专利名称：一种从獐芽菜提取獐芽菜苦甙的制备方法
技术领域：
本发明属于天然产物化学的技术领域，具体涉及一种从獐芽菜提取獐芽菜苦甙的制备方法。
背景技术：
猜牙菜(False Chinese Swertia Herb),拉丁名为 Swertia davidi Franch,属龙胆科(Gentian-aceae)，主产于中国，印度，尼泊尔等国。多年生草本，直立。茎四棱无髓光滑，单叶对生，无柄呈披针形或长披针形。花两性，花冠裂片上部具紫色小斑点，中部具两个黄褐色大斑点，花萼裂片近相等，花冠幅状每裂片基部有1-2个腺体，民间称为水黄连、水灵芝、河风草、鱼胆草、青鱼胆草等。土家族群众用于治疗肺热、黄疸、恶疮疥癣、急性肠炎等症。临床应用獐芽菜制剂，对急性菌痢也有较好疗效，其提取物对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用。獐芽菜全草具有退黄快、降谷丙转氨酶明显以及缩小肝肿大的作用，而分离的环烯酸萜类化合物对大鼠十二指肠、子宫和脾等器官起抗胆碱功能。这些成分在人体或动物体内可能是通过以下两种作用方式起药效一种是直接作用，另一种是间接作用也称为辅助神经调节作用。直接作用是指獐芽菜的部分有效成分通过吸收或注射进入体内，参与机体的防御活动，对入侵病菌细胞壁的主要成分胞壁酸的合成起抑制作用，从而达到抑制病菌在体内繁殖或直接杀灭病菌的效果；间接作用是指獐芽菜其他有效成分进入体内后，对分布于肝、脾以及肠胃末端的耙细胞起生理刺激作用，从而引起相应生理器官分泌激素，这些激素能刺激局部神经产生动作电位，进而通过神经传导，最终引起大脑皮层活动，促进垂体分泌腺体活动，实现全身性神经调节功能，达到抵制和吞噬细菌的侵入。自20世纪七、八十年代国内就有不少科研院所对獐芽菜的成分进行研究，当时研究的侧重点大部分是其提取物化学成分的组成和结构鉴定。如孙洪发等在獐芽菜中黄酮成分的分离与鉴定一文中表明，獐芽菜经硅胶及聚酰胺柱层析分离到3种化合物，分别鉴定为异红草甙、龙胆苦甙和齐墩果酸。虞瑞生等1984年对分离产物进行先硅胶柱层析再重结晶等步骤处理，可得到乌苏酸和咕吨酮等成分。此前的报道还从提取方法上介绍了极性溶媒和非极性溶媒在提取过程中对有效成分的溶解差异，只有极少数人对獐芽菜药理治疗领域的作用感兴趣。到90年代，獐芽菜的研究重点逐渐从有效成分的分离、组成和鉴定转向于獐芽菜在人体内的治病机理和在动物体内的抗感染肝炎试验，胡若琪等1991年做了獐芽菜苦甙对老鼠肝病理形态学影响的研究，研究表明獐芽菜苦甙能有效地保护肝细胞，防止或减轻肝细胞损伤，并能促进肝细胞修复。在此期问，獐芽菜有效成分的结构研究更加深入，中国医学科学院谭沛等、上海医药工业研究院孔德云等对獐芽菜化学成分研究已进入分子水平，他们从分子领域分别证实了裂环环烯醚萜甙和木脂素等有效成分的差别，为今后从事这方面的研究做出了巨大贡献。本世纪以来，獐芽菜的研究侧重于从各个具体、细微的角度来分析对动物或人类疾病治疗的结果。主要是采用物理或化学方法以及更先进的分离手段从獐芽菜中提取一些微量有效成分，结合其他中草药的有效成分，制成高效复合丸对人或动物在保肝、降火和解毒进行有针对性的试验，结果表明高效复合丸中的獐芽菜苦甙能被皮肤表面吸收，经人体酸及酶分解后的产物可扩张毛细血管，使动脉血管旺行，对肝炎有很好的预防和治疗效果。国内外对獐芽菜苦甙的含量检测和药理等方面进行了研究，对小规模提取较高纯度的獐芽菜苦甙未见报道。为此，我们以獐芽菜全草为原料，采用柱层析、结晶与重结晶等手段进行大规模的制备獐芽菜苦甙纯品，作为主治药物与其它成分进行配制，广泛应用于治疗肺热、黄疸、恶疮疥癣、急性肠炎等患者的药物。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种方法简单、成本低、便于工业化生产，所得产品纯度高、杂质少的高纯度獐芽菜苦甙的制备方法。本发明采用的技术方案包括干燥过后的獐芽菜全草经用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，脱色，结晶和重结晶制得高纯度獐芽菜
苦I^o因此，本发明提供一种从獐芽菜中提取獐芽菜苦甙的方法，步骤包括(1)粉碎干燥獐芽菜，并将獐芽菜、70%乙醇按重量(kg)/体积比(V) = 1 1-3 进行混合，加热回流提取；(2)过滤除渣后，减压浓缩至无乙醇味；(3)上大孔吸附树脂LSA_20(西安蓝晓科技有限公司提供)进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为乙醇溶液，将洗脱物进行浓缩，直至获得干燥物；(4)加入70%乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色，再进行浓缩直至获得干燥物；(5)加入90 %乙醇进行加热溶解，然后加入过量石油醚，室温过夜结晶，过滤得结晶物，再进行重结晶得高纯度獐芽菜苦甙。在一个实施方案中，步骤1中为70%的乙醇(用0. lmol/L盐酸调节pH6.0左右)， 优选在45 °C下进行加热搅拌提取。在一个实施方案中，步骤2的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。在一个实施方案中，其中步骤3中，LSA-20层析柱的洗脱液为60-70%的乙醇溶液。在一个实施方案中，步骤5中加入过量石油醚。在另一个实施方案中，步骤4中所加入的70%乙醇、活性碳，其体积(V)/重量 (kg)比=14-10 1。在另一个具体实施方案中，步骤6的结晶和重结晶温度是4°C直至室温。技术效果1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本；2、本纯化过程中采用的分离材料是大孔吸附树脂LSA-20，其分离操作过程简单，易得便宜，易控制。3、采用结晶和重结晶进行纯化，工艺简单，易于操作，纯化效率高。4、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收的常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。5、经过长期摸索，本发明确定了采用加入过量石油醚在室温条件下进行结晶，獐芽菜苦甙的纯度是最高，可达到90. 17-92. 53%。
图1 从獐芽菜中提取獐芽菜苦甙的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。图2 獐芽菜苦甙标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例1 粉碎干燥獐芽菜100kg，加入70%乙醇300L(用0. lmol/L盐酸调节 pH6. 0左右)，45°C加热回流提取池，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至50L (无乙醇味)，然后浓缩液上大孔吸附树脂LSA-20柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物，将洗脱物进行浓缩至干。再用70%乙醇50L加热溶解，加5kg颗粒活性碳进行脱色30min，再浓缩至干， 无水乙醇2L溶解后，再加热水混勻，加入过量石油醚，然后室温结晶Mh，过滤得结晶物，再进行重结晶得到高纯度獐芽菜苦甙。经检测，AgilentllOO高效液相色谱仪，色谱柱为Alltimal C18柱 (250mmX4. 6mm，5 μ m)，流动相为45%甲醇、0. 025%磷酸的水溶液；检测波长为237nm ；流速为lml/min ；进样量为20 μ L。甜茶素样品的纯度为90. 56%，结果如表1和图1所示。实施例2 粉碎干燥獐芽菜150kg，加入70%乙醇400L(用0. lmol/L盐酸调节 pH6. 0左右)，45°C加热回流提取池，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至60L (无乙醇味)，然后浓缩液上大孔吸附树脂LSA-20柱，用60%乙醇洗脱得到洗脱物，将洗脱物进行浓缩至干。再用70%乙醇70L加热溶解，加5kg颗粒活性碳进行脱色30min，再浓缩至干， 无水乙醇4L溶解后，再加热水混勻，加入过量石油醚，然后室温结晶Mh，过滤得结晶物，再进行重结晶得到高纯度獐芽菜苦甙。按照实施例1的方法进行纯度检测，纯度为90. 17%, 结果如表1所示。实施例3 粉碎干燥獐芽菜200kg，加入70%乙醇500L(用0. lmol/L盐酸调节 pH6. 0左右)，45°C加热回流提取池，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至90L (无乙醇味)，然后浓缩液上大孔吸附树脂LSA-20柱，用70%乙醇洗脱得到洗脱物，将洗脱物进行浓缩至干。再用70%乙醇90L加热溶解，加8kg颗粒活性碳进行脱色30min，再浓缩至干， 无水乙醇5L溶解后，再加热水混勻，加入过量石油醚，然后室温结晶Mh，过滤得结晶物，再进行重结晶得到高纯度獐芽菜苦甙。按照实施例1的方法进行纯度检测，纯度为92. 53%, 结果如表1所示。
实施例4:粉碎干燥獐芽菜400kg，加入70%乙醇700L(用0. lmol/L盐酸调节 PH6. 0左右)，45°C加热回流提取池，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至120L(无乙醇味)，然后浓缩液上大孔吸附树脂LSA-20柱，用60 %乙醇洗脱得到洗脱物，将洗脱物进行浓缩至干。再用70%乙醇100L加热溶解，加9kg颗粒活性碳进行脱色30min，再浓缩至干，无水乙醇6L溶解后，再加热水混勻，加入过量石油醚，然后室温结晶Mh，过滤得结晶物，再进行重结晶得到高纯度獐芽菜苦甙。按照实施例1的方法进行纯度检测，纯度为 92. 34%，结果如表1所示。表 权利要求
1.本发明提供一种从獐芽菜中提取獐芽菜苦甙的方法，步骤包括(1)粉碎干燥獐芽菜，并将獐芽菜、70%乙醇按重量(kg)/体积比(V)= 1 1-3进行混合，加热回流提取；(2)过滤除渣后，减压浓缩至无乙醇味；(3)上大孔吸附树脂LSA-20(西安蓝晓科技有限公司提供)进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中洗脱液为乙醇溶液，将洗脱物进行浓缩，直至获得干燥物；(4)加入70%乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色，再进行浓缩直至获得干燥物；(5)加入90%乙醇进行加热溶解，然后加入过量石油醚，室温过夜结晶，过滤得结晶物，再进行重结晶得高纯度獐芽菜苦甙。
2.根据权利要求1的方法，步骤1中为70%的乙醇(用0.lmol/L盐酸调节pH6. 0左右)，在45 °C下进行加热搅拌提取。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤2中过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤3中LSA-20层析柱的洗脱液为30-80%的乙醇溶液。
5.根据权利要求4的方法，其中步骤4中所加入的70%乙醇、活性碳，其体积(V)/重量(kg)比=14-10 1。
6.根据权利要求6的方法，其中步骤6中结晶和重结晶温度是4°C直至室温。
全文摘要
本发明提供了一种从獐芽菜提取獐芽菜苦甙的制备方法，属于天然产物化学的技术领域。干燥过后的獐芽菜经用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液减压浓缩，脱色，结晶和重结晶制得高纯度獐芽菜苦甙。结晶和重结晶纯化獐芽菜苦甙工艺筒单，易于操作，纯化度高。
文档编号C07H17/04GK102241716SQ20111014101
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月29日 优先权日2011年5月29日
发明者向华, 唐忠海 申请人:唐忠海