专利名称：一种机体保护多肽(bpc 157肽)的制备方法
技术领域：
本发明属于肽工程领域，具体涉及机体保护多肽(BPC 157肽)的制备方法，尤其适用于放大生产。
背景技术：
BPC 157 (body protection compound)为胃液妝(gastric juice peptide)的片段，由15个氨基酸组成，分子量1419。氨基酸序列为Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-A la-Asp-Asp-AlaAly-Leu-Val (甘-谷-脯-脯-脯-甘-赖-脯-丙-天冬-天冬-丙-甘-亮-缬)。
BPC 157具有细胞保护、抗溃疡和抗炎作用，其作用和细胞保护、NO系统、细胞迁移有关
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发明内容
本发明的目的是提供一种固相合成BPC157肽的制备方法，为机体保护多肽(BPC 157肽)的应用提供原料保障。包括手工固相多肽合成法和微波自动固相多肽合成法，以适用于放大生产。本发明提供的技术方案具体为一种BPC157肽的固相制备方法，包括以下步骤以三苯氯甲基树脂为合成树脂，包括4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂，以以上树脂中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获的保护的BPC157肽树脂，其间依次脱去 Riioc 保护基团，用 DIC/HOBt 或 DIC/HOAt 或 B0P/H0Bt 或 B0P/H0At 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的BPC157肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC157肽粗品，并经C18或C8 色谱柱进行分离纯化，获得所需的BPC157肽纯品。更具体地，按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护BPC157肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法包括以下步骤(1)制备 Fmoe-Val-树脂选用三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、 2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂中任一种树脂，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10 60分钟，混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g ；然后在上述的树脂中，加入 DIEA、DIC或DMAP、Fmoc-Val-OH, 10 50°C反应0. 5 5小时，再加入封闭试剂甲醇、苯甲酰氯或吡啶10 50°C反应0. 2-3小时，树脂用异丙醇、N, N-二甲基甲酰胺洗涤，获得 Fmoc-Val-树脂；DIEA或DMAP的摩尔数为树脂的2 20倍；Fmoc-Val-OH的摩尔数为树脂的1 10倍反应溶液中，树脂的浓度为0. 1 5ml/g ；(2)制备 Fmoc-Leu-Val-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°c反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-0H、DIEA、TBTU/H0Bt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Leu-Val-树脂；所说的脱帽试剂的组分和体积比为PIP DMF = 1 2_5，下同；Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的1-5倍；Fmoc-Val-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5 20ml/g ；TBTU/HBTU/B0P的摩尔数为树脂的2_5倍；Η0ΒΤ/Η0ΑΤ摩尔数为树脂的2_5倍；(3)制备 Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂在步骤⑵的Fmoc-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟， 用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°c反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次， DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍；其余操作以及工艺条件同上；(4)制备 Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(3)的Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30 分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala_0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(5)制备 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤⑷的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp (otBu) -0H、 DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50 °C 反应 10 60 分钟， 用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上； (6)制备 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(5)的 Fmoc-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂 10
50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Asp (otBu) -OH.DIEA.TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(7)制备 Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(6)的Fmoc-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Ala-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(8)制备 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(7)的Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应 10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF 溶解的 Fmoc-Pro-0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂； Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(9)制备 Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(8)的Rnoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂中， 加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用洗涤异丙醇3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Lys (Boc) -OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(10)制备 Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Va 1-树脂在步骤(9)的 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用 DMF 溶解的 Rnoc-Gly-0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -树脂树脂；Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上； (11)制备 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le U-Val-树脂在步骤(10)的 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le u-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-0H、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -A Ia-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(12)制备 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gl y-Leu-Val-树脂在步骤(11)的 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gl y-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF 洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (ο tBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(13)制备 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Al a-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(12)的 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Al a-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/ HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤 3 次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (ο tBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍
其余操作以及工艺条件同上；(14)制备 Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-As ρ (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨在步骤(I3)的 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otB u)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干， 重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次， 重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Glu (otBu) -OH.DIEA.TBTU/HOBt 或 HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Glu (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(15)制备 Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(14)的 Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上； (16)制备 Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨在步骤(15)的 Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp ( otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟， 用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次， DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0. 5 3小时，抽干，用氮气吹干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；(17)把吹干的 Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20 10°C的切肽试剂(TFA/EDT/H20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)，10°C _50°C反应 1-5 小时，过滤除去树脂，加-20 10°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1 6次，低温冷冻干燥10 M小时，获得BPC157肽粗品；切肽试剂中，树脂的浓度为8_12ml/g按照本发明，粗品经C18或C8色谱柱纯化的方法包括如下步骤流动相有两种=A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 1 %三氟乙酸加99. 9 %乙腈;梯度洗脱；流速为l-150ml/min ；检测波长为215 观5歷；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品。在本文中，如未特别指出，“常温”表示室温，即25°C。尽管理论上有DIC/DMAP 或 DIC/HOBt 或 DIC/HOAt 或 BOP/HOBt 或 BOP/HOAt 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt 或 HATU/HOBt 或 HATU/HOAt 或 HCTU/HOBt 或 HUTC/HOAt 或 TBTU/ HOBt等试剂可以选择，而且理论上也没有重大区别。但是令人意想不到的是，尽管小试阶段各试剂效果差异不显著，但是进入中试阶段(即，实验放大)，我们发现，相对于其他试剂组合，用TBTU/HOBt反应粗品纯度较好，小试试验粗品纯度达到78%以上，而中试批量生产粗品纯度也能在基本不降低产率的条件下达到75%，经过纯化的成品，纯度大于98%，不低于95%的药用纯度要求。本发明的有益效果是本发明的BPC157肽固相合成制备方法具有以下特点原辅材料来源方便，工艺稳定，收率高，质量可控，产品纯度高，生产周期短，成本低，可规模化生产。采用本发明方法制备的BPC157肽极具市场竞争力，其生产规模完全能够满足BPC157 肽的应用需求，其质量完全能够达到BPC157肽的应用要求。另外，在本发明的工艺中，采用温和的Fmoc路线，每步脱Fmoc仅用20 %的PIP，每步缩合反应时间短，大大缩短了生产周期；采用合理封闭技术，提高粗肽产品的纯度；切割采用TFA，避免了常用的氟化氢，减少了生产中产生的三废，有利于工业化生产。前述过程中所采用的原料中英文列表如下
权利要求
1.制备BPC157肽的方法，其特征在于包括如下步骤以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂其中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得保护的BPC157肽树脂，其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用N，N- 二异丙基碳化二亚胺/1-羟基-苯并-三氮唑、N，N- 二异丙基碳化二亚胺/ N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑/N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑_N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 /N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 /N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑或6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯八-羟基-苯并-三氮唑中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的BPC157肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC157肽粗品，任选经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所说的BPC157肽。
2.根据权利要求1所述的方法，制备过程中用微波辐射以加快反应速度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备Fmoc-Val-树脂以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王氏树脂其中的一种作树脂，用N，N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10 60分钟，混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g ；然后在上述的树脂中，加入DIEA、DIC或DMAP、Fmoc-Val-OH, 10 50°C反应0. 5 5 小时，再加入封闭试剂甲醇、苯甲酰氯或吡啶10 50°C反应0. 2-3小时，树脂用异丙醇、N， N-二甲基甲酰胺洗涤，获得Fmoc-Val-树脂； DIEA或DMAP的摩尔数为树脂的2 20倍； Fmoc-Val-OH的摩尔数为树脂的1 10倍 反应溶液中，树脂的浓度为0. 1 5ml/g ；(2)制备Fmoc-Leu-Val-树脂在步骤(1)的Fmoc-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤 3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Leu-Val-树脂； 所说的脱帽试剂的组分和体积比为PIP DMF=I 2-5，下同； Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的1_5倍；Fmoc-Val-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5 20ml/g ； TBTU/HBTU/B0P的摩尔数为树脂的2_5倍； Η0ΒΤ/Η0ΑΤ摩尔数为树脂的2-5倍；(3)制备Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂在步骤⑵的Fmoc-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-0H、DIEA、TBTU/H0Bt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂； Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍； 其余操作以及工艺条件同上；(4)制备Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤⑶的Fmoc-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟， 用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次， DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala-0H、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(5)制备Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30 分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp (otBu)-0H、 DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50 °C 反应 10 60 分钟， 用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(6)制备Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(5)的Fmoc-Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50 0C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，异丙醇洗涤3次，用DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Asp (otBu) -0H.DIEA,TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-树月旨； Fmoc-Asp (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(7)制备Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(6)的 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60 分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Ala-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨； Fmoc-Ala-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(8)制备Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(7)的 Fmoc-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应 10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨； Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(9)制备Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨 在步骤(8)的 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应 10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt 或BOP/HOBt 的混合物，10 50°C 反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2 次，抽干，获得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂； Fmoc-Lys (Boc) -OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(10)制备Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(9)的 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用 DMF 溶解的 Rnoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -树脂树脂；Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(11)制备Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Va 1-树脂在步骤(10)的 Fmoc-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-V al_树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂 10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala -Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(12)制备Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Le U-Val-树脂在步骤(11)的 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le u-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otB U) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(13)制备Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gl y-Leu-Val-树脂在步骤(12)的 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gl y-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF 洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -A sp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂；Fmoc-Pro-OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(14)制备Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (ot Bu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(1 的 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Al a-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Glu (otBu) -OH.DIEA,TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF 洗涤 3 次，重蒸过的 DMF 洗涤 2 次，抽干，获得 Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc )-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂； Fmoc-Glu (otBu) -OH摩尔数为树脂的2 5倍 其余操作以及工艺条件同上；(15)制备Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asρ (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨在步骤(14)的 Fmoc-Glu (otBu)-ftO-ftO-ftO-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-A sp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤 3次，重蒸过的DMF洗涤2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反应10 60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3 次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；Fmoc-Gly-OH摩尔数为树脂的2 5倍其余操作以及工艺条件同上；(16)制备Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp (otB U) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂在步骤(15)的 Fmoc-Gly-Glu (otBu)-ftO-ftO-ftO-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树脂中，加入脱帽试剂10 50°C反应5 30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10 50°C反应10 60分钟，抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0. 5 3小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-A la-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-树月旨；(17)粗品的获得把吹干的 Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu )-Ala-Gly-Leu-Val-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20 10°C的切肽试剂(TFA/ EDTM20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)，10°C _50°C 反应 1-5 小时，过滤除去树脂， 加-20 10°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1 6次，低温冷冻干燥10 24小时，获得BPC157肽粗品；切肽试剂中，树脂的浓度为5 50ml/g。
4.根据权利要求3所述的方法，其还包括粗品经C18或C8色谱柱分离纯化的步骤。
5.根据权利要求3所述的方法，其中粗品经C18或C8色谱柱分离纯化的步骤为将BPC157肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18或C8色谱柱纯化，流动相有两种A 0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为l_150ml/ min ；检测波长为215 ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，冻干，获得成品。
6.权利要求3所述的方法，其中TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物优选是 TBTU/HOBt的混合物。
7.权利要求3所述的方法，其如实施例1或2所述。
全文摘要
本发明公开了一种合成机体保护多肽(BPC 157肽)的方法，包括以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂中的任何一种为起始原料，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护机体保护多肽(BPC 157肽)树脂，其后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC 157粗品，再经C18(或C8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得机体保护多肽(BPC 157肽)纯品。该方法可用微波辐射以加快反应速度，缩短多肽合成周期，降低生产成本。本发明的方法制备的机体保护多肽(BPC 157肽)，具有原辅材料来源方便，工艺稳定，接肽收率高，质量可控，收率高，纯度高，生产成本低，周期短，可规模化生产等诸多优点，完全满足机体保护多肽(BPC 157肽)的应用要求。
文档编号C07K1/04GK102229649SQ20111011480
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者张英起, 杨赛, 王增禄 申请人:中国人民解放军第四军医大学