从白刺种子中提取分离l-色氨酸的方法
【专利摘要】本发明研究发现，从白刺种子中提取分离L-色氨酸的方法，它包括如下操作步骤：(1)取白刺种子，以乙醇或含水乙醇为溶剂进行提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩，以石油醚萃取，收集水层；(2)取步骤(1)的萃取液，过大孔吸附树脂柱，以水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，干燥，即得L-色氨酸粗品；(3)取L-色氨酸粗品，纯化，即得L-色氨酸纯品。本发明研究发现，以白刺种子为原料，对大孔树脂直接进行水洗后，就分离提取得到了高纯度的L-色氨酸粗品和L-色氨酸纯品。本发明使用的洗脱部位与现有专利技术完全不同，其洗脱工艺仅需要水洗液，其操作更简便，成本更为低廉，同时也为白刺种子的开发利用提供了新的选择。
【专利说明】从白刺种子中提取分离L-色氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及L-色氨酸的分离提取方法。
【背景技术】
[0002]唐古特白刺(NitrariaTangutorum Bobr)为蔡藜科(Zygophyllaceae)白刺属植物，是一种药食两用的植物，主要生长在荒漠或半荒漠地区。唐古特白刺所具有的耐干旱、耐盐碱、抗沙埋等特性使得其成为防风固沙、保持水土、改良土壤等不可多得的灌木品种。唐古特白刺在《中药大辞典》中被称为卡密，以果熟时采收，晒干入药，具有健脾胃。滋补强壮、调经活血的功能，主治身体瘦弱、气血两亏、脾胃不和、消化不良、月经不调、虚寒腰痛等症。《本草纲目》中记述，白刺“气味辛、寒、无毒。主治心绞痛、痈肿溃脓，止痛。疗丈夫虚损，阳瘘精自出，补肾气，益精髓等”。在民间唐古特白刺的果实还被于哺乳期妇女的日常饮食中，促进泌乳。研究表明白刺果实中含花色苷、总多酚、多糖、氨基酸、维生素、黄酮、生物碱、矿物质元素等成分，具有显著的降血糖、降血脂、调节免疫、抗疲劳、耐寒冷、抗氧化、延缓衰老、保肝作用、抗肿瘤抗癌等生物活性。
[0003]为了深度开发利用白刺，中国专利201010298758.x公开了一种从白刺果实中提取分离色氨酸的方法，它是将白刺果实压榨后，去除籽皮，取果汁过陶瓷膜除杂后，上大孔吸附树脂柱，依次用水、40%?100%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，超滤后即可得到色氨酸。该方法中弃去了种子和水洗脱液。
[0004]目前还未见采用大孔吸附树脂从白刺种子中提取分离L-色氨酸的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种从白刺种子中分离提取L-色氨酸的方法。
[0006]本发明研究发现，从白刺种子中提取分离L-色氨酸的方法，它包括如下操作步骤:
[0007](I)取白刺种子，以乙醇或含水乙醇为溶剂进行提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩，以石油醚萃取，收集水层；
[0008](2)取步骤⑴收集的水层，过大孔吸附树脂柱，以水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，干燥，即得L-色氨酸粗品；
[0009](3)取L-色氨酸粗品，纯化，即得L-色氨酸纯品。
[0010]进一步地，步骤(I)中，所述含水乙醇浓度为60%?90%。
[0011]更进一步地，步骤(I)中，所述含水乙醇浓度为70%?80%，优选为75%。
[0012]进一步地，步骤(I)中，提取温度为50?80°C，优选为60°C。
[0013]进一步地，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂。
[0014]更近一步地，步骤(2)中，所述非极性大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂，HPD100, HPD300, HP-10, X-5 ;所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0015]进一步地，水洗脱的具体操作为:用水洗脱19个柱体积，收集第7?19个柱体积的水洗脱液。本发明研究发现，采用上述洗脱方式，即可得到纯度90%以上的L-色氨酸。
[0016]本发明一个【具体实施方式】中，大孔树脂柱规格为:直径5厘米，柱高1.2米。
[0017]进一步地，步骤(3)中，所述纯化采用制备液相色谱法或半制备液相色谱法。
[0018]其中，所述半制备液相色谱法中，检测波长为254nm，以甲醇-水为流动相，梯度条件如下:0-10min, 10% 甲醇；10-20min, 10% -15% 甲醇；20-30min, 15% 甲醇；30-50min,15% -20% 甲醇；50-55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇。
[0019]进一步地，所述半制备液相色谱法中，色谱柱为20*250mm的C18柱。
[0020]中国专利201010298758.X中，虽然是以白刺果汁为原料进行了色氨酸的提取，然而，其大孔树脂纯化步骤中收集的是40%?100%乙醇洗脱部位，水洗部位被弃去了 ；令人意想不到的是，本发明研究发现，以白刺种子为原料，对大孔树脂直接进行水洗后，就分离提取得到了高纯度的L-色氨酸粗品和L-色氨酸纯品。由此可见，本发明使用的洗脱部位与现有专利技术完全不同，其洗脱工艺仅需要水洗液，其操作更简便，成本更为低廉，同时也为白刺种子的开发利用提供了新的选择。
[0021]另外，相比目前其他色氨酸硅胶、凝胶柱层析工艺而言，本发明仅仅只使用大孔树月旨，操作简便，并且洗脱液无需使用有机溶剂，工艺更为环保，安全性更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1大孔树脂直接洗脱产物的液相色谱图，液相条件:0-30minl0% -45% B，流动相A:水B:甲醇(分析时所用检测波长是254nm)
[0023]图2半制备液相色谱图，主峰为L-色氨酸(制备色谱中所用检测波长是254nm)
[0024]图3纯化后L-色氨酸的液相色谱图，色谱条件如图1
【具体实施方式】
[0025]实施例1:L_色氨酸分离提取方法
[0026](I)取5kg的白刺种子粉碎后加入75%的乙醇在煎药机中进行热提取，提取温度60°C，提取时间2小时，共提取三次。第一次料液比为1: 15，第二次料液比为1: 12，第三次料液比为1: 10。合并提取液并减压浓缩250mL后石油醚萃取5次，石油醚萃取比例为250mL粗提液加入750mL石油醚。
[0027](2)大孔树脂柱规格:直径5厘米，柱高1.2米
[0028]上柱:取1.5kg DlOl大孔吸附树脂，装入层析柱，吸附三天后进行解吸附处理，用水冲柱每一个柱体积接样后检测(柱体积约为2L)，当冲柱到第7个柱体积后上HPLC检测其组成主要为化合物I。后续继续冲柱，一共冲了 19个柱体积后将7-19合并后在旋转蒸发仪上浓缩得到6.32g样品，即为L-色氨酸粗品，其含量占整个水冲物质含量的90%以上(见图1)
[0029](3)将6.32g样品复溶到200mL蒸馏水中，上半制备液相色谱进行进一步纯化与精制，每次上样20mL，样品经半制备纯化后HPLC检测其纯度达到了 99.7%，共得到5.88g高纯度样品。
[0030]半制备条件:
[0031]半制备柱:Dubhe C18柱(20*250mm)汉邦科技有限公司。检测器:NU 3000SERIALSUV/VIS DetecTor，汉邦科技有限公司。泵:NP 7000SERIALS PUMP，汉邦科技有限公司。
[0032]半制备梯度条件:0-10min，10%甲醇；10_20min，10% -15% 甲醇；20_30min，15%甲醇；30-50min，15% -20% 甲醇；50_55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇(若采用制备色谱，可以采用同样的流动相条件)
[0033]经NMR鉴定，该化合物为L-色氨酸。
[0034]NMR 数据为:13C NMR(DMS0-d6) δ 124.1 (d, C-2)，109.5 (s, C-3)，118.4(d, C_4)，118.3 (d, C-5)，120.9 (d, 6_C)，127.3 (s, C_3a)，136.3 (s, C_7a)，27.1 (t, CH2)，54.7 (d, CH)，170.3 (s, CO)
[0035]1H NMR(DMS0-d6) δ 10.94 (1H, s’ NH), 7.21 (1H, s，2_H)，7.56 (1H，d, J = 8.0Hz,4-H), 6.97(lH，d，J = 8.0Hz，5_H)，7.04(lH，t，J = 8.0Hz，6_H)，7.33(1H, J = 8.0Hz，7_H)，3.32 (1H, dd, J = 3.0，15.0HzjCH2)，2.95 (1H, dd, J = 9.0，15.0HzjCH2)，3.46 (1H, J = 5.0，8.0Hz，CH)
[0036]实施例2:L-色氨酸分离提取方法
[0037](I)取5kg的白刺种子粉碎后加入75%的乙醇在煎药机中进行热提取，提取温度60°C，提取时间3小时，共提取三次。第一次料液比为1: 12，第二次料液比为1: 10，第三次料液比为1: 8。取液并减压浓缩200mL后石油醚萃取5次，石油醚萃取比例为200mL粗提液加入700mL石油醚。
[0038](2)大孔树脂柱规格:直径5厘米，柱高1.2米
[0039]上柱:取1.5kg DlOl大孔吸附树脂，装入层析柱，吸附三天后进行解吸附处理，用水冲柱每一个柱体积接样后检测(柱体积约为2L)，当冲柱到第7个柱体积后上HPLC检测其组成主要为化合物I。后续继续冲柱，一共冲了 19个柱体积后将7-19合并后在旋转蒸发仪上浓缩得到L-色氨酸粗品；
[0040](3)将粗品复溶到200mL蒸馏水中，上半制备液相色谱进行进一步纯化与精制，每次上样20mL，样品经半制备纯化后HPLC检测其纯度达到了 99.7%。
[0041]半制备条件:
[0042]半制备柱:Dubhe C18柱(20*250mm)汉邦科技有限公司。检测器:NU 3000SERIALSUV/VIS DetecTor，汉邦科技有限公司。泵:NP 7000SERIALS PUMP，汉邦科技有限公司。
[0043]半制备梯度条件:0-10min，10%甲醇；10_20min，10% -15% 甲醇；20_30min，15%甲醇；30-50min，15% -20% 甲醇；50_55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇(若采用制备色谱，可以采用同样的流动相条件)。
【权利要求】
1.从白刺种子中提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于:它包括如下操作步骤: (1)取白刺种子，以乙醇或含水乙醇为溶剂进行提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩，以石油醚萃取，收集水层； (2)取步骤(I)收集的水层，过大孔吸附树脂柱，以水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，干燥，即得L-色氨酸粗品； (3)取L-色氨酸粗品，纯化，即得L-色氨酸纯品。
2.根据权利要求1所述的乙醇提取方法，其特征在于:步骤(I)中，所述含水乙醇浓度为 60%?90% v/vo
3.根据权利要求2所述的乙醇提取方法，其特征在于:步骤(I)中，所述含水乙醇浓度为 70% ?80% v/v，优选为 75% v/v0
4.根据权利要求1所述的乙醇提取方法，其特征在于:步骤⑴中，提取温度为50?80°C，优选为 60°C。
5.根据权利要求1所述的大孔树脂柱分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂。
6.根据权利要求5所述的大孔树脂柱分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述非极性大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂，HPD100，HPD 300，HP-10，X_5 ;所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
7.根据权利要求1、5或6所述的大孔树脂柱分离方法，其特征在于:水洗脱的具体操作为:用水洗脱19个柱体积，收集第7?19个柱体积的水洗脱液。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于:步骤(3)中，所述纯化采用制备液相色谱法或半制备液相色谱法。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于:所述半制备液相色谱法中，检测波长为254nm，以甲醇-水为流动相，梯度条件如下:0_10min，10%甲醇；10-20min, 10 % -15%甲醇；20-30min，15 % 甲醇；30_50min，15 % -20 % 甲醇；50_55min，20 % -95 % 甲醇；55-65min，95% 甲醇。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于:所述半制备液相色谱法中，色谱柱为 20*250_ 的 C18 柱。
【文档编号】C07D209/20GK104262231SQ201410542537
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】索有瑞, 胡娜, 周武 申请人:中国科学院西北高原生物研究所, 青海大学