专利名称：一种浓缩干燥肽段样品的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质及多肽加工处理领域，特别是涉及一种浓缩干燥肽段样品的方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA、mRNA到蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控，翻译水平调控，翻译后水平调控。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、 蛋白质-蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。 因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科-蛋白质组学(Proteomics)，它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达， 以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。就现有的蛋白质组研究技术，无论是哪种研究策略都需要将大分子的蛋白质酶解消化成肽段之后才能较好地应用质谱技术进行肽段信息分析，进而获得复杂的大分子蛋白质的信息。酶解消化后的肽段样品，经脱盐等处理后，其肽段浓度一般偏低，需要进一步浓缩干燥后重新定容定浓度才适合上质谱仪进行分析鉴定。目前肽段样品的浓缩干燥方法主要有真空冻干和常温真空抽干，两者共有的缺点是较大的时间成本，且真空冻干机价格昂贵，常温真空抽干在抽干过程中肽段样品容易被蛋白酶进一步降解，不利于准确信息的获取。
发明内容
本发明的目的是针对上述浓缩干燥方法中存在的时间长、成本高、肽段样品容易降解等问题，提供一种简便、快速、低成本、高效率的浓缩干燥肽段样品的方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种浓缩干燥肽段样品的方法，所述方法包括采用加热蒸干的方式使肽段样品溶液蒸发，且肽段样品溶液为中性溶液。需要说明的是，本发明中，加热蒸干的温度不能太高或太低，加热温度过低所需加热时间长，温度过高容易沸腾，两种情况均可能会导致肽段分子的损失或破坏，因此，优选的，加热温度不超过90°c，为了减少蒸干所用的时间，更优选的加热温度为50 90°C，最优选为80 90°C。本发明中，进一步的，所述方法包括如下步骤A.对蛋白质样品进行酶解消化，制备得到中性的肽段样品溶液，需要指出的是，样品溶液呈过酸或过碱状态均会使肽段容易发生降解，因此肽段样品溶液不能酸性或者碱性太高，优选的肽段样品溶液的PH值为pH6. 5-7. 5 ；B.用加热蒸干的方式使肽段样品溶液蒸发。优选的，上述步骤B包括将肽段样品溶液置于1.5mL离心管内，加热使离心管内样品溶液蒸发至体积剩余100-200 μ L时，对离心管进行震荡处理，使蒸发过程中残留在管壁的肽段溶解于离心管内剩余的样品溶液中，离心，使样品溶液甩至离心管底，继续加热， 直至溶液完全蒸发；需要指出的是，上述溶液蒸发至体积剩余100-200 μ L是相对于1. 5mL 离心管的，对于其它容量较大的离心管，溶液体积剩余量按比例扩大。更进一步的，上述方法在步骤A和步骤B之间还包括将步骤A处理后的样品，进行高效液相色谱分离和/或除盐处理。本发明中，优选的，所述酶解消化为溶液内酶解消化或者胶内酶解消化；所述溶液内酶解消化是指蛋白质样品在溶液中以溶解状态的形式被酶解消化；胶内酶解消化是指蛋白质样品以在胶体(如聚丙烯酰胺凝胶)内的形式直接被酶解消化。本发明中，上述方法的步骤B中加热使用的仪器优选为金属浴。优选的，上述方法中对离心管进行震荡处理为涡旋震荡处理l-5min，离心为 13000-15000g，离心 3-10min。由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于本发明针对肽段的浓缩干燥方法，克服了蛋白质研究领域中通常具有的“肽段受热容易变性、降解或断裂”的技术偏见，突破了“肽段干燥必须在低温或常温条件下进行”的传统思维，采用直接加热蒸干的方式，具有操作简易、快速有效、成本低廉等优点，且能保证干燥后的肽段不变性不降解。本发明的方法与其他浓缩干燥方法相比，是其他方法如常温真空抽干时间的3/20，大大缩短了样品处理时间；整个操作过程只需要几个简单的手工操作，简单方便；处理时间短且有效地抑制了蛋白酶对肽段的进一步降解，有利于后期得到更好的数据结果；只需要几个简单常用的仪器，所获得的浓缩干燥样品适合于后续的蛋白质组学研究。
图1是本发明实施例中第一批平行实验的总离子流图，由上往下分别为90°C加热蒸干、70°C加热蒸干、50°C加热蒸干、常温真空抽干处理肽段的总离子流图；图2是本发明实施例中第二批平行实验的总离子流图，由上往下分别为90°C加热蒸干、70°C加热蒸干、50°C加热蒸干、常温真空抽干处理肽段的总离子流图。
具体实施例方式本发明采用直接加热蒸干浓缩方法对肽段样品进行浓缩处理，具体的包括对蛋白质样品进行酶解消化，获得肽段样品溶液，优选的可以采用蛋白质溶液内酶解消化或者胶内酶解消化；所述溶液内酶解消化是指蛋白质样品在溶液中以溶解状态的形式被酶解消化；胶内酶解消化是指蛋白质样品以在胶体(如聚丙烯酰胺凝胶)内的形式直接被酶解消化，例经过SDS-PAGE分离后的蛋白质可以直接以在胶内的形式被酶解消化(需要将胶块切碎成小胶粒，以增加酶解效率)。胶内消化的优点是蛋白质样品被固定在胶体内，可通过简单的清洗步骤去除其他杂质后再酶解消化，得到较纯的肽段样品。缺点是消化效率较低。 并且，在本发明的处理过程中，溶液呈过酸或过碱状态均会使肽段容易发生降解，因此肽段样品溶液不能酸性或者碱性太高，优选的肽段样品溶液的PH值为pH6. 5-7. 5。然后，将上述处理的肽段样品溶液转移至离心管内，加热使溶液蒸发，优选的，将肽段样品转移至1.5mL离心管中，打开离心管盖进行加热蒸发，更优选的采用金属浴进行加热，需要指出的是，在上述优选方案中，采用的离心管在加热过程中不能有管壁多聚物的溶出，以保证肽段样品不被污染或者破坏，而采用金属主要是利用其加热速度快的优点，其它能够快速加热的仪器也具有同等效果；在离心管内样品溶液蒸干至体积剩余 100-200 μ L时，对样品进行震荡处理，使蒸发过程中残留在管壁的肽段溶解于离心管内剩余的样品溶液中；优选的，采用涡旋震荡使蒸发过程中残留在管壁的肽段溶解，震荡时间为 l-5min;需要指出的是涡旋震荡具有快速有效的效果，其它能到达同等目的的方法也同样可行；并且，离心管内剩余溶液的体积也是基于使蒸干后肽段尽量聚集在一起的考虑，因此根据不同的离心管，离心管内样品溶液体积剩余量可以相应调整，使得溶液刚好够覆盖于管底即可。最后，将上述震荡处理的样品溶液甩至离心管底，优选的离心速度为 13000-15000g，离心3-lOmin ；需要指出的是离心只是为了让溶液甩至管底，在试验允许范围内调整离心速度或离心时间都是可行的；将样品继续加热，直至溶液完全蒸发，即获得浓缩蒸干的肽段；需要指出的是，蒸干后管底的固体即肽段样品，根据试验目的的要求，还可以采用不同的溶剂复溶肽段样品，然后用于后续试验。进一步的，本发明的方法中，在样品进行加热蒸干前还包括对样品进行高效液相色谱分离和/或除盐处理。需要指出的是，高效液相色谱分离可以降低肽段样品的复杂性， 有利于质谱鉴定，但是会造成部分样品的损失并增加成本，具体实验中可根据研究需要进行选择。盐离子会对肽段的后续质谱检测造成影响，影响电喷雾离子化以及质谱信号灵敏度等，因此需要进行除盐处理，但对于样品中不含盐离子的肽段溶液则不需要进行该步骤。 本发明中，优选的采用Strata X除盐柱进行除盐处理。本发明中，在加热蒸干时，加热的温度不能太高或太低，加热温度过低所需加热时间长，温度过高容易沸腾，均可能会导致肽段分子的损失或破坏，因此，本发明的加热温度不超过90°C，为了减少加热蒸干的时间，优选的加入温度为50 90°C，更优选为80 90 "C。下面以酵母蛋白酶解消化后得到的肽段的浓缩干燥过程为例对本发明的方法作进一步详细说明，以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例1酵母蛋白的提取制备及还原烷基化(1)酵母蛋白的提取制备取液体培养的酵母细胞5X IO8个，SOOOg离心5min，去培养基；用去离子水悬浮洗涤酵母细胞，8000g离心5min去上清，重复三次，除去培养基成分；在酵母细胞中加ImL Lysis Buffer (0. lmol/L Na0H+0. 05mol/L EDTA+2% SDS+30mmol/L DTT)，制成细胞悬浮液， 90°C煮 IOmin ；加 25yL 4mol/L 的乙酸(LysisBuffer 4M 乙酸=40 1)涡旋震荡 30s， 90°C煮IOmin ；20000g，离心5min，取上清；在上清中加入4倍体积的甲醇(甲醇于_20°C预冷)，涡旋震荡；20000g离心IOmin,去上清，风干沉淀；加200 μ L-500 μ L裂解液(8mol/L 尿素 +50mmol/LTris base (pH8. 0))，终浓度为 lmmol/L 的 PMSF、2mmol/L 的 EDTA 混勻，置于冰上5min后加入10mmol/L DTT混勻，再冰浴超声5min，超声波周期lsec/2sec ；30000g离心15min，上清即为蛋白溶液。定量，电泳检测。(2)还原烷基化取120 μ g制备好的酵母蛋白，加入lmol/L的DTT至终浓度为lOmmol/L，震荡混勻，短暂离心，56°C水浴Ih ；加入lmol/L的IAM至终浓度为lOOmmol/L，震荡混勻，短暂离心，室温暗室放置45min ；加入4倍体积的冷丙酮_20°C沉淀浊；20000g离心30min。实施例2酵母蛋白的酶解消化还原烷基化后的酵母蛋白加入100 μ L 25mmol/L的NH4HCO3超声辅助复溶后，按胰蛋白酶酵母蛋白=1 50的量加入胰蛋白酶，酶解消化16h。实施例3肽段的除盐用strata X试剂盒除盐，甲醇ImL活化柱子，用注射器和转接筒推，保持流速为3 滴/秒过柱。5 %乙腈ImL平衡柱子，保持流速为1滴/秒过柱。消化后的肽段样品用水稀释至500 μ L，加到柱中，保持流速为1滴/秒过柱。5%乙腈ImL冲洗除盐，保持流速为1滴/秒过柱。80%乙腈400 μ L洗脱肽段，保持流速为1滴/秒，加入三次洗脱，收集样品并编号。实施例4肽段样品的加热蒸干将除盐后的肽段样品用1.5mL进口离心管平均分装成四等分，每等份体积为 300 μ L，分别用90°C加热蒸干、70°C加热蒸干、50°C加热蒸干和常温真空抽干(作对照)对肽段样品进行浓缩干燥。90°C加热蒸干打开离心管盖，置于金属浴90°C加热至管内液体剩 100yL-200yL时，取出离心管，盖上管盖，漩涡震荡Imin后15000g离心5min。打开管盖后放回金属浴90°C加热至蒸干。70°C加热蒸干打开离心管盖，置于金属浴70°C加热至管内液体剩 100yL-200yL时，取出离心管，盖上管盖，漩涡震荡Imin后15000g离心5min。打开管盖后放回金属浴70°C加热至蒸干。50°C加热蒸干打开离心管盖，置于金属浴50°C加热至管内液体剩 100yL-200yL时，取出离心管，盖上管盖，漩涡震荡Imin后15000g离心5min。打开管盖后放回金属浴50°C加热至蒸干。常温真空抽干打开离心管盖，放入常温真空抽干机抽干为止。上述四种方式处理的相同肽段样品所需时间如表1所示。由表1可以看出，优选 90°C加热蒸干时，快速高效，大大缩短了处理时间。表1不同浓缩干燥方式所需时间
权利要求
1.一种浓缩干燥肽段样品的方法，其特征在于所述方法包括采用加热蒸干的方式使肽段样品溶液蒸发，且肽段样品溶液为中性溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述加热蒸干的温度不超过90°C。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述加热蒸干的温度为50 90°C。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述加热蒸干的温度为80 90°C。
5.根据权利要求1 4任意一项所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤A.对蛋白质样品进行酶解消化，制备得到中性的肽段样品溶液；B.用加热蒸干的方式使肽段样品溶液蒸发。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤B包括将肽段样品溶液置于 1. 5mL离心管内，加热使离心管内样品溶液蒸发至体积剩余100-200 μ L时，对离心管进行震荡处理，使蒸发过程中残留在管壁的肽段溶解于离心管内剩余的样品溶液中，离心，使样品溶液甩至离心管底，继续加热，直至溶液完全蒸发。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法在步骤A和步骤B之间还包括将步骤A处理后的样品，进行高效液相色谱分离和/或除盐处理。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述酶解消化为溶液内酶解消化或者胶内酶解消化。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤B中加热蒸干采用的仪器为金属浴。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述对离心管进行震荡处理为涡旋震荡处理 l-5min，离心为 13000_15000g，离心 3-lOmin。
全文摘要
本发明涉及蛋白质和多肽加工处理方法，具体公开了一种浓缩干燥肽段样品的方法，包括采用加热蒸干的方式使肽段样品溶液蒸发，加热温度为不超过90℃，且肽段样品溶液为中性溶液。本发明的浓缩干燥方法具有操作简易、快速有效、成本低廉等优点，整个处理时间是其他方法如常温真空抽干时间的3/20，所获得的浓缩肽段样品能够满足后续研究分析的需要。
文档编号C07K1/00GK102180946SQ201110062169
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者刘瑶谨, 李启沅, 李鑫, 林志龙, 林梁 申请人:深圳华大基因科技有限公司