp^附^ras; oraNK17)
<220>
〈221〉 gene
〈222〉 (1)…(1631)
<柳〉1
tgtctaagta taagcaatta tacagcgaaa ctgcgaatgg ttatttgats gtaccttact acttggstaa ccgtggtaat aasaccccga ctcacgaagg ggtgt3ttta ttsgattass ctttggtgat tcataataac ttttcgaatc gcatggcctt aaatttctgc cctatcaact ttcgatggca gggtcttggc aacggagggt tagggctcga ccccggagaa ggagcctgag gaaggcsgcs ggcgcgcaaa ttscccsstc ccgattcggg tgatacaggg ctcttttggg tcttgtsstt ggaatgagts ggaacaattg gagggcaagt ctggtgccsg cagccgcggt atattaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgsscc cgcctcaccg cgtgcactgg ttcggccggg cctttccctc actgatcgtg atggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa cctatgctcg aatacattag catggaataa taaaatagga gtttctagga ccgccgtaat gattaatagg gscagtcggg agaggtgasa ttcttggatt tattgaagsc taactactgc ttttcattsa tcaggaacga aagttagggg atcgaagscg taaccataaa ctatgccgac tagggatcgg acggtgttac ttacgagaaa tcaaagtctt tgggttctgg ggggagtatg agaaattgsc ggaagggcac caccaggggt ggagcctgcg gggaaactca ccaggtccag acacaatgag gattgacaga ttgtgggtgg tggtgcatgg ccgttctt3g ttggtggagt ataacgaacg sgaccttaac ctgctaaata gcccctattg cttagaggga ctatccgctc aagcggatgg aagtttgagg ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgtta cactgacgga c￡tga_ga_tgtc cgggtssgsg caittgcastt attgctcttc cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc cctgcccttt ctaccgattg aatggctcag tgaggcttcc ggactggccc cccagggccg g
CtC3tt333tcsgttatcgt60
tctagagctsatacstgct3120
asccsstgcccttcggggct180
gcgccggcg3tggttcattc240
ctgccatggttacaacgggt300
333cggct3c360
gaggtagtga420
cccttaacga480
ccwtsgcgt540
ttgggcctggctggccggtc600
tgggg33cctcatggtcttc66〇
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cgtgtggttctattttgttg780
ggcstcagt3ttcsattgtc840
gasagcatttgccaaggatg900
atcagataccgtcgtagtct960
ttattgscccgttcggcscc1020
gtcgcsaggc1080
gcttaatttgactcaacacg1140
ttg3g3gctctttcttgatt1200
gatttgtctgcttaattgcg1260
ctttggcagtaggctggctt1320
caataacaggtctgtgatgc1380
gccsgcgsgtacctccttga1440
ccctsgtsag1500
gtacacsccgcccgtcgcta1560
agggaggtcggcaacgacca1620 163权利要求
1、一株产紫杉醇的腐生真菌，其分类命名为拟盘多毛孢属Pestalotiopsis microsporaNK17，菌种保藏号CGMCC2694。
2、 根据权利要求1戶腐的腐生真菌，其特征是该菌株的18SrDNA片段长1631bp，期亥苷酸 序列如序列舒标。
3、 根据权利要求1所述的腐生真菌，其特征是该菌株能够用来生产抗肿瘤药物一紫杉醇 paclitaxel 。
4、 一种《顿权利要求1戶腿的腐生真菌^紫杉醇的方法，其特征在于在培养基中i歸权 禾腰求1戶/i^生真菌以^S^M菌糊胞内和戶腿i歸基中产生和聚集紫杉醇，以^/A0M细 胞内和培养基中回收^m紫杉醇。
5、 根据权利要求4戶诚的方法，其特征在于戶腿培养基为PDA培养基，其鹏为g/L:马铃 薯180-220 g，蓆糖20g，自然pH，固淋卜加20g琼月謝。
6、 根据权利要求4戶皿的方法，^#征在于戶皿的培养是在需氧剝牛下进行，，为25-30 。C，发酵初始PH働PDA培养基自然PH。
7、 根据权利要求4戶腿的方法，辦征在于戶腿菌株在500mL-lL三角瓶中发^i咅养，接种 方錄用块状菌丝的接种方式。
8、 根据权利要求4至7戶腿的方法，其特征在于戶腿回收 ^紫杉醇的步骤包括(1) 厕寻培养液分离出发酵菌体和发酵上清瓶(2) 将菌体冷冻千燥，液氮研磨，用甲隨提；将浸出液与发酵上清液混合后进行抽滤，除 去沉淀物；舰旋转蒸发器对所得滄液繊得到粗Ji^m(3) 将第(2)步所得粗提，用色谱纯化的方法纯化，得产物紫杉醇。
9、 根据权利要求8臓的方法，赚征在于，在第(2)步用饱和Na2C。3溶液调节所得搶液 的PHft^j 6.0-8.0。
10、 根据权利要求8或9戶服的方法，期寺征在于第(3)步戶腐色谱纯化方法中，亍顿一 个或一个以上的色谱柱，i真料为C18，流动相为甲醇/H20。.
全文摘要
一株能产紫杉醇的腐生真菌拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora NK17(菌种保藏号CGMCC2694)，属于生物工程技术领域。本发明的菌株是第一次在拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)中发现的能通过发酵法生产紫杉醇的腐生真菌，其产物为现今最有效的抗肿瘤药物一紫杉醇。本发明还包括了应用本发明的菌株生产紫杉醇的方法，包括在培养基中培养本发明菌株，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。本发明紫杉醇产率高，生产成本低，发酵周期短，应用于工业化生产，可彻底解决紫杉醇的生产工业问题，既保护了自然资源，又可满足市场需求。
文档编号C07D305/00GK101386819SQ200810152500
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月28日 优先权日2008年10月28日
发明者冰 严, 朱旭东, 毕建男, 皎 潘, 元 纪 申请人:南开大学