腐蚀稳定性色谱分析用配体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，如，基于免疫球蛋白结合蛋白的配体，如，葡萄球菌A蛋白，以及制备和使用所述配体的方法。
【专利说明】腐蚀稳定性色谱分析用配体
[0001]本申请是申请日为2009年12月23日的第200911000241.1号发明名称为“腐蚀稳定性色谱分析用配体”的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求申请号为N0.61/203,664，申请日为2008年12月24日的美国临时专利申请的优先权，其全部内容在此全部并入本申请。
【技术领域】
[0004]本发明涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，例如，基于免疫球蛋白结合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配体，以及包含此类配体的色谱分析基质。
【背景技术】
[0005]在亲和色谱分析中使用的配体通常赋予对靶分子的高选择性，因此导致了对靶分子的高收率以及快速而经济的纯化。基干葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂以及色谱分析基质达到了在捕获和纯化抗体的亲和色谱分析中的广泛应用，并且由于其结合IgG而对免疫球蛋白和抗体的亲和性没有显著影响的能力，其同样广泛应用于抗体检测方法。
[0006]据此，已经开发了多种包含A蛋白一配体的试剂以及介质，并且在商业上可获得，包括，例如，ProSepi) — vA High Capacity, ProSep? VA Ultra 和 ProSqj?UltraPlus (Millipore)及 Protein A Sepharose?, MabSelect?, MabSelect Xtra? 和MabSelect SuRe.丨((GE Healthcare)和 Poros MabCapture A? (Applied Biosystems)。
[0007]为了维持色谱分析`用配体(所述配体包括，如，包含基于SpA的色谱分析用配体的树脂)的选择性和结合能力，需要对配体结合树脂(称作色谱分析基质)进行清洁，并且通常在碱性条件下清洗，如，使用氢氧化钠。举例来说，用于清洗和复原基质的标准过程是一种原位清洗(Cleaning-1n-place，CIP)的碱性方案，一般包括使用pH14的IM NaOH对基质进行处理。但是，这种不太温和的处理经常是不期望的，当配体是ー种蛋白或是基于蛋白的分子时尤其如此。
【发明内容】
[0008]本发明提供了具有碱稳定性的基于SpA的色谱分析用配体，例如，其能够耐受重复的原位清洗(CIP)循环。更特别的是，基于本发明的配体可以在延长的时间中耐受传统的碱性清洗，这使得所述配体成为引人注目的候选物，特别是对于免疫球蛋白进行低成本高效率且高水平的纯化而言尤为如此。
[0009]在本发明的ー个方面，碱稳定性色谱分析用配体包含两个或更多个SpA结构域。例如，在这方面的一些实施方式中，提供了碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于ー个位点。[0010]在基于该方面的一些实施方式中，所述配体包含三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的B结构域或者三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述三个或更多个B结构域或者三个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在另一些实施方式中，所述配体包含四个或更多个SpA B结构域或者四个或更多个SpA Z结构域，所述四个或更多个B结构域或四个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在其它实施方式中，所述配体包含五个或更多个SpA B结构域或五个或更多个SpA Z结构域；或包含六个或更多个SpA B结构域或六个或更多个SpA Z结构域；或包含七个或更多个SpA B结构域或七个或更多个SpAZ结构域，所述五个或更多个B结构域或五个或更多个Z结构域，六个或更多个B结构域或六个或更多个Z结构域，七个或更多个B结构域或七个或更多个Z结构域，被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。
[0011]基于本发明的另一方面，碱稳定性色谱分析用配体包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于η + I位的一个或多个突变为除半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、丙氨酸(Α)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸残基。在一些实施方式中，η代表分离的SpA结构域的23位天冬酰胺残基。在分离的SpA结构域的24位具有突变的示例性配体如表1所示，其中η代表天冬酰胺。
[0012]表1
[0013]`
【权利要求】
1.一种碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域。
2.一种碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，其中所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域在色谱分析树脂的多于一个位点上附着于树脂。
3.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含三个或更多个SpA B结构域或者三个或更多个SpA Z结构域。
4.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含四个或更多个SpA B结构域或者四个或更多个SpA Z结构域。
5.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含五个或更多个SpA B结构域或者五个或更多个SpA Z结构域。
6.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含六个或更多个SpA B结构域或者六个或更多个SpA Z结构域。
7.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含七个或更多个SpA B结构域或者七个或更多个SpA Z结构域。
8.前述权利要求任一项的碱稳定性色谱分析用配体，进一步包括至少一个氨基酸的突变以改变与Fab的结合。
9.权利要求8的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述突变包括在第29位丙氨酸取代甘氨酸。
10.一种色谱分析基质,包含权利要求1 一 9任一项所述的配体。
11.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步骤: (a)提供含有一种或多种免疫球蛋白的样品； (b)在一种或多种免疫球蛋白同基质结合的条件下，将样品与权利要求10的基质接触；和 (C)通过在适宜的条件下洗脱而回收一种或多种结合的免疫球蛋白。
12.权利要求1一 9任一项所述的配体,其中所述配体在0.5M NaOH中温育5小时后，或10小时后,或15小时后,或20小时后,保留其至少95%的结合能力。
13.权利要求1一 9任一项所述的配体,其中所述配体与WtSpA相比能够结合至少1.5倍，或2倍，或3倍，或更多的IgG。
14.一种碱稳定性色谱分析用配体，包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于η + I位的一个或多个突变为除半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、丙氨酸(Α)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸残基，其中所述η代表天冬酰胺。
15.一种碱稳定性色谱分析用配体，包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于η + I位的一个或多个突变为选自精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(Ε)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(Μ)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、 苏氨酸(Τ)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)组成的组中的氨基酸的氨基酸残基，其中η代表天冬酰胺。
16.权利要求14或15所述的配体，其中η是第23位的天冬酰胺。
17.一种腐蚀稳定性亲和色谱分析基质，包含三个或更多个，或者四个或更多个，或者五个或更多个，或者六个或更多个，或者七个或更多个通过多位点附着而附着于固体支持物上的SpA B结构域或Z结构域。
18.—种鉴定基于SpA的腐蚀稳定性色谱分析用配体的方法，所述方法包括如下步骤: (a)以腐蚀剂处理基于SpA的配体； (b)将腐蚀剂处理过的SpA配体加入到多孔板中； (c)将所述基于SpA的配体与饱和量的第一种免疫球蛋白接触，以使得所述第一种免疫球蛋白结合所述配体； (d)将所述结合的第一种免疫球蛋白与能够结合所述第一种免疫球蛋白的分子接触，其中所述分子与可检测物质偶联；和 (e)检测来源于所述物质的信号量， 其中所述信号量与配体的腐蚀稳定性是成比例的，因此可以确定所述基于SpA的配体具有腐蚀稳定性。
19.权利要求18所述的方`法，其中所述分子是第二种免疫球蛋白。
【文档编号】C07K14/31GK103601794SQ201310478275
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2009年12月23日 优先权日:2008年12月24日
【发明者】N·卞, N·索伊斯, S·斯佩克特, K·莱文 申请人:Emd密理博公司