专利名称：适用于调节免疫系统及神经系统的肽的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及适用于治疗免疫和中枢神经系统老化与异常的肽。
目前已经从牛和人的胸腺分离出了免疫调节蛋白胸腺生成素。另外已经化学合成了能模拟胸腺生成素的生物学活性的小肽。例如参见US4505853和相应的欧洲专利申请EP146266。
目前已经公开了大量与这种蛋白质和合成肽有关的文章及专利。US4190646公开了五肽胸腺增生素，它是胸腺生成素的活性位点，并且具有这样的序列Arg-Lys-Asp-Val-Tyr，该专利还描述了肽的组成，其中各种基团被取代到该五肽的氨基和/或羧基末端上。
已知胸腺生成素可调节胆碱能神经肌肉传导[G.Goldstein和W.H.Hoffman，J.Neurol Neurosurg psychiatry，31453-459(1968);和G.Goldstein，Nature，24711-14(1974)]。这种神经肌肉效应是因胸腺生成素与尼克酸乙酰胆碱受体结合引起的，这种受体是来源于脊椎动物神经肌肉接点和鱼带电器官的配体调节的离子系统[F.Revah等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，843477-3481(1987);以及K.Venkatasubramanian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，833171-3174(1986)]。与胸腺生成素受体(TPR)一样，胸腺生成素存在于脑中，所以胸腺生成素几乎一定包含在脑功能中。
最近人们已经认识到，胸腺增生素是一种精神压力引起的变化的拮抗剂，它具有精神压力保护活性[V.Klusa等人Regulatory Peptides，27355-365(1990)]。
在本领域中仍然需要其它的适用于治疗哺乳动物免疫系统机能障碍(包括与老化和各种身体状况有关的机能障碍)的作为诊断和/或治疗剂的肽，以及适用于治疗脑功能失调的肽。
本发明描述了一系列新的能够调节免疫与中枢神经系统细胞的功能的五肽，其特征在于它们作为免疫调节剂与已知的肽相比具有异常高的活性。
本发明一方面涉及具有下式的新的五肽或其可药用的酸或碱加成盐R1-V-W-X-Y-Z-R2其中R1、V、W、X、Y和Z如下面详细说明中所定义。在本发明肽的4位(或Y)存在脯氨酸(或脯氨酸类似物)可以使本发明的肽与在1-3和5位具有同样氨基酸成分的五肽相比增加了对酶的抗性。因此，与现有技术的肽相比，口服本发明的肽具有更大的体内效力。
本发明另一方面提供了通过溶液合成、固相合成或酶促合成制备上述肽的方法。
本发明再一方面提供了含有与可药用载体结合的一种或多种上述肽的药物组合物。
本发明还有一方面是提供了治疗与免疫系统相关的各种失调与缺陷(特别是因胸腺随着时间延长而收缩引起的老化作用)及精神病(例如焦虑和抑郁)的方法，该方法包括给患者施用有效量的本发明的药物组合物。
本发明的其它方面与优点将在下面的详细描述(包括目前优选的实施方案的实施例)中公开。
图1为条形图，说明了在扩散细胞中暴露于十二指肠0、2、4小时的胸腺增生素和乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2(肽IRI-514)的酶促稳定性(如实施例19所述)。
图2表明了以0.05mg/kg的开始剂量口服肽IRI-514对神经肌肉传导的剂量应答作用，如实施例18所述。
图3概括了评估以肽IRI-514治疗的和无效对照剂处理的动物获得的细胞产生T抑制基因细胞的能力的四种实验，如实施例19所述。
图4说明了以肽IRI-514治疗、赋形剂处理和对照(未受压力)三个组对于鼠在群居压力引起焦虑之后的行为应答的影响，如实施例20所述。
本发明提供了能够调节和影响哺乳动物免疫和/或中枢神经系统的肽。已经证实，这些五肽在神经肌肉试验、在增涨刺激促进T抑制基因细胞的抗CD3、在减少由精神压力引起的HPA中枢激素上升以及在防止精神压力引起的行为变化中具有生物学活性。这些五肽进一步的特征在于，与其他已知的肽相比口服这些五肽具有出人意料的效力。
本发明提供了一系列新的、具有下式结构的五肽或其可药用的酸或碱加成盐
其中R1是氢或C1-C10低级烷基或烷酰基;
V是精氨酸(Arg);
W是脯氨酸(Pro)、脱氢脯氨酸或羟基脯氨酸;
X是天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、天冬酰氨(Asn)、谷氨酸(Glu)或谷氨酰胺(Gln);
Y是脯氨酸、脱氢脯氨酸或羟基脯氨酸;
Z是苯丙氨酸(Phe)或酪氨酸(Tyr)，它可以被一个或多个卤素、硝基或羟基随意取代;
R2是OH或NR3R4，其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它可以随意地被芳基、或者被卤素或具有1-6个碳原子的直链、支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3和R4结合在一起形成含有具有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中V、W、X、Y和Z中之一或多种可任意地是D氨基酸。
在整个说明书中，为方便起见，用常规的缩写来代表肽的氨基酸成分以及在其制备中所用的某些原料。多数三个字母缩写的氨基酸是众所周知的。如上所示，在上式中所有氨基酸通常均是L-异构构型;然而在特定的肽中一种或多种氨基酸可以是D-异构构型。
在氨基酸2位和氨基酸4位具有脯氨酸或类似物的这些分子式的肽，其特征在于提高了在消化道和血清中被内和外肽酶以及类胰蛋白酶进攻的稳定性和抗性。这种在肠道中对酶促消化提高了抗性使得这样的肽特别适于口服，与其他已知肽相比使该肽具有了出人意料的效力。由于这些肽在口服剂量中具有非常的活性，因此它们特别适合于制成片剂形式的药物制剂。
一种优选的五肽是乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Z-NH2，其中Z可以选择Tyr或任意取代的Phe。目前最优选的五肽是乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2，称为IRI-514。出人意料的，这种肽具有高口服效力。
因些，本发明特别优选的肽包括乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-pClPhe-NH2癸酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH2丁酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2尽管本发明的肽最适合于口服治疗，但是也可以以任何合适的途径施用，例如通过注射或外部给药施用。对于以外部制剂使用，优选的是以癸酰基取代R1位的乙酰基，因为其亲脂性使得它尤其最适于吸收到皮肤中。
本发明的肽一般可以按照已知技术制备。按照Merrifield在J.A.C.S，852149-2154(1963)中所述的固相合成法可以方便地合成产生本发明的多肽。这种技术是众所周知的，它是制备肽的普通方法。这种固相合成法包括将保护的氨基酸分批加入到生长的肽链中，该肽链通过共价键与固体树脂颗粒结合。通过这种方法，过滤除去试剂和副产物，因而不需纯化中间体。该方法总体上是取决于将链的第一个氨基酸通过共价键连接到固体聚合物上。连续加入保护过的氨基酸，每次加入一个(逐步策略)，或者分批加入(分部策略)，直到装配成所需的序列。最后从固体树脂载体上除下保护的肽，并脱去保护基。
氨基酸可以与任何适合的作为树脂的聚合物连接。树脂必需含有功能基，以使第一个保护的氨基酸能够通过共价键与之牢固地连接。许多聚合物适用于此目的，例如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基异丁烯酸酯和聚苯乙烯。可用于此合成的合适的保护基包括叔丁氧羰基(Boc)、苄基(Bzl)、叔戊氧羰基(Aoc)、甲苯磺酰基(Tos)、邻溴苯甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯苄基(BzlCl2)和苯甲氧羰基(Z或CBZ)。在上面引用的Merrifield的文章中和J.F.W.McOmie的“有机化学中的保护基”(Plenum Press，New York，1973)一文中介绍了其它的保护基。这些教科书均引入本文作为参考。
制备本发明肽的一般方法包括首先将保护的羧基端的氨基酸连接到树脂中。连接上之后将树脂过滤、洗涤，并将羧基端氨基酸的α氨基上的保护基(最好是叔丁氧羰基)除去。当然将该保护基除去时，不能使氨基酸与树脂间的键断开。如果需要然后将下一个氨基侧链保护的氨基酸偶合到树脂上的氨基酸的游离α-氨基上。通过第二个氨基酸的游离羧基与结合在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成酰胺键来实现它们的偶合。逐个用氨基酸重复上述步骤，直到所有氨基酸都连接到树脂上。最后从树脂上脱去保护的肽并除去保护基，以得到所需的肽。用于从树脂上分离肽和脱去保护基的断裂技术取决于所选择的树脂和保护基，并且这些技术是肽合成领域中的专业人员已知的。
在Bodanszky等人的Peptide Synthesis第2版(John Wiley和Sons1976)中描述了另一种肽合成技术。例如，本发明的肽也可以用标准的溶液肽合成方法合成，该方法包括采用形成酰胺键的化学或酶促方法逐步或分批地偶合氨基酸或肽片段[参见例如H.D.Jakubke的The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Academic Press(New York 1987)第103-165页;J.D.Glass，ibid.，第167-184页;和EP0324659A2，该文献描述了酶促肽合成法]。这些溶液合成法是本领域众所周知的。
本发明的肽还可以通过本领域专业人员已知的其他技术例如基因工程技术产生。参见例如Sambrook等人的Molecular cloning，a laboratory Manual，第二版Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
本发明还公开了用作诊断和/或治疗剂的这些肽的酸或碱的加成盐。能够与这些肽形成盐的酸包括(但不限于)无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸等。有机酸也可以用于形成本发明的盐，例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酰胺酸、氨茴酸、肉桂酸、萘磺酸和磺胺酸等。
能与那些具有酸性部分的肽形成盐的非专用的碱的例子包括无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化铵和氢氧化钾等。所用有机碱包括(但不限于此)一、二和三烷基胺和芳胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺)以及可任意取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺)。
这些肽和含有这些肽的组合物出人意料地显示出对哺乳动物免疫和/或中枢神经系统的各种调节作用。例如，本发明的肽能够治疗自免疫失调和老化，以及其它免疫系统失调的疾病。
由于本发明肽的免疫调节特性，它们适用于治疗人，以及可能适用于治疗动物，因为它们能够影响哺乳动物免疫系统中的变化。
本发明的肽还可以用作抗焦虑治疗剂。例如，用本发明的肽预先治疗患者可以使介导精神压力反应的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的含量下降。因此，这种肽适于用作抗抑郁治疗剂，同样地它们也适用于治疗其它精神压力引起的疾病。
本发明的肽还可以用于减小免疫系统老化的作用。由于胸腺随着年龄收缩，胸腺生成素(即胸腺产生的多肽)的含量下降，结果是精神压力引起的CRF、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质甾类的含量成比例增加。因此，服用与胸腺生成素具有相似生物学活性的本发明的肽有助于降低与无效的或无功能的免疫系统有关的老化作用。
本发明进一步提供了含有一种或多种上述肽或其酸或碱的加成盐的药物组合物。一般认为本发明的肽或含有这些肽或其酸式或碱式盐的药物组合物适用于任何细胞免疫力出现问题的部位，尤其适用于免疫缺损部位。
本发明还提供了治疗因患者免疫系统和/或神经系统失调所导致的疾病的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的本发明的至少一种肽或药物组合物。本文所用术语“治疗有效量”是指能有效治疗上述疾病的量。
为了制备本发明的药物组合物，将作为活性成分的本发明的肽与可药用载体按照常规的药物混合技术充分混合。根据用药方式(例如口服、舌下、直肠、鼻或非肠道)所需的制剂形式，可以使用多种形式的载体。
在制备优选的口服剂量形式的组合物中，可以使用任何常用的药物介质。对于口服液体制剂(例如悬浮剂、酏剂和溶液)，可以使用的介质包括例如水、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂等。可用于制备口服固体(例如粉末、胶囊和片剂)的载体是例如淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、湿润剂、粘结剂和崩解剂等。也可以使用控制释放剂型。由于它们易于施用，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然要使用固体药物载体。如果需要，可以通过标准技术给片剂包上糖衣或肠衣。
对于非肠道产品，载体一般含有无菌水，尽管也可以包括其他成分例如用于助溶或防腐目的的成分。也可以制备可注射的悬浮液，在这种情况下，可以使用合适的液体载体和悬浮剂等。
当本发明的五肽以高于大约0.5mg/kg体重-10mg/kg体重的量非肠道用药物时，该五肽一般是有活性的。
这些肽口服比非肠道用药更有效。理论上说来，这是因为肽从肠吸收到血液中要经过较长的时间，大约要6-8小时。在此吸收过程中约30%的肽被有效吸收。相反，一旦进入血液，药物只有很短的半衰期，因为它们会被清除，然后被肾脏排泄掉。已经发现现有技术的肽只有大约15%的净吸收率。将这些肽非肠道施用比起口服给药将会更快地从体内清除掉。
当本发明的肽以大约0.02mg/kg体重-10mg/kg体重(优选约1mg/kg)的量口服时，这些肽一般是有活性的。这样水平的活性使得这些肽尤其是最适于制成片剂大小的适于口服给药的药物制剂。
下面所列举的实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的具体限定。在这些实施例以及整个说明书中，除非另外指明，所有份数均以重量计。这些实施例使用了下列缩写TFA为三氟乙酸;HOAc为乙酸，CH2Cl2为二氯甲烷;CH3CN为乙腈;DMF为二甲基甲酰胺;NH4OAc为乙酸铵;NH4OH为氢氧化铵;n-PrOH为正丙醇;n-BuOH为正丁醇;Pyr为吡啶;DCC为二环己基碳二亚胺;HOBt为1-羟基苯并三唑;DMAP为二甲基氨基吡啶;HF为氟化氢;TCA为三氯乙酸;BHA为二苯甲基胺树脂;p-MBHA为对甲基二苯甲基胺树脂;MeOH为甲醇。其他标准缩写可以参照The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology(Vol.1和2，ed.E.Gross and J.Meienhofer，Academic Press(New York 1987))和“IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature”(J.Biol.Chem.，2426489-6497(1970)和J.Biol.Chem.，2503215-3216(1975))来确定。符号Asx用于表明存在Asn，它是在分析Asp之后检测出来的。
实施例1-合成乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2采用对称酐偶合技术合成五肽酰胺，只是精氨酸采用标准偶合方案(Std 1循环，version 1.40)通过DCC-HOBt方法在Applied Biosystems ABI 430A肽合成器上偶合。合成是用0.45mmol对甲基二苯甲基胺树脂·HCl(0.710g，0.64mmol/g树脂)开始的。通过end-NH2方案(version 1.40)除去N末端Boc基团。采用含有4-二甲基氨基吡啶(15mg)的CH2Cl2(9ml)中的乙酸酐(1.0ml)使所得到的肽乙酰化30分钟。然后用DMF(5×10ml)和CH2Cl2(5×10ml)洗涤树脂，最后在40℃的真空烘箱中干燥(1.073g)。
在0℃通过在液体HF(10ml)、间甲基苯甲醚(1ml)和二甲基亚砜(1ml)中搅拌1小时，使肽从树脂载体(1.07g，0.45mmole)中断裂。减压除去过量HF后，用乙醚(3×50ml)萃取树脂-肽混合物。将乙醚提取物倾析出来。然后用20%HOAc水溶液(3×33ml)萃取释放出的肽。减压除去溶剂后，将所得残余物溶于H2O(40ml)中并冷冻干燥(0.248g)。将此固体溶于水(10ml)中并通过Amberlite TRA-68乙酸根型离子交换柱(60g，1.6meq/ml，2.73cm i.d.×18cm长)，以水为洗脱剂，流速为60ml/小时。合并合适的馏分并冷冻干燥(0.240g)。
使用Vydac 218 TP 1022柱(22×250mm)通过制备RP-HPLC纯化粗肽(将0.240g粗肽溶于4ml缓冲液“A”，见下面)。所用流动相如下所示
A＝0.1%TFA/H2OB＝0.1%TFA/CH3CN-H2O 4∶1V/V以14ml/分钟的流速，使用的线性梯度为在80分钟时间内由5%B到23%B。合并有关的馏分，减压除去有机溶剂。将含水残余物冷冻干燥(206mg)。
使用下述溶剂系统(V/V)在Merck F-254硅胶板(5×10cm)上进行薄层色谱(TLC)Rf(1)＝0.17(1-BuOH∶HOAc∶H2O，4∶1∶1)Rf(2)＝0.47(1-BuOH∶HOAc∶EtOAc∶H2O，1∶1∶1∶1)Rf(3)＝0.65(1-BuOH∶HOAc∶Pyr∶H2O，5∶4∶4∶2)氨基酸分析(AAA)结果[实验值(期望值)]为Arg1.02(1)，Pro1.98(2)，Asp0.99(1)，Phe1.02(1)，NH31.04(1)。快原子轰击/质谱(FAB-MS)[MH+]，质/荷比(m/z)为672a.m.u(分子量671.76)，这里MH+表示带阳电荷的离子质量;m/z为质/荷比;a.m.u为原子质量单位。
实施例2-合成乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Tyr取代5位的Phe。
TLCRf(1)＝0.20，Rf(2)＝0.33，Rf(3)＝0.85.
AAAArg 1.06(1)，Pro 1.99(2)，Asp 1.03(1)，Tyr 0.92(1)，NH31.19(1)
FAB-MS[MH+]at m/z 688 a.m.u.(Mol.Wt.687.76).
实施例3-合成乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Asn取代3位的Asp。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.22，Rf(2)＝0.56，Rf(3)＝0.72.
AAAArg 1.02(1)，Pro 1.97(2)，Asx 1.01(1)，Phe 1.01(1)，NH31.95(2).
FAB-MS[MH+]at m/z 671 a.m.u.(Mol.Wt.670.78).
实施例4-合成乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH2，按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Asn取代3位的Asp，并用Tyr取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.2，Rf(2)＝0.36，Rf(3)＝0.83.
AAAArg 1.07(1)，Pro 1.98(2)，Asx 1.04(1)，Tyr 0.91(1)，NH31.92(2).
FAB-MS[MH+]at m/z 687 a.m.u.(Mol.Wt.686.77).
实施例5-合成乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Ala取代3位的Asp。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.18，Rf(2)＝0.49，Rf(3)＝0.69.
AAAArg 0.98(1)，Pro 1.97(2)，Ala 1.03(1)，Phe 1.02(1)，NH31.00(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 628 a.m.u.(Mol.Wt.627.75).
实施例6-合成乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Tyr-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Ala取代3位的Asp并用Tyr取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.16，Rf(2)＝0.32，Rf(3)＝0.71.
AAAArg 1.04(1)，Pro 1.96(2)，Ala 0.99(1)，Tyr 1.02(1)，NH31.03(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 644 a.m.u.(Mol.Wt.643.75).
实施例7-合成乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Glu取代3位的Asp。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.26，Rf(2)＝0.58，Rf(3)＝0.74.
AAAArg 0.97(1)，Pro 2.03(2)，Glu 1.01(1)，Phe 1.00(1)，NH31.02(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 686 a.m.u.(Mol.Wt.685.79).
实施例8-合成乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Glu取代3位的Asp并用Tyr取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.18，Rf(2)＝0.35，Rf(3)＝0.66.
AAAArg 1.02(1)，Pro 1.95(2)，Glu 1.03(1)，Tyr 1.01(1)，NH30.99(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 702 a.m.u.(Mol.Wt.701.79).
实施例9-合成乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Ser取代3位的Asp。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.28，Rf(2)＝0.62，Rf(3)＝0.78.
AAAArg 1.01(1)，Pro 2.00(2)，Ser 0.62(1)，Phe 0.99(1)，NH31.16(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 644 a.m.u.(Mol.Wt.643.75).
实施例10-合成乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Thr取代3位的Asp。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.13，Rf(2)-0.47，Rf(3)＝0.72.
AAAArg 1.00(1)，Pro 2.00(2)，Thr 0.82(1)，Phe 1.15(1)，NH31.19(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 658 a.m.u.(Mol.Wt. 657.78).
实施例11-合成乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Thr取代3位的Asp并用Tyr取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.13，Rf(2)＝0.43，Rf(3)＝0.66.
AAAArg 1.00(1)，Pro 2.00(2)，Thr 0.87(1)，Phe 1.00(1)，NH30.93(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 674 a.m.u.(Mol.Wt.673.78).
实施例12-合成乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Ser取代3位的Asp并用Tyr取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.29，Rf(2)＝0.65，Rf(3)＝0.82.
AAAArg 1.03(1)，Pro 1.95(2)，Ser 0.65(1)，Tyr 1.01(1)，NH31.20(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 660 a.m.u.(Mol.Wt.659.75).
实施例13-合成乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-pClPhe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用对氯Phe取代5位的Phe。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.19，Rf(2)＝0.49，Rf(3)＝0.66.
AAAArg 1.00(1)，Pro 1.99(2)，Asp 0.97(1)，pClPhe 1.04(1)，NH31.02(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 706 a.m.u.(Mol.Wt.706.29).
实施例14-合成丁酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是用Asn取代3位的Asp。通过end-NH2方法除去N末端Boc基团，使用二异丙基碳二亚胺和HOBt，通过与正丁酸偶合引入N-末端丁酰基。此肽的特性如下
TLCRf(1)＝0.32，Rf(2)＝0.65，Rf(3)＝0.84.
AAAArg 1.01(1)，Pro 1.98(2)，Asx 1.02(1)，Phe 1.00(1)，NH31.98(2).
FAB-MS[MH+]at m/z 699 a.m.u.(Mol.Wt.698.83).
实施例15-合成癸酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2基本按照实施例1所述方法合成该五肽酰胺，只是进行以下修改。用5mmoles二苯甲基胺树脂开始固相肽合成，在连续引入氨基酸之后，除去N末端Boc基团。用含有羟基苯并三唑和二异丙基碳二亚胺的DMF中的癸酸处理所得到的肽-树脂。然后洗涤树脂并干燥(11.17g)。
按照实施例1所述方法使用液体HF从树脂载体上将肽断裂。离子交换后，使用与实施例1所述相同的流动相，利用制备RP-HPLC纯化粗肽(1.8g)。所用梯度为以14ml/分的流速经100分钟后由25%B到50%B。纯产物的产率为1.19g。此肽的特性如下TLCRf(1)＝0.30，Rf(2)＝0.64，Rf(3)＝0.82.
AAAArg 0.99(1)，Pro 2.00(2)，Asp 0.99(1)，Phe 1.01(1)，NH31.07(1).
FAB-MS[MH+]at m/z 785 a.m.u.(Mol.Wt.784.72).
实施例16-溶液相合成乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2此肽还可以按照如下所述通过溶液合成制备
A.Boc-Pro-Phe-NH2在-15℃向Boc-Pro-OH(4.304g，20mmoles)的乙酸乙脂(200ml)溶液中加入N-甲基吗啉(2.2ml，20mmoles)和氯甲酸异丁酯(2.6ml，20mmoles)。在-15℃活化10分钟后，加入HCl.Phe-NH2(4.014g，20mmoles)和N-甲基吗啉(2.2ml，20mmoles)在二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液。将反应混合物在-15℃搅拌30分钟并使其回升至室温。在室温搅拌2小时后，将反应混合物用10%碳酸钾溶液(30ml)骤冷。将清亮的两层转入分液漏斗中，连续用10%碳酸钾溶液(2×30ml)、饱和氯化钠溶液(1×30ml)、1N HCl(2×30ml)和饱和氯化钠溶液(2×30ml)洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥后，过滤有机溶液并在真空罩下用旋转蒸发器浓缩。用己烷使产品沉淀，过滤并干燥。
产量(理论值)7.229g实验产量6.795g(理论值的94%)B.HCl.Pro-Phe-NH2如上述A所述方法制备的Boc-Pro-Phe-NH2(6.506g，18mmoles)在乙酸乙酯(50ml)和冰醋酸(25ml)中的溶液中加入5N HCl-乙酸乙酯(20ml)和苯甲醚(2ml)。将此溶液搅拌1小时并用旋转蒸发器浓缩。加入乙醚(200ml)使二肽的盐酸盐沉淀。将此固体过滤并用KOH球真空干燥。
C.Boc-Asp(OBzl)-Pro-Phe-NH2在-15℃下将在乙酸乙酯(200ml)中的通过Boc-Asp(OBzl)(5.82g，18mmoles)反应制备的混合酸酐、N-甲基吗啉(1.98ml，18mmoles)和氯甲酸异丁酯(2.34ml，18mmoles)用HCl.Pro-Phe-NH2(如上述B中所述方法制备的)和N-甲基吗啉(1.98ml，18mmoles)的二甲基甲酰胺(40ml)溶液处理。使反应在-15℃进行30分钟，在室温进行2小时。按照前面所述对产品进行加工处理，并从乙酸乙酯-己烷中再次沉淀。
产量(理论值)10.20g实验产量9.76g(理论值的95.7%)。
D.Boc-Pro-Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2按照上面B中所述方法，采用HCl-乙酸乙酯将如上面C所述方法制备的Boc-Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2(9.067g，16mmoles)脱保护，用乙醚将此三肽的盐酸盐沉淀，过滤并干燥。
将在乙酸乙酯(160ml)中的从Boc-Pro制备的混合酐(3.44g，16mmoles)、N-甲基吗啉(1.76ml，16mmoles)和氯甲酸异丁酯(2.08ml，16mmoles)用HCl·Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2和N-甲基吗啉(1.76ml，16mmoles)的二甲基甲酰胺(30ml)溶液处理。反应条件和产品的加工处理如前所述。将产品从乙酸乙酯-己烷中结晶。
产量(理论值)10.62g实验产量10.09g(理论值的95%)。
E.Z-Arg-Pro-Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2使用HCl-乙酸乙酯将按照上述D中所述方法制备的Boc-Pro-Asp-(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2脱保护，用乙醚使该四肽的盐酸盐沉淀，过滤并干燥。
在25℃搅拌条件下，Z-Arg·HCl(5.17g，15mmoles)的二甲基甲酰胺(25ml)溶液中加入HCl·Pro-Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2和N-甲基吗啉(1.65ml，15mmoles)的二甲基甲酰胺(25ml)溶液。所得溶液中加入氰基膦酸二乙酯(2.45g，15mmoles)和N-甲基吗啉(1.65ml，15mmoles)，并将混合物搅拌4小时。通过加入10%乙酸水溶液(10ml)使反应骤冷，并在减压条件下用旋转蒸发器除去溶剂。用10%碳酸钾研制所得固体，然后用水研制并过滤。
产量(理论值)12.81g。
实验产量10.25g(理论值的80%)。
F.乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2[SEQ ID NO1]如上述E中所述方法制备的Z-Arg-Pro-Asp(OBzⅠ)-Pro-Phe-NH2(11.10g，13mmoles)的乙酸(50ml)溶液中加入20%碳载PdOH(1.0g)并用45psi的氢气使其氢化。通过TLC监测反应，1小时后，滤除催化剂并减压除去溶剂，得到Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2。将残余物溶于水(50ml)中并冷冻干燥。
在恒定搅拌下将Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2溶于乙酸(20ml)中并用乙酸酐(6.12g，60mmoles)进行处理。1小时后，加入水(20ml)使反应骤冷，减压除去溶剂。将残余物溶于水(50ml)并冷冻干燥。
按照实施例1所述方法，使用制备RP-HPLC将这样得到的粗肽纯化。将产品冷冻干燥至恒重。(肽含量90%)。
产量(理论值)8.73g。实验产量7.56g(理论值的77.9%)。该化合物与实施例1中所获得的产品难以区分。
实施例17-酶促稳定性为了说明本发明肽的稳定性进行以下测定。
将胸腺增生素和称之为IRI-514的乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2分别溶于磷酸盐缓冲液(pH5.5)中。在两个药室中将鼠十二指肠切开并与含有缓冲液的3.5ml扩散细胞(Crownglass，NJ)结合。将所选择的在磷酸盐缓冲液(pH5.5)中的试验肽放入两种细胞中，使其最终浓度为1mg/ml，并在0、2和4小时取样。将每份样品进行高效液相色谱(HPLC)分析，于220nm处进行紫外监测。胸腺增生素的溶剂系统是磷酸盐缓冲液和甲醇。对于IRI-514则使用乙腈和磷酸盐缓冲液作溶剂系统。
图1的条形图说明在0小时胸腺增生素(TP-5)和IRI-514是100%完整的(未受损)。2小时后IRI-514仍然有大约100%是完整的，而TR-5只剩下20%是完整的。最后在4小时时，完整的IRI-514的量约为90%，而完整的TR-5的量是微不足道的。此外，由于通过HPLC没有检测到降解峰，因此本发明人假设4小时后完整的IRI-514减少是由于它们吸附到了十二指肠组织上。
实施例18-神经肌肉分析此项分析测量了肽对于神经肌肉接点处胆碱能传导的影响能力。已知胸腺生成素和胸腺增生素能影响神经肌肉传导作用。
将各种剂量的实验肽溶于磷酸盐缓冲的盐水中，并给重25-30克的雌鼠(CDI种)皮下注射或口服按照G.Goldstein等人的方法(J.Neurol.Neurosurg.Psychiat.，31453-459(1968))，在给鼠服用肽后24或48小时对其进行肌电图描记分析。用0.5ml 10%的脲烷溶液将鼠麻醉。用Grass S-48刺激器和Grass SIU-5A刺激物分离装置(Grass medical imstruments，Quincy，MA)刺激神经，并且用接有5A21N差示放大器和5B10N时间座标的Tektronix存储示波器-5111(Tektronix，Beaverton，OR)记录肌电图描记应答。
施于每秒30次的超大神经刺激，用肌肉活动电位的十分之一分度作为第一个百分数。通过Dunnett′s双踪t-试验计算用于检验对照与实验化合物之间试验统计差的P-值。图2表明了口服IRI-514对神经肌肉传导的剂量应答作用，初始剂量为0.05mg/kg。
实施例19-刺激T抑制基因细胞的抗CD3调节作用从Jackson Laboratories(Bar Harbour，ME)购买雌性NZB×NZW F1鼠，并将其装入有接触衬垫的鞋盒笼子中，每笼6只。随意提供食物和水。在治疗过程结束时用CO2将鼠无痛杀死。
在杀死鼠之前，用一种或两种治疗方法用实验肽治疗鼠。在方法A中，从4周龄开始，给鼠皮下注射溶于无菌水中的肽，剂量为1mg/kg，每周一次，共注射4周。在方法B中，给7周龄鼠连续4天皮下注射4次，剂量为1mg/kg。在最后一次注射后的这天将所有鼠杀死，进行T抑制基因细胞活性分析。
将 无菌切除，通过过60目筛从每个个体动物制备单个细胞悬浮液并悬浮于组织培养基中，该培养基由加有25mM Hepes缓冲液的RPMI 1640、10%胎牛血清、2%丙酮酸钠、1% NEN非必需氨基酸1%L-谷氨酰胺(均得自Gibco，Grand Island，NY)、1%β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)和0.05%艮他霉素(Flow，McLean，VA)组成。
在涂有抗CD3(Clone 145-2C11，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)并用浓度为0.5μg/ml的硼酸盐缓冲的盐水(pH8.5)稀释的35mm组织培养井(Corning，Corning，NY)上产生有丝分裂原刺激的T细胞增殖应答的抑制基因细胞。将这些板在室温培养4小时，并在加入细胞前用Hanks平衡盐溶液洗涤3次。加入2ml 5×106细胞/ml的各只动物的脾细胞，在37℃在5%CO2中将培养物培养48小时。于是得到被刺激的培养物，将细胞调到1.25×106细胞/ml，以加入到有25%应答细胞数的抑制分析培养基中。在48小时的有丝分裂原刺激的培养物(0.25μg/ml抗CD3，Boehringer Mannheim)中测量T细胞增殖的抑制作用，该培养物在96井板中一式三份培养物含有5×105新鲜同源脾细胞和1.25×105实验细胞。在最后7小时用1μCi[3H]胸苷(NEN Research Products，Chadds Ford，PA)使这些井产生脉冲，在filtermats(Pharmacia，Turku，Finland)上收集，并在LKB1205 Betaplate液体闪烁计数器上读数。
图3总结了4种试验，它表明在此分析中，从每日一次共4天(方法B)或每周一次共4周(方法A)施用IRI-514(乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2)的动物得到的细胞比从用赋形剂(无效对照剂)处理的动物获得的细胞能更有效地产生抑制基因细胞。每种符号代表不同组动物，末涂黑的符号为对照组。黑色符号为IRI-514处理的动物。
实施例20-IRI-514对群居精神压力引起焦虑后鼠的行为应答的影响哺乳动物处于群居压力下导致下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴活化，并引起情绪变化并使焦虑增加。这可以在鼠中通过于抬高的附加迷宫对受精神压力动物的行为进行试验来研究。此迷宫由具有40cm高墙的两分路(封闭分路)和没有墙的两分路(开放分路)组成。因此正常的、末受精神压力的动物将花费相当多的时间来探索迷宫的每个分路，而焦虑增加和情绪变化的动物则只需花费非常少的时间来探索迷宫开放的分路。
在群居压力的常住者-入侵示例中，将一只入侵者雄鼠放入爱寻衅的常住雄鼠的家笼中。这样就导致了相互干扰，而这种干扰一般确定了常住鼠的优势。失败的动物表现为HPA轴产生的激素含量升高，并且如附加迷宫实验所测定的焦虑增加。
在这些研究中，给15-17只入侵者鼠在放入常住雄鼠笼中之前48小时皮下注射1mg/kg的IRI-514或者赋形剂(普通盐水)。使这些入侵的鼠面临所产生的互相干扰30分钟。通过在有机玻璃笼中保护入侵者，使其避免身体伤害，这样就提供了较纯心理压力的模型。将各只分别由IRI-514和赋形剂处理的动物放入抬高的附加迷宫中心，并允许其探索迷宫的所有4个分路5分钟。对那些未面临常住鼠的用IRI-514和赋形剂处理的动物也进行实验，作为对照。将计算机自动测量的每只动物探索迷宫每个分路的持续时间记录下来。
如图4所示，赋形剂处理的和IRI-514处理的对照(未受压力)动物分别花费47.9±7.3%和41.3±8.3%(平均值±sem)的时间探索迷宫开放分路。相反，面临群居压力的赋形剂处理的鼠在迷宫的开放分路中只花费很少的时间(26.4±5.5%;平均值±sem;p＝0.038)。重要的是，在面临群居压力前接受了IRI-514的鼠在迷宫中的开放分路中花费了与对照的、末受压力的鼠差不多的时间(43.8±7.9;平均值±sem)。在所有各组中鼠的总体活性是相似的。
这些结果很好地启发我们认识到IRI-514能够防止与面临心理(群居)压力所引起的焦虑增加和情绪变化有关的行为应答变化，或者使其正常化。
实施例21-IRI-514对群居精神压力引起焦虑后鼠的HPA轴激素的影响哺乳动物处于群居精神压力下导致HPA轴活化，并引起循环的促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质甾类(COR)含量升高。
在群居压力的常住者-入侵者示例中，将一只入侵者雄鼠放入受寻衅的常住雄鼠的家笼中。这样就导致了相互干扰，而这种干扰一般确定了常住鼠的优势。失败的动物一贯表现为HPA轴产生的激素含量升高，并且焦虑增加。
在这些研究中，13-16只入侵者鼠装上长期颈静脉内导管，以利于收集血样并回收。在放入常住雄鼠笼中之前24小时，给这些动物皮下注射1mg/kg的IRI-514或者等体积的赋形剂(普通盐水;对照鼠)。在面临精神压力之前立即收集血样，以测定基础血浆ACTH和COR含量。然后使这些入侵的鼠面对常住雄鼠并引起不自然的相互干扰30分钟。通过在有机玻璃笼中保护入侵者，使其避免身体伤害，这样就提供了较纯心理压力的模型。在进入遭遇战的10分钟和20分钟收集血样，并测定ACTH和COR的含量。
表1总结了这些试验的结果。它表明了在面临压力前和面临压力后10分钟和20分钟时测量的用对照或IRI-514处理的鼠的ACTH和COR含量的几何平均值与置信间隔(G.I.)。对照和IRI-514处理的动物的基础ACTH含量是相似的(P＝0.2817)。在对照鼠中，在受精神压力后的10分钟ACTH的外周含量从3.4pg/ml升至56.8pg/ml，并且在面临群居精神压力20分钟后其含量仍然在升高。更重要的是，在面临压力后10分钟，IRI-514处理的鼠中ACTH的含量(28.2pg/ml)显著低于对照组(P＝0.0370)。在面临精神压力后20分钟所测量的IRI-514处理的动物中ACTH含量(25.2pg/ml)也低于对照鼠(52.5pg/ml)。但是后一种差别不具有统计意义(P＝0.0788)。在面临精神压力前后在对照处理的和IRI-514处理的鼠之间未发现COR含量的差别。
表1赋形剂(无效对照剂)时间几何较低的较高的激素 (分钟) N 平均值 C.I. C.I. p-值ACTH 基线 14 3.4 1.6 5.2 0.281710 1456.8 40.5 73.1 0.037020 1452.5 35.2 69.8 0.0788
皮质酮 基线 1335.5 27.9 43.1 0.190610 13245.7 210.7 280.70.702220 13229.2 175.7 282.70.9687IRI-514(1mg/kg)时间几何较低的较高的激素 (分钟) N 平均值 C.I. C.I. p-值ACTH 基线 16 1.5 0.7 2.3 0.281710 1628.2 23.1 33.3 0.037020 1625.2 17.7 32.7 0.0788
皮质酮 基线 1546.5 36.5 56.5 0.190610 15230.9 210.9 250.90.702220 13 221.5 189.5 253.5 0.9687
P值是基于LOG转化数据的随机分组设计(block design)(双踪法)。
较低的C.I.＝几何平均值-STE。
较高的C.I.＝几何平均值+STE。
这些结果很好地启发我们认识到IRI-514能够抑制或调节与面临心理(群居)压力所引起的焦虑增加和情绪变化有关的HPA轴产生的激素的升高。
实施例22-IRI-514的体内稳定性我们进行此项研究用于调查在给鼠单一静脉(Ⅳ)注射14C-IRI-514后总体放射性的分配与药物动力学。按照上面实施例1所述方法合成肽IRI-514，引入14C-Arg以便能够在给动物施用后通过检测放射性发射来跟踪此化合物。对血浆和尿的放射性进行分析以测定与两种剂量水平0.1和10mg IRI-514/kg的14C-IRI-514有关物质的分配特性。
通过雄鼠(3只为0.1mg/kg剂量水平，2只为10mg/kg水平)的颈静脉、颈动脉和膀胱插入导管。通过颈静脉导管输注5%葡萄糖输注液来维持动物，并且连续用无菌水冲洗膀胱以刺激它频繁排泄。用penile导管和馏分收集器收集稀释的尿。每只动物通过颈静脉导管接受含有未标记IRI-514的10μCi14C-IRI-514，总的剂量水平为0.1或10mg/kg。在给药前和给药后的1、5、10、20、40、80分钟及2、4、6和24小时从颈动脉导管收集血样。在给药后的0-5、5-10、10-20、20-40、40-80、80-120分钟的时间间隔处及随后每15分钟直到24小时收集稀释的尿。通过高压液相色谱(HPLC)对具有足够放射性的血样和尿样进行母体14C-IRI-514含量的测定，以估计代谢程度。
两种剂量水平用药后的结果表明t1/2(50%活性消除)的范围是25.3-28分钟，这是根据在剂量用药后10分钟至2小时内所取样品中观测到的血浆总放射性数据测定的。血浆浓度对时间曲线下的面积(AUC)0-24小时是与所服剂量成比例的。低剂量用药后的AUC为0.162和0.164μg当量×小时/ml，高剂量用药后的AUC为20.11和22.23μg当量×小时/ml。在每种剂量用药后的0-40分钟所得血样的HPLC分析表明在每种剂量水平均是有限地代谢。在1-2分钟的样品中总放射性的大约87.9-96.4%为母体肽;在40分钟的样品中总放射性的大约44-61.9%为母体肽。
对两种剂量水平尿样数据的分析表明母体肽和代谢物在用药后40分钟内有38.8-67.1%被排除;在2小时内有73.9-82.9%被排除;在24小时内有86.2-94%被排除。HPLC分析表明在最初5分钟内排除的总放射性的62.5-68.3%为母肽。已确认在给药后40-80分钟收集的样品中被排除的总放射性的5.4-18.6%为母体肽。
可以得出结论，在静脉注射14C-IRI-514之后血浆中总放射性、IRI-514及其代谢物含量的迅速下降是由于肾的清除作用。正如根据血浆t1/2、AUC和尿排泄数据比较所测定的，在静脉注射IRI-514之后IRI-514的分配和药物动力学很显明是非剂量依赖性的(0.1或10mg/kg剂量)。最后在进入循环时肽的代谢是有限的。
B、由肽4位上的Pro产生的稳定性按照上面所述方法合成乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-Phe-NH2和乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2[IRI-514]引入14C-Arg以便能够在给动物施用后通过检测放射性发射来跟踪此化合物。按照上面A部分中所述方法给鼠静脉用药后，在施用两种化合物6小时之后，在尿中检测到所施用放射性的90%以上。
然后用一个能将其断裂产品与未受损的母体化合物分离的系统通过HPLC研究尿样。对于乙酰基-Arg-Pro-Asp-Val-Phe-NH2，大约25%的尿放射性与母体化合物有关，而发现64%的乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2的放射性与母体化合物有关。因此Pro取代4位的Val使得该化合物在静脉注射后在经过生物体和尿排除作用的过程中稳定性提高了。
对本发明的各种修改和改变均包括在上述说明书中，可以预料这些修改和改变对于本领域专业人员来说是显而易见的。例如，通过各种方法也可以制备那些没有被列举的但落入上述通式中的肽。本领域的专业人员可以对这些肽进行上述分析，而不需由专业人员过分试验和作出说明。可以确信，对于本发明的组合物及方法所作的这些修改和改变是包括在所附加的权利要求范围内的。
权利要求
1.具有下式的五肽或其可药用酸或碱的加成盐R1-V-W-X-Y-Z-R2其中R1为氢或C1-C10低级烷基或烷酰基；V是Arg；W是Pro、脱氢Pro或羟基Pro；X是Asp、Ser、Thr、Ala、Asn、Glu或Gln；Y是Pro、脱氢Pro或羟基Pro；Z是Phe、或Tyr，它可以任意地被一个或多个卤素、硝基或羟基取代；而R2是OH或NR3R4其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它们可以任意地被芳基或者被以卤素或具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3与R4连在一起形成含有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中所有V、W、X、Y和Z均为L-氨基酸，或者任意的一个或多个V、W、X、Y和Z为D氨基酸。
2.在可药用制剂中含有治疗有效量的至少一种权利要求1的五肽的药物组合物。
3.按照权利要求2的组合物，该组合物是适于口服的。
4.选自下面一组组成的五肽乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ala-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH2乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-pClPhe-NH2癸酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH2丁酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2
5.治疗以免疫系统失调为特征的身体症状患者的方法，该方法包括给所述患者服用治疗有效量的至少一种具有下式的五肽或其可药用酸或碱的加成盐其中R1为氢或C1-C10低级烷基或烷酰基;V是Arg;W是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;X是Asp、Ser、Thr、Ala、Asn、Glu或Gln;Y是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;Z是Phe、或Tyr，它可以任意地被一个或多个卤素、硝基或羟基取代;而R2是OH或NR3R4其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它们可以任意地被芳基或者被以卤素或具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3与R4连在一起形成含有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中所有V、W、X、Y和Z均为L-氨基酸，或者任意的一个或多个V、W、X、Y和Z为D氨基酸。
6.治疗以中枢神经系统失调为特征的身体症状患者的方法，该方法包括给所述患者服用治疗有效量的至少一种下式的五肽或其可药用酸或碱的加成盐其中R1为氢或C1-C10低级烷基或烷酰基;V是Arg;W是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;X是Asp、Ser、Thr、Ala、Asn、Glu或Gln;Y是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;Z是Phe、或Tyr，它可以任意地被一个或多个卤素、硝基或羟基取代;而R2是OH或NR3R4其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它们可以任意地被芳基或者被以卤素或具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3与R4连在一起形成含有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中所有V、W、X、Y和Z均为L-氨基酸，或者任意的一种或多个V、W、X、Y和Z为D氨基酸。
7.制备具有下式的五肽或其可药用酸或碱的加成盐的方法，所述方法包括固相合成其中R1为氢或C1-C10低级烷基或烷酰基;V是Arg;W是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;X是Asp、Ser、Thr、Ala、Asn、Glu或Gln;Y是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;Z是Phe、或Tyr，它可以任意地被一个或多个卤素、硝基或羟基取代;而R2是OH或NR3R4其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它们可以任意地被芳基或者被以卤素或具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3与R4连在一起形成含有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中所有V、W、X、Y和Z均为L-氨基酸，或者任意的一个或多个V、W、X、Y和Z为D-氨基酸。
8.制备具有下式的五肽或其可药用酸或碱的加成盐的方法，所述方法包括溶液相合成其中R1为氢或C1-C10低级烷基或烷酰基;V是Arg;W是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;X是Asp、Ser、Thr、Ala、Asn、Glu或Gln;Y是Pro、脱氢Pro或羟基Pro;Z是Phe、或Tyr，它可以任意地被一个或多个卤素、硝基或羟基取代;而R2是OH或NR3R4其中R3和R4各自独立选自由H、具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基(它们可以任意地被芳基或者被以卤素或具有1-6个碳原子的直链或支链烷基或链烯基取代的芳基取代)组成的一组基团，或者R3与R4连在一起形成含有3-7个碳原子的环亚甲基基团，并且其中所有V、W、X、Y和Z均为L-氨基酸，或者任意的一个或多个V、W、X、Y和Z为D-氨基酸。
9.按照权利要求8的方法，其中所述五肽选自由下面组成的一组乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-pClPhe-NH2，癸酰基-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2，乙酰基-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH2，和丁酰基-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH2.
全文摘要
本发明公开了能够调节哺乳动物免疫和/或神经系统细胞功能的五肽。本发明还提供了含有这些肽的药物组合物及其使用方法。
文档编号C07K7/06GK1068334SQ9210567
公开日1993年1月27日 申请日期1992年6月3日 优先权日1991年6月3日
发明者G·戈尔茨坦, T·奥德希雅, G·希夫纳, M·K·安瓦 申请人:免疫生物学研究所有限公司