一种王不留行刺桐碱单体的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种从中药材王不留行中分离刺桐碱单体的方法，属中药【技术领域】。其制备工艺为王不留行种子脱脂，乙醇回流提取；二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取；制备型薄层层析；高效制备液相分离，减压浓缩，干燥即得。采用理化性质鉴别、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振技术确定其化学结构。本发明方法简单快速，所需溶剂少，得率较高，具有较高的经济价值和学术价值。
【专利说明】—种王不留行刺桐碱单体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种王不留行刺桐碱单体的制备方法，属中药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]王不留行(Vaccaria segetalis)为双子叶植物石竹科麦蓝菜的干燥成熟种子，为常见中药，具有下乳消肿、活血通经功效。主要含有三萜皂苷，黄酮苷，环肽，类脂和脂肪酸等成分。
[0003]制备型薄层(preparativethin-layer chromatography, PTLC)的制备量由薄层板的厚度、面积、所使用的吸附剂决定。通常使用的20cmX20cm的硅胶薄层板可以制备10-50mg的样品。该方法操作简便，类似于硅胶柱层析，可以较好地分离Rf值相差较大的样品O
[0004]制备型高效液相色谱(preparativehigh performance liquid chromatography,PHPLC)以分离、富集和纯化组分为目的，是制备单体的必要手段。与其他分离手段相比，PHPLC具有以下特点:(1)柱效高，其填料为细颗粒多孔材料，提高了分离效率；(2)适宜多种样品，包括非离子型和离子型、非极性和极性、小分子和大分子、热稳定和热不稳定化合物；(3)可在线检测，根据目标产物的理化性质可配备紫外检测器(UV)、二极管阵列检测器(PDA)、荧光检测器(FD)、蒸发光散射检测器(ELSD)等不同类型检测器；(4)连续自动化操作。与分析型高效液相色谱相比，最大的操作区别就是超载进样，包括体积超载和质量超载:(1)体积超载指配制较小的样品浓度，增加进样体积，但有时样品体积过大，会使分辨能力下降；(2)质量超载指 配制的样品浓度较大，但进样体积小，这要求样品组分在流动相中有良好的溶解性，防止样品在柱顶部形成沉淀。因此，实际操作时，会兼顾并结合两种操作方式。
[0005]化合物结构解析采用的波谱技术主要包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)等。IR谱图以1300cm-l为分界线，较高波数区为特征频率区(4000~1300cm-l)，反映存在的官能团，较低波数区为指纹区(1300~400cm-l)，仅反映一个化合物整体特征。该方法特征性强、快速方便、样品用量少、能分析各种状态的样品。
[0006]UV谱图可以反映结构中生色团和助色团的特性，用来推测不饱和基团的共轭关系，以及共轭体系中取代基的位置、种类和数目等。目前多采用LC/UV技术，利用二极管阵列检测器(PDA)检测，能够快速、灵敏地在线获取样品每个色谱峰的UV谱图。
[0007]MS可以提供化合物的相对分子质量、分子式、碎片离子等化学结构信息，是天然产物结构分析可靠、灵敏的方法之一。目前多与HPLC联用(ES1-MS，APC1-MS)，应用Q-TOF作为质量分析器，就可以测得碎片离子峰的精确质量数，从而为化合物结构解析提供更多有利的信息。
[0008]NMR技术在天然化合物结构解析中占据着极其重要的地位，可以提供丰富的化合物结构信息。一维氢谱(1H-NMR)谱图中，通过化学位移值δ可以知道不同出峰位置的官能团，通过耦合场数J的大小和裂分峰型可以了解一个氢与其邻碳上的氢间的两面夹角，分析化合物构型与构象。一维碳谱(13C-NMR)谱图主要提供化合物的碳骨架信息，每条谱线一般都有它的唯一性，能够快速、准确地否定拟定的错误结构式。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种王不留行刺桐碱单体的制备方法。
[0010]本发明的技术方案:
[0011]所述王不留行刺桐碱的制备方法，其制备工艺为王不留行种子经石油醚脱脂，75%乙醇85°C回流提取，减压浓缩至干，去离子水复溶，水饱和正丁醇萃取得正丁醇相，再用硅胶GF254板，以展开剂为正丁醇:乙酸乙酯:水=4:1: 5的薄层层析制备；C18柱高效制备液相分离得刺桐碱。
[0012]所述王不留行刺桐碱的结构鉴定方法，经理化性质鉴定、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振技术确定其结构。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是紫外254nm时的TLC结果图；图2是样品的制备HPLC图；图3是样品的红外图；图4是样品的全波长扫描图；图5是样品的质谱图；图6是样品的1H-NMR图；图7是样品的13C-NMR图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1:王不留行刺桐碱的制备工艺
[0015]王不留行种子经粉碎，4倍石油醚常温脱脂24h，晾干。用10倍量75%乙醇溶液，85°C回流提取2次，每次2h。过滤去渣，合并滤液，减压浓缩至无乙醇，去离子水复溶。再依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇等体积各萃取4次，得到的水饱和正丁醇萃取相，减压浓缩至干，去离子水复溶，真空干燥得干粉，备用。
[0016]将水饱和正丁醇萃取物干粉用90%甲醇水溶液溶解，配制成浓度为20mg/mL的样品溶液，毛细管点样，硅胶GF254板的载样量为15mg。展开剂为正丁醇:乙酸乙酯:水=4:1: 5(上层)，将点完样品的硅胶板放入已饱和的层析缸中，密闭，待展开距离至16cm，取出硅胶板，晾干。将硅胶板置于紫外灯254nm下检视，根据观察到的暗斑，将其分为七个部分(图1，紫外254nm时的TLC结果)，分别刮板收集，再用甲醇提取出各组分，减压浓缩至干，去离子水复溶，真空干燥得干粉，备用。
[0017]将第2部分的干粉按以下制备液相色谱条件分离并收集保留时间为23.593min的峰。柱子:ffaters SunFire? Prep C180BD?(19X 150mm，5 μ m)；流速:4mT,/miη ;柱温:30°C ;检测波长:220nm ;流动相:甲醇(A)-水(B);梯度洗脱=O-1Omin, 20% A ；10-20min,20% -40% A ；20-25min,40% A ；25-35min,40% -100% A ;35_45min，100% A ;进样量:5mg。将保留时间为23.593min的峰的样品收集溶液减压浓缩至干，超纯水复溶，真空干燥得干粉，备用。
[0018]实施例2:王不留行刺桐碱的结构鉴定
[0019]取0.5mg备用干粉(制备液相法所得，下同)溶于4mL去离子水中，并滴加2滴盐酸，使之呈酸性。再滴加碘化铋钾试剂，观察溶液的变化。出现桔红色沉淀，即为阳性反应，说明样品为生物碱类物质。
[0020]干燥环境下，用溴化钾直接压片后，采用傅里叶红外光谱仪检测备用干粉，分析中红外区(波数4000~400CHT1)的变化，记录红外光谱图(图2，样品的红外图谱)，扫描次数32次，分辨率4CHT1。IR谱图结果提示化合物中含有羰基(1630(3!^1),碳氮键(ΠδΟοπ1)，羟基或氨基键(3500~2800cm-1)。
[0021]称取0.5mg备用干粉用甲醇将其溶解，配制成浓度为lmg/mL的溶液。吸取少量溶液至微量比色皿，采用紫外-可见光扫描仪对该溶液进行全波长扫描。由UV谱图(图3，样品的全波长扫描图)可知UV λ _为219、28lnm，表明该化合物具有生色基团，可能为共轭双
键、擬基等。
[0022]质谱条件:离子方式=ESI+ ;毛细管电压:3.5kVolts ;锥孔电压:20Volts ;离子源温度:10(TC ;脱溶剂气温度:40(TC ;脱溶剂气流速:5001it/hr ;锥孔气流速:501it/hr ;碰撞能量:6Volts ;质量范围:100-1000m/z ;电压:1800Volts。采用MassLynx4.1软件采集并处理质谱数据，可以确定准分子离子峰，知道化合物的相对分子质量为246。同时产生多个碎片离子峰，m/zl88[M-59+H]+, m/zl46 [M-101+H]+, m/z118 [M-129+H]+ (图 4,样品的质谱图)
[0023]将备用干粉用氘代水溶解于核磁管中，采用400MHz的全数字化核磁共振波谱仪测定 1H-NMR(^OHz)、13C-NMR(400Hz)。1H-NMR(D2O)(图 5，样品的 1H-NMR 图):δ 3.30[9Η,s，N+(CH3)], δ 3.36 (1Η, dd, J = 13.2，12.0Hz, H_3a)，δ 3.44 (1Η, br.d, J = 13.5,3.6Hz,H-3b), δ 3.93(1Η，br.d，J = 11.6，3.8Ηζ，Η-2)，δ 7.22 (1Η, t, J = 7.5Ηζ, Η-6 ')，δ 7.26 (1Η, s, Η-2 ; )，δ 7.29 (1Η，t，J = 7.2Ηζ，Η_7 ' )，δ 7.54 (1Η，d，J = 8.ΙΗζ，Η-8 ' )，δ 7.68 (1Η, d, J = 7.9Ηζ, Η_5 ' )。13C-NMR(D2O)(图 6，样品的 13C-NMR 图):δ 22.64(C-3)，δ 51.80 [N.(CH3)L δ 78.76 (C_2)，3 106.99(03' )，3 111.97(08')，δ 118.ll(C-5 ' )，δ 119.38 (C-7 ' )，δ 122.00(C_6 ' )，δ 124.61(C_2 ')，δ 126.37(C-4/ ), δ 136.07(C-9/ ), δ 171.34 (C-1) ?
[0024]综合以上理化性质和波谱数据，确定备用干粉为N，N, N-三甲基色氨酸，中文名为刺桐碱(图7，样品的化学结构图)。
[0025]本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同样落于本发明的权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种王不留行刺桐碱单体的制备方法。其制备工艺为王不留行种子石油醚脱脂，75%乙醇85°C回流提取；减压浓缩至干，去离子水复溶，水饱和正丁醇萃取；正丁醇相用硅胶GF254板，展开剂为正丁醇:乙酸乙酯:水=4: I: 5的薄层层析制备；C18柱高效制备液相分离收集保留 时间为23.593min的峰。
【文档编号】C07D209/20GK104030965SQ201410195553
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】邱丽颖, 冯磊, 陈旭红, 刘艳玲, 冯柏年, 杜斌, 金坚 申请人:江南大学