制备3-苯基亚氨基-3h-吩噻嗪或3-苯基亚氨基-3h-吩噁嗪介体的方法

专利名称：制备3-苯基亚氨基-3h-吩噻嗪或3-苯基亚氨基-3h-吩噁嗪介体的方法
技术领域：
本发明总体上涉及一种形成介体的方法。更具体地说，本发明总体上涉及一种形 成用于电化学测试传感器的介体的方法，该传感器用来帮助测定与分析物相关的信息。
背景技术：
体液中分析物的定量测定对于某些身体状况的诊断和维护非常重要。例如，在某 些个体中应该监测乳酸、胆固醇和胆红素。特别地，糖尿病人经常检查其体液中的葡萄糖水 平以规范他们饮食中葡萄糖的摄取是十分重要的。这种测试结果能够用来测定需要给予的 胰岛素或其他药物(如果有的话)。在一种类型的血糖测试系统中，使用测试传感器来测试 血液样品。测试传感器包含与例如血糖发生反应的生物传感或试剂材料。一种类型的电化学 测试传感器是包括基部或基底及盖子的多层测试传感器。其他类型的电化学测试传感器包 括基部、隔离件和盖子。现有的电化学测试传感器包括电极图案形式的至少两个电极。电 位被施加到这些电极之间，并在工作电极处测量电流。电流测量与工作电极的尺寸成正比。电化学测试传感器基于相关分析物参与的酶催化的化学反应。在葡萄糖监测的情 况下，相关的化学反应是葡萄糖氧化成葡糖酸内酯或其相应的酸。这种氧化被各种酶催化， 其中的一些可以使用诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸盐)(NAD(P))等辅酶，而另一些可 以使用诸如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或吡咯并喹啉醌(PQQ)等辅酶。在测试传感器应用中，在葡萄糖氧化过程中产生的氧化还原等效物被输送到电极 表面，从而产生电信号。电信号的幅度与葡萄糖浓度相关。氧化还原等效物从酶中的化学 反应位点转移到电极表面是使用电子转移介体完成的。例如，诸如铁氰化物等许多介体具有高背景电流，以致在葡萄糖测试传感器中产 生的信噪比低。通常，低信噪比会导致更高的化验不准确，尤其在较低葡萄糖水平和高血细 胞比容样品水平的情况下。随着更快的样品测试(例如，测试时间小于10秒)，在分配给执 行测试的时间内可能难于除掉高背景电流。由于更快的样品测试时间，因此当应用样品时 各活性成分快速相互作用而产生快速响应是必须的。因此，需要形成一种介质，其具有低背景电流，同时仍然具有介体的其他所希望的 特性，包括稳定性。

发明内容
一种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的方法，包括提供包含吩噻嗪的第一反 应物。提供吩噻嗪在其中具有所希望的溶解度的第一溶剂。提供用于形成3-苯基亚氨 基-3H-吩噻嗪介体的第二反应物。提供第二反应物在其中具有所希望的溶解度的第二溶 剂。将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液。将过硫酸 钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的反应溶液。加入过硫酸钠后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩 噻嗪介体的反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。一种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的方法，包括提供包含吩噁嗪的第一反 应物。提供吩噁嗪在其中具有所希望的溶解度的第一溶剂。提供用于形成3-苯基亚氨 基-3H-吩噁嗪介体的第二反应物。提供第二反应物在其中具有所希望的溶解度的第二溶 剂。将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液。将过硫酸 钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含3-苯基亚氨 基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液。加入过硫酸钠后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩 噁嗪介体的反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。一种形成和稳定3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪 介体的方法，包括提供包含吩噻嗪或吩噁嗪的第一反应物。提供吩噻嗪或吩噁嗪在其中具 有所希望的溶解度的第一溶剂。提供用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基 亚氨基-3H-吩噁嗪介体的第二反应物。提供第二反应物在其中具有所希望的溶解度的第 二溶剂。将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液。半偶联 剂加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含3-苯基亚氨 基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液。加入偶联剂后，进一步 处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液， 从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。将3-苯 基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体稳定在约5 8的pH值。


图Ia是根据一个实施方案的测试传感器。图Ib是图Ia的测试传感器的侧视图。图2是背景电流对不同批次的本发明介体和比较介体的示图。图3a是使用几种中和或缓冲方法以及一些没有中和或缓冲的方法的背景电流 图。图3b是图3a中测量的基线和背景电流之间的背景电流的变化图。
具体实施例方式在一种方法中，本发明涉及一种生产低背景电流的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介 体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的改进方法。在另一种方法中，本发明涉及一种稳定 低背景电流的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的改进方 法。3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体是对电化学测试传 感器有用的介体，并且在一个实施方案中用于NADH的电化学再生(氧化)。本发明中形成的介体包括下式的吩噻嗪，
和下式的吩噁嗪，
Rs^ ^fr^sr Rr ^fr 、！3,其中，1^、1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8和1 9可以相同或不同，并且独立地选自氢、烷基、
烯基、炔基、芳基、杂芳基、环基、杂环基、卤素、卤代烷基、羧基、羧烷基、烷氧羰基、芳氧羰 基、芳香族酮基、脂肪族酮基、烷氧基、芳氧基、硝基、二烷基氨基、氨烷基、磺酸基、二羟基硼 及其组合。可以预期的是，还可以形成它们的异构体。3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体适用于电化学 测试传感器。电化学测试传感器适于接收流体样品并且适于使用仪器或测量仪来分析。测 试传感器有助于测定与分析物相关的信息，如分析物浓度。可测量的分析物包括葡萄糖、 胆固醇、血脂全套、微白蛋白、尿素、肌酸酐、肌酸、果糖、乳酸酯或胆红素。可以预期的是，可 以测定其他分析物浓度。分析物可以在例如全血样品、血清样品、血浆样品、其他体液(如 ISF (间质液)和尿)和非体液中。这里所描述的测试传感器是电化学测试传感器。用于电化学测试传感器的测量仪 可以具有用于检测校准信息的光学方面和用于测定与分析物相关的信息(例如，流体样品 的分析物浓度)的电化学方面。图Ia显示了电化学测试传感器的一个非限制性例子。图 Ia显示了包括基部11、毛细通道和多个电极16和18的测试传感器10。区域12所示为限 定毛细通道的区域(例如，将盖子放在基部11上后)。所述多个电极包括反电极16和工作 (测量)电极18。电化学测试传感器还可包括至少3个电极，例如工作电极、反电极、触发 电极或血细胞比容电极。在根据本发明实施方案的电化学传感器中使用的工作电极可以改 变为合适的电极，包括但并不限于碳、钼、钯、金、钌、铑及其组合。电极16和18与多个导线15a，b相连接，在所示实施方案中，该导线终止于被称作 测试传感器接触部14a，b的较大区域。毛细通道一般位于流体接收区19内。可以预期的 是，其他电化学测试传感器可以使用本发明的介体。流体接收区19包含至少一种试剂，用于将流体样品(例如，血液)中的相关分析 物(例如，葡萄糖)转化成根据利用电极图案的部件所产生的电流而可电化学测量的化学 物质。试剂通常包含与分析物和电子受体反应而产生可由电极检测的电化学可测量物质的 分析物特异性酶。试剂包含有助于电子在分析物和电极之间转移的介体。试剂可以包含将 酶和介体保持在一起的粘结剂、其他惰性成分或其组合。流体样品(例如，血液)可应用到流体接收区19。流体样品与至少一种试剂反 应。在与试剂反应并且与多个电极结合后，流体样品产生有助于测定分析物浓度的电信号。导线15a，b将电信号返输到测试传感器10的相对的第二端42，在那里测试传感器接触部 14a，b将电信号转移到测量仪。参照图lb，示出图Ia的测试传感器10的侧视图。如图Ib所示，图Ib的测试传感 器10还包括盖子20和隔离件22。基部11、盖子20和隔离件22可以由各种材料制成，如 聚合物材料。可以用来形成基部11、盖子20和隔离件22的聚合物材料的非限性例子包括 聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、聚酰亚胺及其组合。 可以预期的是，其他材料也可用于形成基部11、盖子20和/或隔离件22。为了形成图Ia和图Ib的测试传感器10，基部11、隔离件22和盖子20可以使用 例如粘合剂或热封剂连接。当基部11、盖子20和隔离件22被粘附时，形成了流体接收区 19。流体接收区19提供了用于将流体样品引入测试传感器10的流体通道。流体接收区19 形成在测试传感器10的第一端或测试端40。本发明实施方案中的测试传感器可由基部和 盖子形成，而没有隔离件，其中流体接收区直接形成在基底和/或盖子内。还可以预期的是，电化学测试传感器可在没有隔离件的情况下下形成。例如，电化 学测试传感器可以包括基部和盖子，使得当基部和盖子相互连接时形成通道(例如，毛细 通道)。基部、隔离件和盖子可由各种材料制成，如聚合物材料。可用于形成基部、隔离件 和盖子的聚合物材料的非限性例子包括聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙 烯、聚酰亚胺及其组合。可以预期的是，基部、隔离件和盖子可独立地由其他材料制成。电 极图案可由各种导电材料制成，包括但不限于金、钼、铑、钯、钌、碳或其组合。 在另一个实施方案中，3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁 嗪介体可用于光学测试传感器。在这样的系统中3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯 基亚氨基-3H-吩噁嗪介体将是稳定的介体。在一种方法中，形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体，该方法包括提供包含吩噻嗪 的第一反应物。提供第一溶剂，在其中吩噻嗪具有所希望的溶解度。提供第二反应物，用于 形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶 解度。将第一反应物和第一溶剂混合在一起，形成第一反应物溶液。第二反应物和第二溶 剂混合在一起，形成第二反应物溶液。第一反应物溶液和第二反应物溶液混合在一起，形成 反应物溶液。制备过硫酸钠溶液并将其加到反应物溶液中。过硫酸钠溶液通常使用第二溶 剂(与用于形成第二反应物溶液相同的溶剂)形成。过硫酸钠使得第一反应物和第二反应 物偶联，从而产生含有形成的产物的反应溶液。在此方法中，进一步处理反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。 在一个实施方案中，3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体是盐的形式。在另一个实施方案中， 3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体是酸的形式。一些3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体可以不 是盐或酸的形式。第二试剂被选择以形成所希望的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。例如，第二试剂 可以是苯胺2，5- 二磺酸。当使用苯胺2，5- 二磺酸时，所形成的具体3-苯基亚氨基-3H-吩 噻嗪介体是(3-(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体。可以预期的是，其他第二试剂可用于形成不同的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。 例如，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的第二试剂可以选自4_ 二乙基氨基苯胺；4_氯苯胺；4-乙基苯胺；4-三氟甲基苯胺；4-氨基苯甲酸甲酯；4-硝基苯胺；4-甲氧基苯 胺；4_ (4’ -氨基苯基)丁酸；4-氨基苄胺；4-(2’ -氨基乙基)苯胺；5-氨基-1，3-苯二甲 酸；4-氨基苯甲酸；2，5- (4，-氨基苯基)-1，3，4-噁二唑；4- [2，- (2，-乙醇氧基)乙氧基] 乙氧基苯胺；和2，5_ 二磺酸基苯胺。可以预期的是，其他第二试剂可用于形成其他3-苯基 亚氨基-3H-吩噻嗪介体。选择与第一反应物兼容的第一溶剂。优选第一反应物在第一溶剂中具有通常高的 溶解度。在一种方法中，第一溶剂是四氢呋喃(THF)。第一溶剂优选为四氢呋喃(THF)，因 为吩噻嗪在其中具有通常高的溶解度。第一溶剂还优选与第二溶剂易混溶，从而形成总体 上或基本上均勻的溶液。可以预期的是，其他第一溶剂可用于替代四氢呋喃(THF)，例如，N, N- 二甲基甲酰 胺、甲醇、乙醇、1，4_ 二氧杂环己烷和环丁砜。还可以预期的是，也可以使用其他第一溶剂。选择与第二反应物兼容的第二溶剂。优选第二反应物在第二溶剂中具有通常高的 溶解度。在一种方法中，第二溶剂是水。在另一种方法中，第二溶剂是水和氢氧化钠(NaOH) 的混合物。氢氧化钠是优选的，因为至少一些第二反应物的溶解度通过增加碱性而提高。可 以预期的是，其他碱性溶液可以加到第二溶剂中，以提高第二试剂在其中的溶解度。可以预 期的是，其他第二溶剂可用于替代水。过硫酸钠可促进第一反应物和第二反应物之间的偶联。过硫酸钠是优选的偶联 剂，因为它被认为可避免形成不需要的副产物。使用过硫酸钠作为偶联剂有助于获得一致 的低背景电流，这意味着形成通常低量的不需要副产物并且留在溶液内。此外，过硫酸钠 的使用有助于通过促进有机物质的沉淀而更容易地从反应中分离出所希望的3-苯基亚氨 基-3H-吩噻嗪介体。为了形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体，在偶联剂加到包含第一反应物、第一溶 剂、第二反应物和第二溶剂的反应物溶液后进行进一步处理。第一溶剂(例如，四氢呋喃) 可以从溶液中去除或萃取出来。第一溶剂可通过例如乙酸乙酯去除。乙酸乙酯有助于萃取 第一溶剂并且也可有助于从反应溶液中去除其他不需要的残留有机物质(例如，水溶性有 机物质)。可以预期的是，其他化合物可用于去除第一溶剂，例如，乙醚、氯仿和二氯甲烷。通过冷却和过滤从产物中去除第二溶剂(例如，水)。通过去除第二溶剂，这也有 助于防止或抑制分解。通过防止或抑制分解，背景电流通常会在更希望的较低水平。通过 例如冷却和过滤未去除的残留第二溶剂(例如，残留的水)通过几种方法从产物中去除。例 如，残留的第二溶剂可通过如下方法去除(a)在真空烘箱中干燥、(b)将化合物加到产物 中或(c)冻干产物溶液。在一种方法中，将乙腈加到残留的第二溶剂中，以有助于从溶液中去除残留的第 二溶剂。可以预期的是，其他化合物可用于去除残留的第二溶剂，例如，丙酮和甲苯。可以预期的是，其他处理可以在形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体时发生。例 如，第二溶剂去除之前的处理步骤可以包括在水中重构介体、冷却、然后在室温下过滤以去 除一些过量的盐。还可以预期的是，可以进行其他处理步骤。在另一种方法中，形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体，该方法包括提供包含吩噁 嗪的第一反应物。提供第一溶剂，在该溶剂中吩噁嗪具有所希望的溶解度。提供第二反应物，从而有助于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。提供第二溶剂，在该溶剂中第二试剂 具有所希望的溶解度。第一反应物和第一溶剂混合在一起，可形成第一反应物溶液。第二 反应物和第二溶剂混合在一起，可形成第二反应物溶液。第一反应物溶液和第二反应物溶 液混合在一起，可形成反应物溶液。制备过硫酸钠溶液并将其加到反应物溶液中。过硫酸 钠溶液通常使用第二溶剂(与用于形成第二反应物溶液相同的溶剂)形成。过硫酸钠使得 第一反应物和第二反应物偶联，从而产生含有形成的产物的反应溶液。在此方法中，进一步处理反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。 在一个实施方案中，3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体是盐的形式。在另一个实施方案中， 3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体是酸的形式。一些3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体可以不 是盐或酸的形式。在此方法中，如果形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体，可以使用上面针对形成 3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的方法所述的相同或类似的第二试剂、第一溶剂及第二溶 剂。此外，通过基本上去除至少第一溶剂和第二溶剂而分离3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体 的处理可以使用与上面针对3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体所述的类似或相同方式进行。可以预期的是，使用本发明方法可以形成许多不同的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪 介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。已经制备出来并发现具有作为NADH介体的适当性 能的吩噻嗪的一个优选例子是3-(2’，5’- 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体。已经制 备出来并发现具有作为NADH介体的适当性能的另一个优选例子是3-(3’，5’ - 二羧基-苯 基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体。已经制备出来并发现具有作为NADH介体的适当性能的吩噻嗪和吩噁嗪是: 3_(4’ -氯-苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪；3-(4’ - 二乙基氨基-苯基亚氨基)-3H-吩噻 嗪；3-(4，-乙基-苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪；3-(4，-三氟甲基-苯基亚氨基)-3H-吩噻 嗪；3-(4’ -甲氧羰基-苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪；3-(4’ -硝基-苯基亚氨基)-3H-吩噻 嗪；3-(4’ -甲氧基-苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪；7-乙酰基-3-(4’ -甲氧羰基苯基亚氨 基)-3H-吩噻嗪；7-三氟甲基-3- (4，-甲氧羰基-苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪；3- (4，- ω -羧 基_正丁基_苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3-(4’ -氨基甲基-苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪； 3- (4，- (2，，- (5，，- (ρ-氨基苯基-1，3，4-噁二唑基)苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3- (4，- β -氨 基乙基-苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；6-(4’ -乙基苯基)氨基_3-(4’ -乙基苯基亚氨 基)-3Η-吩噻嗪；6-(4，-[2-(2-乙醇氧基)乙氧基]-乙氧基苯基)氨基-3-(4，-[2-(2-乙 醇氧基)乙氧基]乙氧基苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3-(4’-[2-(2_乙醇氧基)乙氧基]乙 氧基-苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3-(4’ -苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪硼酸；3-(3’，5’ - 二羧 基-苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3-(4’-羧基苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪；3-(3’，5-二羧基-苯 基亚氨基)-3Η-吩噁嗪；3-(2’，5’ -苯基亚氨基)-3Η-吩噻嗪二磺酸；和3-(3'-苯基亚 氨基)-3Η-吩噻嗪磺酸。可以预期的是，已经制备出来并发现具有适当性能的吩噻嗪和吩噁嗪可用于黄素 蛋白，例如FAD-葡萄糖氧化酶、黄素-己糖氧化酶和FAD-葡萄糖脱氢酶。还可以预期的 是，已经制备出来并发现具有适当性能的吩噻嗪和吩噁嗪可用于醌蛋白，例如PQQ-葡萄糖 脱氢酶。 在另一种方法中，3-苯基亚氨基-3Η-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3Η-吩噁嗪介体的稳定性也可以通过中和或缓冲来提高。中和或缓冲步骤有助于稳定介体，因此在所遇 到的保存条件期间是稳固的。可以预期的是，中和或缓冲步骤可以在已经发生了分离介体 的进一步处理之前或之后进行。例如，中和或缓冲步骤可以在介体干燥成粉末状之前进行。 在另一个例子中，中和或缓冲步骤可以在介体干燥成粉末状之后进行。中和剂或缓冲剂可以选自如下物质，包括但不限于氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、 四丁基氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化钾、磷酸钾、碳酸氢钾及其组合。可以预期的是，其他材 料可用作中和剂或缓冲剂。在将中和剂或缓冲剂加到介体溶液中之后，pH值一般为约5 8。更典型地，在将 中和剂或缓冲剂加到介体溶液中之后，PH值一般为约5. 5 7，更优选约6 7。实施例实施例1(3-(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H_吩噻嗪介体的制备将吩噻嗪(1. 53摩尔，1. 1当量，306g)搅拌下溶解于6. OL四氢呋喃(THF)中，然 后冷却至0°C。将苯胺2，5-二磺酸(1.38摩尔，350g)溶解于7. OL水中，并在搅拌下加入 IM的氢氧化钠(NaOH) (128ml)。在约2小时内将苯胺2，5-二磺酸溶液缓慢加到吩噻嗪溶 液中，得到白色浑浊的悬浮液。吩噻嗪/苯胺悬浮液处在约0 4°C的温度下。将过硫酸钠 (5. 52摩尔，4当量，1314g)溶解在4. OL水中，形成过硫酸钠溶液。在3小时内将过硫酸钠溶液滴加到温度为约0 3°C的吩噻嗪/苯胺悬浮液中， 产生深黑色溶液。使用冰浴将该深黑色溶液保持冷却，并搅拌过夜。然后，将内容物转移到 Buchi旋转蒸发仪中，在约2小时内，在低于35°C的温度下去除四氢呋喃。蒸发后，将残留 溶液转移到25L分离器中，并用乙酸乙酯反向洗涤。残留溶液被反向洗涤3次，每次使用乙 酸乙酯2L。反应流体在丙酮/CO2浴中搅拌下冷却至-3°C。在同一天内，通过两个24cm的 Buchner漏斗上的两块布过滤沉淀的固体。沉淀的固体留在漏斗内干燥过夜，然后转移至含 有2L乙腈的烧瓶内，并在室温下搅拌约1小时。为了去除残留的水，过滤样品并用更多的 乙腈洗涤。介体在35°C的真空烘箱内干燥至恒重。使用该方法形成的介体是3- (2 ’，5 ’ -苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪二磺酸或3_ (2 ’， 5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪。该介体显示如下 实施例2本发明方法和比较方法的背景电流对通过两种不同方法制备的3- (2’，5’- 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的背景电流进行比较。用于形成3- (2 ’，5 ’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的本发明 方法使用过硫酸钠作为偶联剂，并且与上面实施例1中所述的方法基本相同。这种介体称 为本发明介体。用于形成3- (2 ’，5 ’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的比较方法使 用过硫酸铵作为偶联剂。比较方法与本发明方法基本相同，除了后者使用过硫酸钠作为偶 联剂。这种介体称为比较介体。将本发明介体和比较介体分别加到缓冲液中。各缓冲液包含IOOmM的磷酸钠。在 将本发明介体和比较介体加到缓冲液中后，将两个溶液的PH值调节至7. 2。然后，将本发明 介体的溶液和比较介体的溶液分别放置在碳电极上。3秒后，将250mV的电位施加在碳电极 上5秒，然后采集各介体的背景电流的读数。参照图2，对于通过本发明方法和比较方法形成的不同批次的介体，绘制3_(2’， 5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的背景电流(单位nA)的示图。具体地说，从 不同批次测试5个不同的比较介体(称为比较介体1-5)和4个不同的本发明介体(称为 本发明介体1-4)。如图2所示，有3个批次的比较介体具有极高的背景电流。可以看到，图2中的比 较介体1、4和5的背景电流分别是2687、1158和1971nA。比较介体2的背景电流是75nA， 比较介体3的背景电流是221nA。所有的本发明介体1_4都具有小于约IOOnA的预期背景 电流。具体地说，本发明介体1-4的背景电流分别是88、93、106和99nA。实施例3使用不同方法的3_(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H_吩噻嗪的稳定性比较将通过两种不同方法制备的3- (2’，5’- 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪的稳定 性进行比较。用于形成3-(2’，5’- 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的本发明方法使 用过硫酸钠作为偶联剂，并且与上面实施例1中所述的方法基本相同。这种介体称为本发 明介体。用于形成3-(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体的比较方法使用过 硫酸铵作为偶联剂。比较方法与本发明方法基本相同，除了后者使用过硫酸钠作为偶联剂。 这种介体称为比较介体。对本发明介体和比较介体的稳定性进行比较。将来自本发明方法和比较方法的介 体分别配制成试剂混合物。所述试剂混合物还包含磷酸盐缓冲液、Fad-GDH、纤维素聚合物 和表面活性剂。将试剂混合物放置在金电极上，以形成葡萄糖测试传感器。将具有本发明 介体和比较介体的测试传感器样品放置在-20°C温度下持续两周。将用来自本发明方法和 比较方法相同批次的介体配制的测试传感器也放置在50°C温度下持续两周。试剂混合物包含放置过的本发明介体或比较介体。采用YellowSprings Glucose Analyzer (YSI, Inc.，Yellow Springs, Ohio)，在 250mV 的施加电位下，使用 4 种不同浓度 (0mg/dL、50mg/dL、100mg/dL和400mg/dL)的全血葡萄糖样品测量电极的响应。利用各试剂 根据YSI葡萄糖测量的斜率和截距将电响应转换成葡萄糖浓度。对于包含在_20°C和50°C 温度下放置的本发明介体或比较介体的各试剂，对葡萄糖浓度进行测试和比较，对比观察 它们之间是否存在任何变化或偏差。例如，使用50mg/dL的葡萄糖，对包含在_20°C和50°C 温度下放置的本发明介体的试剂进行比较，观察是否存在任何读数变化。测定这些读数之 间的偏差％。对于各个不同的葡萄糖浓度示出偏差％，本发明介体和比较介体列于下表1中
表 1 因此，如表1所示，使用本发明方法形成的3-(2’，5’_ 二磺酸基苯基亚氨 基)-3H-吩噻嗪在放置于50°C温度下持续两周之后比使用比较方法形成的3-(2’，5’ - 二 磺酸基苯基亚氨基)-3H_吩噻嗪具有更大的稳定性。本发明方法具有更大的稳定性是因为 测得的葡萄糖浓度在50°C的温度下放置后没有很大改变，这可由低偏差％表明。另一方面， 比较方法具有更低的稳定性是因为测得的葡萄糖浓度在50°C的温度下放置后的改变远大 于本发明方法，这可由较高的偏差％表明。实施例4中和或缓冲对3- (2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪的稳定性的影响在实施例4的中和或缓冲测试中，使用相同的3_(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨 基)-3H-吩噻嗪介体。相同的介体也用于不包括中和或缓冲测试的测试中。使用过硫酸钠 作为偶联剂形成3-(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪介体，并且与上面实施例1 中所述的方法基本相同。实施例4使用不同的中和剂或缓冲剂测试3种方法，并且将其与不包括中和剂或 缓冲剂的2种方法进行比较。参照图3a和图3b，形成介体1和介体2的方法不包括任何中 和步骤或缓冲步骤。形成介体1的方法包括使用真空烘箱干燥介体。形成介体2的方法包 括在PH值2. 4下控制的冻干。形成介体3-5的各方法包括中和步骤或缓冲步骤。中和步骤或缓冲步骤均导致PH 值为6.1。具体地说，介体3使用20mM的磷酸钠。通过称量5克3-(2’，5’-二磺酸基苯基 亚氨基)-3H-吩噻嗪介体并将其溶解于pH值为7. 2的20mM磷酸钠缓冲液中，形成该溶液。 用IM NaOH将pH值调节到6. 1。磷酸钠缓冲液的使用通常称为pH调节。介体4使用IM的氢氧化钠。通过称量5克3_(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨 基)-3H-吩噻嗪并将其溶解于IOOmL冷水中，形成该溶液。搅拌下滴加IM的氢氧化钠溶液， 直到测得的PH值为6. 1。在此方法中氢氧化钠的使用中和了溶液，因此，称之为中和剂。介体5使用IM的碳酸氢钠。通过称量5克3_(2’，5’ - 二磺酸基苯基亚氨 基)-3H-吩噻嗪并将其溶解于IOOmL冷水中，形成该溶液。搅拌下滴加IM碳酸氢钠溶液， 直到测得的PH值为6. 1。在此方法中碳酸氢钠的使用中和了溶液，因此，称之为中和剂。然后，各介体3-5都在异丙醇/干冰浴中冷冻，并使用VirTis 型号4KBTXL台式 4K冷冻干燥器(Gardiner，N. Y.)冻干成干粉。将介体1-5的干粉形式在各种保存条件下受应激两周。具体地说，测试9种不同条件，其中温度为-40°C 50°C。在放置于温度条件下之前，将干燥样品放入玻璃小瓶中， 用盖子密封，然后保存。在-40°C和30°C下进行两个测试，其中加入有“使用”组分。具体 地说，“使用”组分包括将介体1-5放置于环境温度下30分钟，然后密封盖子，1周后打开盖 子，并在环境温度下重新放置另一个30分钟。这种“使用，，放置仅仅在温度-40°C和30°C 下实施。“初始”测试是在没有保存条件下进行的测试。使用背景电流筛选分析来测试各介体样品的背景电流。按照实施例1制备介体样 品，并如实施例2所述的使用IOOmM的磷酸钠将pH值调节至7. 2。将这些介体样品加到碳 电极上。3秒后，将250mV的电位施加5秒，然后测量背景电流。如图3a所示，当在该时间段内放置在更高温度下时，包括中和或缓冲步骤的介体 中的背景电流(单位nA)更低。对于介体1-5，比较在大于25°C的各温度下的背景电流。在 最高放置温度为50°C时尤其如此。图3b显示背景电流在图3a的测量的背景电流与不同放置之前测量的基线之间的 变化(％)。相似地，当在这一时间段内放置在更高温度下时，包括中和或缓冲步骤的介体 中的背景电流(％)更低。对于介体1-5，比较在大于25°C的各温度下的背景电流的变化％。 在最高放置温度为50°C时尤其如此。方法A一种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的方法，所述方法包括以下步骤提供包含吩噻嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噻嗪具有所希望的溶解度；提供第二反应物，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体；提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度；将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液；将过硫酸钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生 包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的反应溶液；以及加入过硫酸钠后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体的反应溶液，从 而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。方法B方法A的可选方法，其中所述第一溶剂包括四氢呋喃(THF)。方法C方法A的可选方法，其中所述第二溶剂包括水。方法D方法C的可选方法，其中所述第二溶剂还包括氢氧化钠。方法E方法A的可选方法，其中将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合包 括以下步骤在第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合在一起形成反应物溶液 之前，将第一反应物和第一溶剂混合形成第一反应物溶液，以及将第二反应物和第二溶剂 混合形成第二反应物溶液。方法F方法A的可选方法，其中进一步处理包括通过加入乙腈总体上去除第二溶剂。
方法G方法A的可选方法，其中进一步处理包括通过加入乙酸乙酯总体上去除第二溶 剂。方法H方法A的可选方法，其中第二反应物包括苯胺2，5- 二磺酸。方法I方法A的可选方法，其中进一步处理包括从第二溶液中基本上去除至少第一溶剂 和第二溶剂，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。方法T方法A的可选方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪是盐的形式。方法K方法A的可选方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体是酸的形式。方法L一种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的方法，所述方法包括以下步骤提供包含吩噁嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噁嗪具有所希望的溶解度；提供第二反应物，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体；提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度；将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液；将过硫酸钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生 包含3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液；以及加入过硫酸钠后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液，从 而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。方法 M方法L的可选方法，其中所述第一溶剂包括四氢呋喃(THF)。方法N方法L的可选方法，其中所述第二溶剂包括水。方法0方法N的可选方法，其中所述第二溶剂还包括氢氧化钠。方法P方法L的可选方法，其中将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合包 括以下步骤在第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合在一起形成反应物溶液 之前，将第一反应物和第一溶剂混合形成第一反应物溶液，以及将第二反应物和第二溶剂 混合形成第二反应物溶液。方法Q方法L的可选方法，其中进一步处理包括通过加入乙腈总体上去除残留的第二溶 剂。方法R方法L的可选方法，其中进一步处理包括通过加入乙酸乙酯总体上去除第一溶剂。方法S方法L的可选方法，其中进一步处理包括从第二溶液中基本上去除至少第一溶剂 和第二溶剂，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。方法T方法L的可选方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪是盐的形式。方法U方法L的可选方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪是酸的形式。方法V一种形成和稳定3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介 体的方法，所述方法包括以下步骤提供包含吩噻嗪或吩噁嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噻嗪或吩噁嗪具有所希望的溶解度；提供第二反应物，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨 基-3H-吩噻嗪介体；提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度；将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液；将偶联剂加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包 含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液；加入偶联剂后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨 基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚 氨基-3H-吩噁嗪介体；以及将3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体稳定在约 5 8的pH值。方法W方法V的可选方法，其中PH值为约5. 5 7。方法X方法W的可选方法，其中pH值为约6 7。方法Y方法W的可选方法，其中稳定3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨 基-3H-吩噁嗪介体包括加入氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、四丁基氢氧化铵、氢氧化钙、氢 氧化钾、磷酸钾、碳酸氢钾或其组合。虽然已经参照一个以上具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员可以意识 到在不背离本发明的精神和范围下可以做出多种变化。期望这些实施方案及其明显变型都 落入本发明的精神和范围内。
权利要求
一种形成3 苯基亚氨基 3H 吩噻嗪介体的方法，所述方法包括以下步骤提供包含吩噻嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噻嗪具有所希望的溶解度；提供第二反应物，用于形成3 苯基亚氨基 3H 吩噻嗪介体；提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度；将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液；将过硫酸钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含3 苯基亚氨基 3H 吩噻嗪介体的反应溶液；以及加入过硫酸钠后，进一步处理包含3 苯基亚氨基 3H 吩噻嗪介体的反应溶液，从而分离出3 苯基亚氨基 3H 吩噻嗪介体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一溶剂包括四氢呋喃(THF)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第二溶剂包括水。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二溶剂还包括氢氧化钠。
5.如权利要求1所述的方法，其中将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混 合包括以下步骤在第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合在一起形成反应物 溶液之前，将第一反应物和第一溶剂混合形成第一反应物溶液，以及将第二反应物和第二 溶剂混合形成第二反应物溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其中进一步处理包括通过加入乙腈总体上去除第二溶剂。
7.如权利要求1所述的方法，其中进一步处理包括通过加入乙酸乙酯总体上去除第一 溶剂。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二反应物包括苯胺2，5-二磺酸。
9.如权利要求1所述的方法，其中进一步处理包括从第二溶液中基本上去除至少第一 溶剂和第二溶剂，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体。
10.如权利要求1所述的方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪是盐的形式。
11.如权利要求1所述的方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体是酸的形式。
12.—种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的方法，所述方法包括以下步骤 提供包含吩噁嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噁嗪具有所希望的溶解度； 提供第二反应物，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体； 提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度； 将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液； 将过硫酸钠加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含 3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液；以及加入过硫酸钠后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液，从而分 离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一溶剂包括四氢呋喃(THF)。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述第二溶剂包括水。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第二溶剂还包括氢氧化钠。
16.如权利要求12所述的方法，其中将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂 混合包括以下步骤在第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合在一起形成反应 物溶液之前，将第一反应物和第一溶剂混合形成第一反应物溶液，以及将第二反应物和第 二溶剂混合形成第二反应物溶液。
17.如权利要求12所述的方法，其中进一步处理包括通过加入乙腈总体上去除残留的 第二溶剂。
18.如权利要求12所述的方法，其中进一步处理包括通过加入乙酸乙酯总体上去除第 一溶剂。
19.如权利要求12所述的方法，其中进一步处理包括从第二溶液中基本上去除至少第 一溶剂和第二溶剂，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体。
20.如权利要求12所述的方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪是盐的形式。
21.如权利要求12所述的方法，其中3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪是酸的形式。
22.—种形成和稳定3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介 体的方法，所述方法包括以下步骤提供包含吩噻嗪或吩噁嗪的第一反应物；提供第一溶剂，在其中吩噻嗪或吩噁嗪具有所希望的溶解度；提供第二反应物，用于形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩 噻嗪介体；提供第二溶剂，在其中第二反应物具有所希望的溶解度；将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液；将偶联剂加到所述反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含 3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液；加入偶联剂后，进一步处理包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨 基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液，从而分离出3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚 氨基-3H-吩噁嗪介体；以及将3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体稳定在约5 8 的PH值。
23.如权利要求22所述的方法，其中pH值为约5.5 7。
24.如权利要求23所述的方法，其中pH值为约6 7。
25.如权利要求23所述的方法，其中稳定3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪介体或3-苯基亚 氨基-3H-吩噁嗪介体包括加入氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、四丁基氢氧化铵、氢氧化钙、 氢氧化钾、磷酸钾、碳酸氢钾或其组合。
全文摘要
本发明公开了一种形成3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的方法，该方法包括提供包含吩噻嗪或吩噁嗪的第一反应物，提供第一溶剂，提供第二反应物，和提供第二溶剂。将第一反应物、第一溶剂、第二反应物和第二溶剂混合，形成反应物溶液。将过硫酸钠加到反应物溶液中，使第一反应物和第二反应物偶联，从而产生包含3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪或3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪介体的反应溶液。
文档编号C07D279/18GK101896811SQ200880120033
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月8日 优先权日2007年12月10日
发明者亨利·C·阿恩特, 卡伦·L·马尔福瑞特 申请人:拜尔健康护理有限责任公司