一种提取牛血白细胞抗菌肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛血白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：（1）牛血采集；（2）收集白细胞；（3）萃取脱酸；（4）抗菌肽的纯化。本发明方法实现了从牛血白细胞提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。本发明方法具有操作简单、分离提取率高、成本低的特点，适用于较大量的从牛血中分离纯化抗菌肽。
【专利说明】一种提取牛血白细胞抗菌肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于抗菌肽的提取方法，具体涉及一种牛血白细胞抗菌肽的提取方法。
【背景技术】
[0002]我国畜牧业的兴起使得全国牛存栏和出栏量稳居世界前列，而屠宰肉牛产生的牛血也接近百万吨。受到技术条件、民族禁忌等的影响，我国的牛血除小部分被加工成饲料添加剂外，大部分被丢弃，既浪费资源又污染环境。因此对牛血的进一步深加工，提高其价值和利用率逐步成为牛血应用的主旋律。提高牛血液等副产品的利用价值将成为一个值得关注的方向。
[0003]有关研究确认，牛血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从牛血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从牛血白细胞提取抗菌肽的技术方法和产品。
【发明内容】
[0004]为了克服现有【技术领域】存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种牛血白细胞抗菌肽的提取方法，解决目前国内没有从牛血白细胞中提取抗菌肽的技术方法和产品的问题。
[0005]本发明提供的牛血白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤:
(1)牛血采集:从屠宰场采集新鲜牛血加入10%的抗凝剂，充分混匀后用200目滤布过滤，除去纤维和血凝块及其他杂质；
(2)收集白细胞:将收集的抗凝牛血在4°C下高速离心，弃去大部分的上层黄色澄清血浆和底层红细胞，收集中间层即白细胞与血小板和部分血浆与红细胞沉淀。按3:1的比例加入0.83%氯化铵溶液裂解红细胞，搅拌30min后，4°C下高速离心，弃去上清液，收集沉淀即为白细胞；
(3)萃取:将白细胞中加入10%的醋酸，用料理机进行搅打破碎，染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行均质破碎，至镜检无完整细胞。4°C超高速离心，收集上清液即为中性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4°C下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；
(4)脱酸:将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4°C下高速离心，收集上清液，旋转蒸发除去醋酸和部分水分后，真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在_20°C保存。
[0006](5)抗菌肽的纯化:将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上样于层析柱，同时打开柱的下端出口，收集特征峰洗脱液再真空冷冻干燥得抗菌肽，_20°C保存；
所述步骤(I)中，抗凝剂是10%柠檬酸钠。
[0007]所述步骤(2)中，高速离心是3000r / min离心15min。
[0008]所述步骤(2)中，氯化铵溶液是0.83%氯化铵溶液。
[0009]所述步骤(3)中，超高速离心是IlOOOr / min离心40min。
[0010]所述步骤(4)中，旋转蒸发是指55°C旋转蒸发30min。
[0011]所述步骤(5)中,层析柱是葡聚糖凝胶SephadexG25。
[0012]所述步骤(5)中，特征峰洗脱液是指在280nm处有吸收峰的洗脱液。
[0013]所述的提取方法中，真空冷冻干燥得温度为-50--60°C，冷冻干燥的时间为24h-48h。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例，对本发明提供的牛血白细胞抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。
实施例
[0015]参照本实施例的牛血白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤
O牛血采集:从屠宰场采集新鲜牛血5L加入抗凝剂10%柠檬酸钠溶液500ml，充分混匀后用200目滤布过滤，除去纤维和血凝块及其他杂质；
2)收集白细胞:将收集的抗凝牛血在4°C下3000r/ min离心15min,弃去大部分的上层黄色澄清血浆和底层红细胞，收集中间层即白细胞与血小板和部分血浆与红细胞沉淀。按3:1的比例加入0.83%氯化铵溶液裂解红细胞，缓慢搅拌30min后，4°C下3000r / min离心15min，弃去上清液，收集沉淀即为白细胞，约150g左右；
3)萃取:将白细胞中加入15g醋酸，用料理机进行搅打破碎，染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行均质破碎，至镜检无完整细胞。4°C IlOOOr / min离心40min，收集上清液即为中性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4°C下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；
4)脱酸:将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4°C下IlOOOr/ min离心40min，收集上清液，并于55°C旋转蒸发30min除去醋酸和部分水分后，-80°C真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在一 20°C保存；
5)抗菌肽的纯化:将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上样于层析柱葡聚糖凝胶S印hadexG25，同时打开柱的下端出口，用部分收集器收集洗脱液，将在280nm处有吸收的溶液收集，再真空冷冻干燥得0.55g抗菌肽，_20°C保存。
[0016]本发明方法实现了从牛血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法；采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物；采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能；本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高；实施本发明方法的原料牛血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料牛血属于屠宰加工的废弃物或副产物，血浆和血球蛋白仍然作为优质蛋白源利用，可制备高蛋白饲料或食用蛋白，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用。
【权利要求】
1.一种牛血白细胞抗菌肽的提取方法，其特征在于:它包括以下具体步骤: (1)牛血采集:从屠宰场采集新鲜牛血加入10%的抗凝剂，充分混匀后用200目滤布过滤，除去纤维和血凝块及其他杂质； (2)收集白细胞:将收集的抗凝牛血在4°C下高速离心，弃去大部分的上层黄色澄清血浆和底层红细胞，收集中间层即白细胞与血小板和部分血浆与红细胞沉淀；沉淀物中加入3倍体积氯化铵溶液裂解红细胞，4°C下高速离心，弃去上清液，收集沉淀即为白细胞； (3)萃取:将白细胞中加入10%的醋酸，用料理机进行搅打破碎，染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行均质破碎，至镜检无完整细胞；4°C超高速离心，收集上清液即为中性粒细胞胞浆内的颗粒组份；4°C下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物； (4)脱酸:将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4°C下高速离心，收集上清液，旋转蒸发除去醋酸和部分水分后，真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在_20°C保存； (5)抗菌肽的纯化:将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上样于层析柱，同时打开柱的下端出口，收集特征峰洗脱液再真空冷冻干燥得抗菌肽，_20°C保存。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(I)所述的抗凝剂是10%柠檬酸钠。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述的高速离心是3000r/min 离心 15min。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述氯化铵溶液是0.83%氯化铵溶液。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述的超高速离心是IlOOOr / min 离心 40min。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)所述的旋转蒸发是55°C旋转蒸发30min。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)所述的层析柱是葡聚糖凝胶SephadexG25。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)所述的特征峰洗脱液是指在280nm处有吸收峰的洗脱液。
9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的真空冷冻干燥得温度为-50—60°C，冷冻干燥的时间为24h-48h。
【文档编号】C07K1/14GK104513291SQ201410774955
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】宁发子, 邓小玲 申请人:重庆都好生物科技有限公司