用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

专利名称：用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法
用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法本申请涉及用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法，其包括以下步骤:提供含代谢活性细胞的水性培养基；使水性培养基与疏水性有机溶液接触；从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有催化脂肪酸的β-氧化反应的至少一种酶降低了活性。此外，本发明涉及代谢活性细胞用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，与其野生型相比，所述细胞的催化脂肪酸的β -氧化反应的酶具有降低的活性，所述酶优选选自FadA、FadB, FadD, FadL和FadE及其变体，更优选FadE变体。由替代石化燃料的再生原料出发制备精细化工产品的方法的根本问题在于要将一旦得到的通常首先存在于大量的水相之中的产物转移入疏水性有机相中。一方面，为了能够实现中间广物或最终广物的浓缩以及为了能够实现可能地在后续反应步骤中在有机溶液中的合成处理，另一方面，为了通过去除所希望的产物来提高在水相中的反应的产率，或者尤其是当产物的存在由于对生产菌株的毒性或者对相关生物催化剂的抑制而通过该产品不利地影响反应进展时，首先在技术上有意义的范畴内实现该反应，这种转移是必要的。将通常以低 浓度存在的产物由大量的水相中直接加热浓缩是不合适的。传统以石油中所含烃类起始制成的工业上有大量需求的这样的产品的例子是12-氨基月桂酸(ALS)或其甲酯(ALSME)。在生产例如用于生产基于尼龙的管道系统的聚合物时，ALS是一种重要的起始产物。传统上，以石化原料起始，在具有低产率的过程中经由月桂内酰胺制备ALS，月桂内酰胺通过以下步骤来合成:将丁二烯三聚化，随后氢化形成环十二烷，接着氧化成环十二酮，与羟胺进行反应，并随后进行贝克曼重排。在W02009/077461中描述了一种用于生物技术制备ALS或ALSME的大有前景的新路线。可以使用如在EP11154707中所述的一种液体离子交换剂，在两相体系中进行基于该路线的生物技术方法。通过萃取将一种产物从水相加工进入到疏水性有机相中的前提条件首先是:该产物具有足够的倾向，在包括不可相互混合的水性亲水相和有机疏水相的两相系统中进入到有机相中，这决定性地取决于各化合物的物理化学特性。具有高比例未被取代的烃的化合物或者仅由未被取代的烃构成的化合物主要富集在疏水相之中，而具有高比例极性基团如含杂原子的官能团的化合物且非常特别是具有电荷的化合物主要或者实际上仅仅存在于水相之中，这使得转移到有机相中变得困难。通常借助于分配系数，例如根据能斯特方程来描述平衡调节之后化合物在所述两相系统中的分配a =C^1ZC相 2。一种特殊的分配系数是Kot也称作P-值，该系数表征了辛醇相与水相之间化合物的分配平衡:Kow = P = C辛醇/C水从疏水相处理产物的另一个前提条件在于，分配已经达到了通过上述方程描述的平衡状态或者至少足够接近 于平衡状态。平衡的调节尤其通过两个相之间接触面的大小来确定，在生物技术方法中，这通常是非限制性的因素，因为通过由于维持高的代谢活性细胞密度总归必要的措施诸如水性培养基与疏水性有机溶液的通气和充分搅拌，已增加了接触面。但在能够有效处理这样一种反应混合物之前，将两相分离是必要的，在所述混合物中所述疏水性有机溶液主要存在于胶束或者其它亚区室之中。将纯水与纯有机疏水性溶剂混合时，如果经常自动形成两个相而无其它协助的情况下，那么由于多种可能的相互作用，将不太容易从复杂的水性培养基中分离出有机疏水性溶液，并且在没有技术支持的情况下，例如通过离心分离会持续数时甚至数天。对于通过生物技术工艺大规模生产工业需求的化学化合物而言，在开发和应用用于节约资源而快速地生产和处理如ALS的化合物的方法时，在此背景下，相分离的过程是很重要的一个因素。如果在大型反应器中必须从大体积的水相中提取总是溶解于疏水性有机溶液中的产物并且随后对其进行处理，那么除了本来的与生产相关参数诸如底物的类型和数量、培养基的温度和氧含量之外，也要优化疏水性溶液的分离，以便节约资源并且使得整个过程尽可能环保。尤其要提及的是，许多大规模使用的疏水性有机溶剂至少在较长时间接触的情况下对生物技术应用的生物有毒性作用，且在这种背景下为保护生物技术使用的菌株，和为防止细胞溶解时释放的不希望的副产物污染甚至分解目标产物，希望缩短水性培养基中的生物与溶剂之间的接触时间。因此，本发明以下述目的为基础，即提供用于在两相体系中以生物技术生产的产品的改进的制备和生产方法，所述两相体系包括含代谢活性细胞的水性培养基和疏水性有机溶液。该目的尤其是要在给定的时间窗口之内在过程的快速性和/或从水性培养基分离出疏水性有机溶液的程度方面更好分离出疏水性有机溶液和萃取溶于其中的以生物技术生产的产品。本发明基于的另一个目在于提供可用于生物技术的细胞，所述细胞对源自疏水性溶液的对这样的细胞的毒性具有高耐受性。此外，本发明基于下述目的，即提供用于制备疏水性化合物的生物技术方法以及适用于该方法的细胞，在所述方法中降低了耗氧量。通过本申请的主题并且尤其也通过所附的独立权利要求的主题达成了所述这些目的和另外的目的，其中由从属权利要求得出实施方式。在第一方面中通过包括以下步骤的方法达成了作为本发明的基础的目的a)提供包含代谢活性细胞的水性培养基，b)使该水性培养基与疏水性有机溶液接触，c)从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反应 的酶。在第一方面的第一实施方式中，所述催化脂肪酸的氧化反应的酶是选自下述的酶:FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，优选是FadE或其变体。在第一方面的第二实施方式中涉及一种方法，其中所述有机溶液包含至少一种选自下列的溶剂:其在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
在第一方面的第三实施方式中涉及一种方法，其中所述有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。在第一方面的第四实施方式中，所述细胞具有重组的烷烃羟化酶。在第二方面中，通过使用代谢活性细胞用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液从而达成了作为本发明的基础的目的，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB, FadD, FadE 和 FadL 及其变体，更优选 FadE。在第三方面中通过使用敲除催化脂肪酸的β -氧化反应的酶作为代谢活性细胞的基因组成部分用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液从而达成了作为本发明的基础的目的，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，还更优选FadE变体或其变体。在第四方面中通过一种细胞从而达成了作为本发明的基础的目的，与其野生型相t匕，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶，其进一步包含重组的单加氧酶，更优选包含烷烃羟化酶。在第四方面的第一实施方式中，所述目的通过一种细胞得以达成，其中所述催化脂肪酸的β -氧化反应的酶是选自FadA、FadB, FadD, FadE和FadL及其变体的酶，更优选是FadE变体或其变体。在第五方面中通过反应混合物从而达成了作为本发明的基础的目的，所述反应混合物包含具有代谢活性细胞的水溶液和疏水性有机溶液，其中，与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶。在第五方面的第一实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述催化脂肪酸的β -氧化反应的·酶是选自FadA、FadB, FadD, FadE和FadL及其变体的酶，更优选是FadE变体或其变体。在第五方面的第二实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液包含选自下列的至少一种溶剂:在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。在第五方面的第三实施方式中，通过一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述代谢活性细胞是具有重组的烷烃羟化酶和转氨酶，此外优选选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶的细胞。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述细胞是低级真核细胞或者是原核细胞，优选是大肠杆菌。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中所述细胞是重组的细胞。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中，所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少5%，优选至少20%。在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方式中，通过一种方法、一种用途和一种反应混合物达成了所述目的，其中，在接触时，所述水性培养基的PH值在5 9，更优选在6 8之间。本发明的发明者已发现，如果与其野生型相比，代谢活性细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反应的酶，则能令人惊奇地从含所述代谢活性细胞的水性培养基中分离出疏水性有机溶液。此外，本发明的发明者惊奇地发现，在生物技术方法中，在可比较的目标产物的生产效率下，与其野生型相比，具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶的代谢活性细胞具有较小的耗氧量和较高的产物产率与耗氧量之比。并未意在绑定于任何一一种理论，本发明人推测，至少一种催化β -氧化反应的酶的活性降低导致水性培养基中作为去垢剂起作用的不明代谢物的浓度降低，从而一方面在培养细胞时在搅动培养基的条件下疏水性溶液和位于水性培养基中对溶剂敏感的代谢活性细胞之间的接触面减小，这导致细胞的溶剂应激减少，且另一方面在断开搅拌装置之后促进形成分离相。可将根据本发明的教导用于改进所有生物技术方法，所述生物技术方法包括使用代谢活性细胞制备诸如精细 化学品之类的产物，该代谢活性细胞的培养在水性培养基中进行和使用疏水性有机溶液处理该产物。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“代谢活性细胞”理解为具有代谢活性的活细胞，优选以活性形式表达或更优选过表达与令人感兴趣的产物的生物技术制备相关的酶的细胞。所述细胞可以是一种包括古生菌(Archaea)的原核生物，或者是真核生物，在原核生物的情况中优选选自下述属:假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和埃希氏菌属(Escherichia)。在一种还更优选的实施方式中，所述细胞是细菌细胞，还更优选是革兰氏阴性细菌细胞，最优选是大肠杆菌。在另一种优选的实施方式中，涉及真核细胞，更优选是真菌细胞，还更优选是酵母细胞，最优选是酵母菌(Saccharomyces)或者假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia),尤其是热带假丝酵母(Candida tropicalis)。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“低级真核生物”理解为在其存在的所有阶段中为单细胞的真核生物，与之相反的是高级真核生物，其生命的大部分以具有包含分化细胞的组织的多细胞生物的形式渡过。在具体的实施方式中，术语“细胞”与本发明中的术语“微生物”同义并且可交换使用。此外，所述细胞可以是分离的细胞或者多种细胞的混合物。本领域技术人员已知大量适合于维持或者培养细胞，尤其是在生物技术上有重要意义的细胞的水性培养基。其中同样包括完全培养基如LB-培养基、基本培养基如M9-培养基以及选择性培养基，例如含高盐浓度的并因此使得只有嗜盐或者至少耐盐的生物体才能生长的那些。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“水性培养基”理解为基于水的反应培养基，该培养基就其所有相关因素而言，尤其是PH-值、盐含量和温度，具有如此性质，以至于其维持或者促进包含于其中的细胞优选微生物的生活力，并且水性培养基和疏水性有机相均以液体形式存在。可以在微生物和分子生物学教科书中获悉各种在生物技术上有重要意义的细胞的温度要求，例如Fuchs/Schlegl，2008。在一种优选的实施方式中，在接触时，所述水性培养基的pH-值在4 9之间，更优选在4.5 8.5之间，最优选在6.5 7.5之间。在另一种优选的实施方式中,所述温度在O 45°C之间,更优选在15 40°C之间，最优选在20 37°C之间。本领域技术人员已知许多可使用的溶剂，以制备疏水性有机溶液。在一种优选的实施方式中，如在.此所使用的一般，将术语“疏水性的”理解为，在液体状态下，在液体水相存在下，形成单独的与水相清楚划清界限的液相的一种液体的特性。后者可以是连续的液相或者是乳状液。在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“疏水性的”理解为基本上不溶于水的化合物的特性。最后，在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，如此理解该术语，使得这样称谓的化合物具有其常用对数大于0，优选大于0.5,还更优选大于I且最优选大于2的P-值(J.Sangstar, Octanol-ffater PartitionCoefficients:Fundamentals and Physical Chemistry,卷 2Wiley Series in SolutionChemistry, John Wiley & Sons,Chichester, 1997)。优选的有机溶剂包括,但并非局限于，选自下列的溶剂:在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。所述疏水性有机溶剂也可以是包含多于一种的疏水性有机溶剂的混合物。脂肪酸的β -氧化是一种很普遍的代谢途径，其完全一样地允许原核生物和真核生物氧化脂肪酸并且使得其中所含的化学能可用于代谢(Fujita等人，2007)。就广义而言，该氧化开始于将脂肪酸吸收到细胞之中，在大肠杆菌的情况中，通过引导脂肪酸通过革兰氏阴性细菌细胞的外膜和内膜的转运蛋白FadL(Black，1991)和将CoA酯形式的脂肪酸释放到胞质溶胶之中的FadD基因产物(Black等人，1992)。如果条件需要，在这里首先将脂肪酸在CoA脂肪酸酯的β -位置通过酰基辅酶A-脱氢酶，在大肠杆菌的情况中则通过FadE (Campbell和Cronan, 2002)氧化。或者也可以借助于2,4-二烯酰辅酶A-还原酶,在大肠杆菌的情况中则借助于FadH，由双不饱和脂肪酸通过还原反应形成类似的分子。随后，多功能酶催化形成仲·醇的水合作用及其随后的生成酮的氧化，所述多功能酶是烯酰辅酶A-水合酶/3-羟基酰基辅酶A-脱氢酶，在大肠杆菌的情况中则为FadB。在最后一步中，3-酮酯酰辅酶A-硫解酶，在大肠杆菌的情况中则为FadA，催化酮酯酰辅酶A的裂解，从而释放出乙酰辅酶A和与起始分子相比缩短了两个碳原子的CoA-酯。如果还不是乙酰辅酶A，则可以将后者重新送入到β_氧化循环之中，并且将其氧化缩短。FadR也参与调节脂肪酸的氧化，FadR是Fad操纵子的调节子，其包含降解脂肪酸所需的基因，FadR没有催化β_氧化反应。在一种优选的实施方式中，将术语“催化脂肪酸的β_氧化反应的酶”理解为直接与脂肪酸底物或者与在降解成乙酰辅酶A的途径中由此产生的分子相互作用的任何一种酶，优选将所述产生的分子识别为底物，并且催化其在该降解途径中更接近于乙酰辅酶A的代谢产物的转化，优选包括实现了将脂肪酸吸收到细胞之中的脂肪酸输入蛋白(Importer)。按照上述定义，例如酰基辅酶A-脱氢酶就属于这些酶，因为其与脂肪酸辅酶A-酯相互作用并且催化其生成烯酰辅酶A的转化，在β -氧化的代谢途径上烯酰辅酶A比脂肪酸辅酶A-酯更接近于乙酰辅酶Α。在一种特别优选的实施方式中，如在此所使用的一般，将术语“催化脂肪酸的β -氧化反应的酶”理解为选自大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD,FadL和FadE和/或其变体或者得自其它生物的同源物的任何一种酶。大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体以及大量其它生物技术可使用的生物体的同源物及其核酸-和多肽序列描述于现有技术中，例如登录号为AP009048.1的FadA，登录号为 BAE77457.1 的 FadB,登录号为 BAA15609.1 的 FadD,登录号为 BAA77891.2 的 FadE 以及登录号为BAA16205.1的FadL。本发明的教导并非只能使用这里所述的生物大分子的确切氨基酸序列或核酸序列来实施或应用于这里所述的生物大分子的确切氨基酸序列或核酸序列上，例如通过敲除编码催化β_氧化反应的酶的基因，而是也可以使用这类大分子的变体来实施或应用于这类大分子的变体上，所述变体可以通过删除、加成或取代一个或多于一个氨基酸或核酸来获得。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语核酸序列或氨基酸序列的“变体”，在下文中与术语“同源体”含义相同并且可以互换，表示就相应的最初的野生型核酸序列或氨基酸序列而言具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分值的同源性(这里与同一性同义使用)的另一种核酸序列或氨基酸序列，其中优选删除或取代那些与形成催化活性中心的氨基酸或者对于结构和折叠而言必要的氨基酸不同的氨基酸，或者仅仅保守取代后者，例如谷氨酸替代天冬氨酸，或者亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可使用的算法来计算两个序列的同源性程度，例如Arthur Lesk (2008), Introduction tobioinformatics, 3rd edition。在本发明的另一种更优选的实施方式中，氨基酸序列或核酸序列的变体优选除了具有上述序列同源性之外，还基本上具有与野生型分子或最初的分子相同的酶的活性。例如，一种作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与该多肽酶相同或者基本上相同的蛋白水解活性，也就是催化肽键水解的能力。在一种具体的实施方式中，术语“基本上相同的酶活性”表示就野生型多肽的底物而言的活性，其明显高于本底活性，并且/或者比就相同底物而言的野生型多肽具有的Km-值和/或者值相差小于3个，更优选2个，还更优选一个数量级。在另一种优选的实施方式中，所述核酸序列或氨基酸序列的“变体”包含该核酸序列或氨基酸序列的至少一个活性部分/或者片段。在另一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语“活性部分”表示具有小于氨基酸序列全长的长度或者编码小于氨基酸序列全长的长度的氨基酸序列或核酸序列，其中所述具有长度小于野生型氨基酸序列的氨基酸序列或者经编码的氨基酸序列基本上具有与野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如作为脂肪酸输入蛋白、作为烯酰辅酶A-水合酶或FadE，或者作为乙酰辅酶A-酰基转移酶或FadB。在一种具体的实施方式中，术语核酸的“变体”包括核酸、其互补链，优选在严格条件下结合在野生型核酸上。对于本领域技术人员而言杂交反应的严格性可容易地确定，且通常取决于探针长度、洗涤时的温度和盐浓度。一般来说较长的探针需要较高的温度用于杂交，相反对于较短的探针则较低的温度即可。一般来说是否发生杂交取决于变性DNA融合在其周围存在的互补链上的能力，更确切地说在低于熔融温度的情况下。Ausubel等人于1995年比较详细地描述了杂交反应的严格性和相应的条件。借助于杂交用于鉴别DNA序列的说明，本领域技术人员尤其可参阅手册BoehringerMannheim GmbH 公司(Mannheim,德国，1993)的手册“The DIG System Users Guide forFilter Hybridization，，以及 Liebl 等人的文章(International Journal of SystematicBacteriology 41:255-260 (1991))。在一种优选的实施方式中，所述杂交在严格的条件下进行，这意味着仅在探针和靶序列(即用探针处理过的多核苷酸)至少70%相同时，才形成杂交物。已知，通 过改变缓冲液组成、温度和盐的浓度影响或确定包括洗涤步骤在内的杂交严格性。通常，杂交反应在比洗漆步骤严格性相对低的条件下进行(Hybaid HybridisationGuide,Hybaid Limited, Teddington,UK, 1996)。例如在大约 50°C 68°C温度下可以将一种相当于5xSSC缓冲液的缓冲液用于杂交反应。在此也可以用具有与探针序列的同一性少于70%的多核苷酸杂交探针。这样的杂交物较不稳定，并被在严格条件下的洗涤去除。这可例如通过降低盐浓度到2x SSC和任选地随后到0.5x SSC来实现(The DIG System User' sGuide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim,德国，1995),其中以如下递增的优选顺序调节温度:大约50°C 68°C，大约52°C 68°C，大约54°C 68°C，大约56V 68°C，大约58V 68°C，大约60°C 68°C，大约62°C 68V’大约64V 68°C，大约66°C 68°C。优选大约64°C 68°C或者大约66°C 68°C的温度范围。任选可以将盐的浓度降低到相当于0.2x SSC或者0.1x SSC的浓度。通过以大约I 2°C的步距将杂交温度从50°C逐步提高到68°C，可例如以如下递增的优选顺序分离出多核苷酸片段，所述片段与所用核酸分子序列的同一性至少为70 %或者至少80 %或者至少90 %，至少91 %，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或者至少99%。另外的用于杂交的说明是以所谓的试剂盒形式市购可得的(例如Roche Diagnostics GmbH公司德国曼海姆的DIG Easy Hyb，目录号1603558)。在一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语核酸的“变体”包括在遗传密码的简并度范畴内编码与最初的核酸相同的氨基酸序列或者该氨基酸序列的变体的任意核酸序列。随着现代遗传学、微生物学和分子生物学方法的发展，提供了很多可用来常规测定和影响存在于活细胞中的酶的活性的工具给本领域技术人员。为了确定以悬浮液、颗粒形式存在或者能够以经过处理的形式从细胞培养中除去的酶的活性，可以使用酶标准测试法并评价，如同教科书(例如Comish-Bowden, 1995)中所述的一样。现有技术公开了许多专门适合于测定催化脂肪酸的β_氧化反应的酶的活性的测试方法，例如在Kameda &Nunn(1981)、Marrakchi 等人(2003)、Lobo 等人(2001)和 Xu 等人(2011)中。在现有技术中，例如在Maniatis等人(1989)中或者在Fuchs & Schlegl (2007)中，也描述了通常可用于降低细胞中酶的活性的方法，例如通过暴露在放射性辐射下使得细胞非定向突变，随后富集或者筛选突变体；通过定 向引入点突变或者通过敲除整合在细胞中染色体的用于编码活性酶的基因。在Fad-基因产物的特殊情况下，转录阻抑物例如FadR的过度表达(Fujita等人，2007)也有助于降低活性。也可以基于RNA-干扰(Tuschl，2001)或者使用特异性抑制剂来降低活性。在一种优选的实施方式中，表述“其中与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的酶”，如在此所使用的一般，表示相对于野生型细胞中相同的酶的活性，在经修饰的细胞中酶的活性降低。在一种优选的实施方式中，相对的活性的减少以如下递增的优选顺序为:5、10、20、40、50、75、90、95、99%或更高百分比。在一种特别优选的实施方式中，相对于背景不再检测出酶的活性。在根据本发明的方法的第二步骤中，水性培养基与疏水性有机溶液接触。在本发明的一种优选的实施方式中，如在此所使用的一般，术语“接触”表示水性培养基与有机溶液直接接触，而无中间插入的水性培养基和/或者疏术性有机溶液无法逾越的机械屏障，例如无机膜。例如可将水性培养基引入发酵罐中，并且将有机溶液加入到同一个发酵罐中的培养基之中，使得两种液体可以混合。在一种优选的实施方式中，至少部分在搅动、通入气体或者采取适合于增大两相接触面积的类似措施下进行接触。在第二步骤之后，从水性培养基中分离出疏水性有机溶液。由于该系统固有的形成两相的能力，这对于本领域技术人员来说是易于进行的过程，其可简单地通过静置容器且随后滗析其中一相来进行。或者可使用分液漏斗。在沸点差别足够大的情况中，也存在通过施加负压抽出在较低温度下沸腾的相的可能性，该相通常是有机相。可以使用如氢化钙、无水氯化钙、硅胶、无水硫酸钠、氢氧化钠等无机干燥剂去除残留在有机相中的少量水。可以使用常见的疏水性有机溶剂进行根据本发明的方法，所述溶剂包括在室温下为液态的取代和未被取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。本身并非液体的疏水性有机溶剂也适合，只要它是作为一个整体的为液态的溶剂混合物的一部分。在此可任选考虑，很多溶剂对代谢活性细胞或多或少有毒性作用。如果细胞至少应当暂时保持其代谢活性，那么就应使用毒性作用适度或者根本没有毒性作用的疏水性有机溶剂的浓度。在一种特别优选的实施方式中，所述溶剂是具有至少八个碳原子、优选至少十二个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸，例如月桂酸、油酸或芥酸或者其甲酯。在另一种优选的实施方式中，所述溶剂是式为CH3-(CH2)x-COOH的脂肪酸，式中乂可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或者更多。在另一种优选的实施方式中，涉及具有双键的不饱和脂肪酸，尤其优选在位置9具有一个双键，特别优选油酸。在另一种特别优选的实施方式中，所述溶剂是己酸。应如此安排疏水性有机溶液的体积，使得有机相可容易地被分离出来，且在一种优选的实施方式中，有机相构成水性培养基和疏水性有机溶液的总体积的2 98%，优选5 95%，还更优选为10 40%，最优选为20 30%。通常选择能够制备特别需要的产物的细胞作为代谢活性细胞。特别有利的是，为此使用重组的细胞。在一种优选的实施方式中，将术语“重组”如在此一般理解为，被称为重组体、引入到“重组细胞”之中的核酸分子并非是取自自然、而是使用分子生物学或者化学合成方法制备的核酸分子，或者被称为重组体的细胞包括重组核酸分子或者由其编码的多肽。用于制备重组核酸分子和细胞的常规分子生物学方法描述在现有技术中，例如在Sambrook 等人(1989)或者 Schlegl & Fuchs (2007)中。此外,如果所述细胞具有或者,特别优选过度表达,生成产物或者产物的前体或中间体的酶，则是特别有 利的。这可通过将包含编码所述酶的核酸分子的载体通过转换或诸如此类的引入细胞之中，或者将对酶进行编码的核酸分子掺入细胞的基因组成，例如染色体之中来实现。对于许多生物技术上重要的细胞种类例如大肠杆菌来说，可用于表达或者过表达核酸分子的合适的方法和载体是已知的，例如PET或pGEX型的载体，以及适合于其表达的细胞(Moffatt & Studier (1986), Rosenberg 等人(1987)和 Studier 等人(1990)。如果使用代谢活性细胞，以代谢疏水性有机溶剂，或者使用疏水性有机溶剂作为底物来催化化学反应，则特别适用根据本发明的方法。所述酶包括烷烃羟化酶。在一种特别优选的实施方式中，如用于此的“烷烃羟化酶”是催化将烷烃氧化成醇、醛/酮和/或氧化成羧酸、优选主要氧化成醇的酶。在现有技术中已描述了大量烷烃羟化酶，例如在Grant等人(2011)或者Koch等人(2009)中。在一种特别优选的实施方式中，所述烷烃羟化酶是“alkB型的烷烃羟化酶”。AlkB是得自恶臭假单胞菌的AlkBGT体系的一种氧化还原酶，其因其羟化酶活性而众所周知。这取决于两种另外的多肽，AlkG和AlkT。AlkT被表征为FAD依赖性红素氧还蛋白还原酶，其将电子从NADH转移到AlkG上。AlkG是一种红素氧还原蛋白，一种含铁的氧化还原蛋白，可用作AlkB的直接电子供体。在一种优选的实施方式中，如在此使用的术语“alkB型烷烃羟化酶”被理解为膜结合的烷烃羟化酶。在另一种优选的实施方式中，将同一术语“alkB型烷烃羟化酶”理解为多肽，所述多肽具有递增优选的至少75、80、85、90、92、94、96、98或者99%的与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)Gpol (数据库代码:CAB54050.1，该代码以及本文中使用的所有其它数据库代码均源自于2011年11月9日发布的NCBI的基因库蛋白质数据库)的AlkB的序列的序列同源性。这里所使用的术语“序列”可以涉及多肽的氨基酸序列和/或者对其进行编码的核酸序列。可以首先使用该方法氧化并随后胺化脂肪酸或其酯。例如国际专利申请W02009/077461中所述的一种酶系统就适合于此。在该情况下，所述代谢活性细胞是具有重组烷烃羟化酶和转氨酶的细胞，除此之外，优选选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶。在一种优选的实施方式中，将在此使用的术语“醇脱氢酶”理解为将醒或酮氧化成相应伯醇或仲醇的酶。实例包括真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、乳酸短乳杆菌(Lactobacillus brevis) (ΥΡ_795183.I)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri) (ACF95832.1)的醇脱氢酶，得自马肝的，异氧硝化-好氧反硝化菌(Paracoccus pantotrophus) (ACB78182.1)和矢野口鞘氨醇菌(Sphingobiumyanoikuyae) (EU427523.1)的醇脱氢酶及其各自的变体。在一种优选的实施方式中，将在此所使用的术语“转氨酶”理解为催化α -氨基从供体分子优选氨基酸转移到受体分子优选α_酮羧酸的酶。例如可以使用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) ATCC12472 (数据库代码NP_901695)的转氨酶。在一种优选的实施方式中，将在此使用的“丙氨酸脱氢酶”理解为催化在消耗水和NAD+的条件下L-丙氨酸转化成丙酮酸、氨和NADH的酶。例如可以使用源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)(数据库代码L20916)、豆科根瘤菌(RhizobiumIeguminosarum)(数据库代码 CP001622)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolytikus)(数据库代码 AF070716)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(数据库代码 X63069)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(数据库代码AB013821)的丙氨酸脱氢酶。本发明不仅涉及根据本发明的方法，也涉及敲除催化脂肪酸的氧化反应的酶作为代谢活性细胞的 基因组成部分，用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更优选FadE。如果在任意一种方法中存在将疏水性有机溶液从包含代谢活性细胞的水性培养基中分离的必要性，则根据本发明，使用敲除了至少一种催化脂肪酸的氧化反应的酶，所述酶选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL，更优选FadE，来替代没有相应的脂肪酸代谢修饰的代谢活性细胞，即与其野生型相比，催化脂肪酸的β_氧化反应的酶的活性没有改变或甚至提高的细胞，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD, FadE和FadL，更优选FadE。无论是否要使用所述代谢活性细胞来制备脂肪酸或者其衍生物或者可以经由β -氧化代谢途径降解的其它分子，均可使用这种Fad基因的敲除。在一种优选的实施方式中，在此所使用的术语“敲除”可理解为，与其野生型细胞相比，减少基因或者其基因产物的转录和/或转译，例如通过删除基因的一部分或者整个基因，通过在适当的位点插入终止密码子，通过去除启动子的必要部分，或者通过去除核糖体结合位点。在一种最优选的实施方式中，根据本发明的方法包括步骤:a)提供含代谢活性细胞的水性培养基；b)使所述水性培养基与疏水性有机溶液接触和C)从所述水性培养基中分离出疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有降低的FadE变体或其变体的活性，所述代谢活性细胞是大肠杆菌的重组菌株，该菌株具有重组的烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT或其变体，以及重组的转氨酶，并且所述疏水性有机溶剂包括得自月桂酸或己酸或其甲酯与一种不饱和脂肪酸的混合物，所述不饱和脂肪酸优选油酸或芥酸，最优选油酸，其中优选油酸或芥酸与月桂酸或己酸或其甲酯的比例为20: 80 80: 20，优选 20: 80 40: 60。在一种最优选的实施方式中，根据本发明的方法是用于制备ω-氨基羧酸的方法，包括步骤:a)提供含代谢活性细胞的水性培养基；b)使所述水性培养基与疏水性有机溶液接触；c)从所述水性培养基 中分离出疏水性有机溶液，其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶，其中所述细胞优选是大肠杆菌，且所述催化脂肪酸的β -氧化反应的酶是FadE，并且除此之外所述还通过基因技术改变了所述的细胞，使其能够生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此优选，其具有包含烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT，任选醇脱氢酶和ω -转氨酶的重组酶体系。在另一种最优选的实施方式中，本发明涉及一种细胞，其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶，其中所述细胞优选是大肠杆菌，且所述催化脂肪酸的β_氧化反应的酶是FadE，并且除.此之外所述还通过基因技术改变了所述的细胞，使其能够生成比其野生型更多的ω-氨基羧酸，由此优选，其具有包含烷烃羟化酶，优选源自恶臭假单胞菌的AlkBGT，任选醇脱氢酶和ω -转氨酶的重组酶体系。以下将通过附图和非限制性实施例来阐述本发明，可以从这些附图和示例中获得本发明的其它特征、实施方式、方面和优点。附

图1 展示了在制备 ALSME 时使用 AFadE-突变体 W3110 Λ FadE [alkB_alaD_TA](以下也称作“AFadE”)(左侧)以及和除了缺少AFadE-缺失之外相同的菌株W3110[alkB-alaD-TA](以下也称作野生型(“WT”)(右侧)在相分离时的区别。箭头所指为十分钟之后在突变体的情况中有机相和水相明显的分离，相反，在使用另一菌株时，相同时间之后还是不能辨识相分离。附图2展示了与附图1相同的实验，除了降发酵后的反应介质装入离心管中。附图3展示了在与附图1中相同的实验中两种菌株的以0TR(oxygen transferrate/氧传递速率)形式的氧输入量和以CTR(carbon dioxide transfer rate/二氧化碳传递速率)形式的二氧化碳排出量，。附图4展示了在与附图1中相同的实验中在培养基中随时间变化的ALSME的浓度。附图5展示了如实施例2中所述的月桂酸甲酯(LSME)的反应中各种产物的浓度，即氨基月桂酸(ALS)、氨基月桂酸甲酯(ALSME)、ω-羧基月桂酸(DDS)、ω-羧基月桂酸甲酯(DDSME)、ω-羟基月桂酸(HLS)、ω-羟基月桂酸甲酯(HLSME)和ω-氧代月桂酸(OLS)。作为菌株研究ΔFadE-(附图5a)、野生型(W3110)(附图5b) >ΔFadL-(附图5c)以及具有Δ FadE和Δ FadL的菌株(附图5d)。附图6展示了实施例2中所述试验的OTR-曲线(附图6a)和CTR-曲线(附图6b)。
附图7展示了在实施例2中观察到的在使用Λ FadE-、野生型(W3110)-、Δ FadL-和Λ FadE/ Δ FadL-菌株制备ALSME时在相分离时的区别。箭头所指为十分钟之后在突变体的情况中有机相和水相明显的分离，相反，在使用野生型菌株时，相同时间之后还是不能辨识相分离。实施例1:以生物技术制备氨基月桂酸甲酯时使用ΛFadE-突变体加速分离水相与疏水相使用菌株W3110 AFadE[alkB-alaD-TA]和 W3110 [alkB-alaD-TA]在 DASGIP 的8联平行发酵体系中将月桂酸甲酯生物转化为氨基月桂酸甲酯。如W02009077461中所述，W3110[alkB-alaD-TA]是大肠杆菌W3110的一种菌株，包括一种基于pBR322的具有氧化-和转氨化体系的质粒，所述氧化-和转氨化体系包括氧化还原酶AlkB、丙氨酸脱氢酶和转氨酶。除了缺失编码FadE的基因，W3110AFadE[alkB-alaD_TA]与后一种菌株相同，并因此该菌株没有酰基辅酶A-脱氢酶活性。使用I升反应器进行发酵。借助于两点校准法，用pH4.0和pH7.0的标准溶液校准pH探针。将300mL饮用水注入反应器中，在121°C温度下高压灭菌20分钟，以保证无菌。接着使p02-探针在DASGIP体系上过夜(至少6小时)极化。次日早晨在净化工作台下移出水，并代之以含有100mg/L氨苄西林的300mL高细胞密度培养基。随后用单点校准法(搅拌器:400rpm/供气:10sL/h空气)校准p02_探针，并且借助于就地清洗法对进料段、修正剂段和诱导剂段进行清洗。为此用70%乙醇、接着使用lMNaOH、然后使用灭菌去离子水冲洗软管，最后灌入各自的培养基。将生产ALS和ALSME的大肠杆菌菌株首先由各自的低温培养物在含有100mg/L氨苄西林的LB培养基中(25mL在IOOmL三角烧瓶中)，在37°C温度和200rpm下过夜培养大约18小时。接着将每2 mL培养物用100mg/L氨苄西林接种在高细胞密度培养基中(葡萄糖15g/L(30mL/L单独高温高压灭菌的500g/L母液，含有1% MgS04*7H20和2.2% NH4Cl)，(NH4)2SO4L 76g/L，K2HP0419.08g/L，ΚΗ2Ρ0412.5g/L，酵母萃取物 6.66g/L，二水合柠檬酸三钠
2.24g/L，单独高温高压灭菌的I %的母液的柠檬酸铁铵溶液17mL/L，单独高温高压灭菌的母液(HCl (37% )36.50g/L, MnCl2*4H20L 91g/L, ZnS04*7H20L 87g/L,乙二胺四乙酸二水合物 0.84g/L, H3BO30.30g/L, Na2Mo04*2H200.25g/L, CaCl2*2H204.70g/L, FeS04*7H2017.80g/L,CuC12*2H200.15g/L))的微量元素溶液5mL/L(每菌株25mL置于IOOmL三角烧瓶中)，然后在37°C /200rpm下继续培养5.5小时。在W3110AFadE[alkB-alaD_TA]的情况中，在600nm下的培养液的光密度测定为6.9，在13110[&11^-&1&014]的情况中为7.4。为了对光密度为0.1的反应器接种，在5mL注射器中各抽取4.0mL或4.4mL( Λ FadE)(在无菌条件下)，并且借助于插管经由用70%乙醇覆盖的隔膜对反应器进行接种。使用以下标准程序:
权利要求
1.方法，其包括以下步骤 a)提供含代谢活性细胞的水性培养基， b)使水性培养基与疏水性有机溶液接触， c)从水性培养基中分离出疏水性有机溶液， 其中，与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的氧化反应的酶。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述催化脂肪酸的氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL或其变体的酶，优选FadE或其变体。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述有机溶液包含至少一种选自下列的溶剂:在室温下为液态的取代和未取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的方法，其中所述细胞具有重组的烷烃羟化酶。
6.代谢活性细胞的用途，所述细胞用于从含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液，与其野生型相比，该细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β -氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL及其变体，更优选FadE。
7.敲除催化脂肪酸的氧化反应的酶的用途，所述酶优选选自FadA、FadB,FadD,FadE和FadL或其变体，更优选FadE变体，其作为用于从含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的代谢活性细胞的基因组成的部分。
8.细胞，与其野生型相比，该细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶，还包含重组的单加氧酶，更优选包含烷烃羟化酶。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL变体或其变体的酶，更优选是FadE或其变体。
10.反应混合物，其包含具有代谢活性细胞的水溶液和疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β_氧化反应的酶。
11.根据权利要求10所述的反应混合物，其中所述催化脂肪酸的β-氧化反应的酶是选自FadA、FadB、FadD、FadE和FadL或其变体的酶，更优选是FadE或其变体。
12.根据权利要求10 11中任一项所述的反应混合物，其中所述疏水性有机溶液包含选自下列的至少一种溶剂在室温下为液态的取代和未取代的链烷烃、环烷烃、环烯烃、芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和杂芳基化合物。
13.根据权利要求10 12中任一项所述的反应混合物，其中所述疏水性有机溶液包含具有多于12个碳原子的脂肪酸或其酯，优选油酸、芥酸或者月桂酸甲酯。
14.根据权利要求I 5中任一项所述的方法,根据权利要求6 7中任一项所述的用途，或者根据权利要求10 13中任一项所述的反应混合物，其中所述代谢活性细胞是具有重组的烷烃羟化酶和转氨酶的细胞，此外优选包含选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的至少一种酶。
15.根据权利要求I 5和14中任一项所述的方法，根据权利要求6 7和14中任一项所述的用途或者根据权利要求10 14中任一项所述的反应混合物，其中所述细胞是低级真核细胞或者原核细胞，优选是大肠杆菌。
16.根据权利要求I 5和14 15中任一项所述的方法，根据权利要求6 7和14 15中任一项所述的用途或者根据权利要求10 15中任一项所述的反应混合物，其中所述细胞是重组细胞。
17.根据权利要求I 5和14 16中任一项所述的方法，根据权利要求6 7和14 16中任一项所述的用途或者根据权利要求10 16中任一项所述的反应混合物，其中所述疏水性有机溶液构成疏水性有机溶液和水性培养基的总体积的至少5%，优选至少20%。
18.根据权利要求I 5和14 17中任一项所述的方法，根据权利要求6 7和14 ·17中任一项所述的用途或者根据权利要求10 17中任一项所述的反应混合物，其中，在接触时，所述水性培养基的pH值在5 9，更优选在6 8之间。
全文摘要
本申请涉及用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法，其包括以下步骤提供含代谢活性细胞的水性培养基；使水性培养基与疏水性有机溶液接触；从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有至少一种降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶。本发明还涉及一种代谢活性细胞用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，与其野生型相比，所述细胞具有降低了活性的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体，更优选FadE变体或其变体。
文档编号C07C227/40GK103254089SQ20121059941
公开日2013年8月21日 申请日期2012年12月21日 优先权日2011年12月22日
发明者H-G·亨内曼, S·沙费尔, M·韦泽尔, T·哈斯, J·吉伦, K·贝泽, S·哈夫凯姆艾尔, M·波埃特厄尔, F·厄尔哈特, M·席贝尔胡特 申请人:赢创工业集团股份有限公司