专利名称：保护脱氧核苷-3′-氰乙基-n，n-二异丙基亚磷酰胺的制备方法
技术领域：
本发明是一种保护脱氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺的制备方法。
保护脱氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(以下简称β-氰乙基亚磷酰胺)是80年代出现的一种新型DNA合成试剂，广泛用于自动或半自动的固相法合成寡核苷酸引物、探针或基因。由于β-氰乙基亚磷酰胺在活化剂作用下，反应活性和甲基亚磷酰胺几乎相等，而在DNA合成完毕最终脱保护基时前者可以和其它保护基一起用浓氨水处理脱去，后者则首先需用气味难闻的硫酚除去。
关于β-氰乙基亚磷酰胺的制备方法已有文献报道，如在期刊Nucleic Acids Research 12(11)，4539，1984，中报道采用β-氰乙基二异丙胺基亚磷酰氯为磷酰化试剂，反应条件难控制、还要用二异丙基乙胺作为除酸剂，产物后处理需要在-78℃条件下操作，条件苛刻，实用性差。又如在M.J.Gait，Oligonucleotide Synthesis，a practical approach，P.41-45，IRL Press，Oxford，1984，中报道用甲基-N，N-二异丙胺亚磷酰氯为磷酰化试剂制得核苷甲氧基亚磷酰胺产物时，需用制备色谱或柱层析纯化才能得纯品，该法难于实现大规模生产。
为此，本发明目的是寻找一种保护脱氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺新的制备方法，采用易得的磷酰化试剂和适宜的活化剂进行磷酰化反应，产物分离纯化的方法简易，适宜于大规模生产。
本发明β-氰乙基亚磷酰胺的制备是由保护脱氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺为磷酰化试剂及四唑和/或四唑二烷基胺盐作活化剂在极性溶剂中进行磷酰化反应而成，最后用乙腈处理得纯产物。
本发明制备方法可用下式表示
B＝腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶;i-Pr＝异丙基保护脱氧核苷是保护脱氧腺嘌呤核苷，保护脱氧鸟嘌呤核苷，保护脱氧胞嘧啶核苷及保护脱氧胸腺嘧啶核苷。活化剂中的四唑二烷基胺盐如四唑二乙胺盐，四唑二异丙胺盐及四唑二丙胺盐等。活化剂中四唑与四唑二烷基胺盐的克分子比为0-1∶1-0。极性溶剂可以是卤代烷，如二氯甲烷，三氯甲烷，1，2-二氯乙烷;吡啶类如吡啶，六氢吡啶，2，6-二甲基吡啶;酰胺类如二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺，二甲基乙酰胺等。
本发明β-氰乙基亚磷酰胺的制备方法是将保护脱氧核苷，活化剂四唑和/或四唑二烷基胺盐及极性有机溶剂放入反应瓶中，为一不均相体系，然后滴加入磷酰化试剂β-氰乙基N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，在室温下搅拌反应1-10小时，随着反应进行不均相体系逐渐转变为均匀的液相体系。用薄层层析法检测反应。待反应完成后，用碳酸氢钠饱和溶液洗涤，除去无机杂质及活化剂，再用氯化钠饱和溶液洗涤，分离出有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤后抽去溶剂，残余糖浆状物用甲苯或二甲苯(对嘧啶类核苷)或用乙酸甲酯或乙酸乙酯(对嘌呤类核苷)溶解，搅拌下滴入预冷的(0～-20℃)正己烷或环己烷中析出沉淀，过滤，把此沉淀在预冷的正己烷中研磨成白色粉末，过滤干燥后，再把此白色粉末溶解于无水乙腈中，过滤去不溶物，真空抽去溶剂乙腈，收集研磨发泡的白色固体产物，即为β-氰乙基亚磷酰胺。产率可达60.1-91.3%产物的外观及物理常数与文献报道值一致。
在反应中保护脱氧核苷，磷酰化试剂与活化剂之用量克分子比是1∶0.8-3∶0.2-1。每毫克分子保护脱氧核苷需用极性溶剂量为0.5-1毫升。
本发明制备方法的优点是采用容易制得的磷酰化试剂及适宜的四唑和/或四唑二烷基胺盐作为活化剂的反应体系，能充分有效地使磷酰化反应完全，并且产物分离纯化后处理工艺简单，因此本法具有实用性，适用于大规模生产。
用以下实施例来说明本发明，但本发明范围并不限于此。
实施例1在一反应瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保护脱氧胸腺嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺盐及0.14克四唑(2毫克分子)，及25毫升无水二氯甲烷，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入15克(50毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应4小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，将反应液倒入100毫升干氯仿(或干二氯甲烷中)，用碳酸氢钠饱和溶液洗涤(3×150毫升)上述氯仿溶液，再用氯化钠饱和溶液洗涤(3×150毫升)，分离出有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，室温下减压浓缩抽去溶剂，残余糖浆状物用80毫升甲苯溶解，搅拌下滴入预冷的(0～20℃)的正己烷中析出沉淀，过滤，将此沉淀再次用80毫升甲苯溶解，搅拌滴入预冷的正己烷中析出沉淀，将收集的沉淀物在预冷的正己烷中研磨成粉末，在充满氮气的干燥箱中过滤收集该白色粉末，再真空干燥5小时，然后用无水乙腈100毫升溶解干白色粉末，在氮气干燥箱中过滤去掉不溶物，再真空抽去乙腈，产物发泡成白色片状，研磨，再真空干燥得纯产物保护脱氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺26克，产率为87.3%。
实施例2在一反应瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保护脱氧胞嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺盐和1.7克(24毫克分子)四唑及40毫升无水吡啶，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入18克(60毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应3小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，得纯产物保护脱氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺26.8克，产率为80.5%。
实施例3在一反应瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保护脱氧胸腺嘧啶核苷，2.8克(16毫克分子)四唑二丙胺盐和0.56克(8毫克分子)四唑及30毫升二乙基甲酰胺，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入12克(40毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应6小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，得纯产物保护脱氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺18.2克，产率为61.2%。
实施例4在一反应瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保护脱氧胞嘧啶核苷，2.7克(19.2毫克分子)四唑二乙胺盐和0.14克(2毫克分子)四唑及20毫升氯仿，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入14.5克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应5小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，但甲苯溶解改为二甲苯溶解，得纯产物保护脱氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺30.2克，产率为90.5%。
实施例5在一反应瓶中抽真空通氮，加入26.3克(40毫克分子)保护脱氧腺嘌呤核苷，3克(18毫克分子)四唑二乙丙胺盐和0.14克(2毫克分子)四唑及40毫升无水二甲基乙酰胺，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入24克(80毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应10小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，但甲苯溶解改为乙酸乙酯溶解，预冷的正己烷改成预冷的环己烷，得纯产物保护脱氧腺嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺25.8克，产率为75.2%。
实施例6在一反应瓶中抽真空通氮，加入25.6克(40毫克分子)保护脱氧鸟嘌呤核苷，3.4克(20毫克分子)四唑二丙胺盐及35毫升无水1，2二氯乙烷，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入36克(120毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应1小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，但甲苯溶解改为乙酸甲酯溶解，得纯产物保护脱氧鸟嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺27.9克，产率为83.1%。
实施例7在一反应瓶中抽真空通氮，加入26.3克(40毫克分子)保护脱氧腺嘌呤核苷，0.57克(4毫克分子)四唑二乙胺盐和1.1克(16毫克分子)四唑及30毫升无水六氢吡啶，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入9.6克(32毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应4小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，但甲苯溶解改为乙酸甲酯溶解，预冷的正己烷改为预冷的环己环，得纯产物保护脱氧腺嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺16.6克，产率为60.5%。
实施例8在一反应瓶中抽真空通氮，加入25.6克(40毫克分子)保护脱氧鸟嘌呤核苷，1.7克(24毫克分子)四唑及30毫升无水二甲基甲酰胺，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入14.4克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应8小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，但甲苯溶解改为乙酸乙酯溶解，得纯产物保护脱氧鸟嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺20.2克，产率为60.1%。
实施例9在一反应瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保护脱氧胸腺嘌呤核苷，4.8克(28毫克分子)四唑二异丙胺和0.84克(12毫克分子)四唑，及40毫升无水2.6-二甲基吡啶，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入24克(80毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应5小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，得纯产物保护脱氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺20.9克，产率为70.2%。
实施例10在一反应瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保护脱氧胸腺嘌呤核苷，3.4克(20毫克分子)四唑二丙胺和0.14克(2毫克分子)四唑，及30毫升无水二氯甲烷，此时体系为固液非均相。室温搅拌下滴加入14.4克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺，室温搅拌反应5小时，反应液逐渐变成均匀的液相，用薄层层析法检测反应，待反应完成后，后处理同实施例1，得纯产物保护脱氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺27.2克，产率为91.3%。
权利要求
1.一种用磷酰化反应制备保护脱氧核苷-3′-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺的方法，其特征在于是由保护脱氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺为磷酰化试剂及四唑和/或四唑二烷基胺盐作活化剂在极性溶剂中于室温下进行反应，反应中保护脱氧核苷，磷酰化试剂与活化剂用量的克分子比为1∶0.8-3∶0.2-1，活化剂中四唑与四唑二胺基胺盐的克分子比为0-1∶1-0，反应时间是1-10小时。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于保护脱氧核苷是保护脱氧腺嘌呤核苷，保护脱氧鸟嘌呤核苷，保护脱氧胞嘧啶核苷及保护脱氧胸腺嘧啶核苷。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于活化剂中四唑二烷基胺盐是四唑二乙胺盐，四唑二丙胺盐及四唑二异丙胺盐。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于极性溶剂可以是卤代烷如二氯甲烷，三氯甲烷，1，2-二氯乙烷;吡啶类如吡啶，六氢吡啶，2，6-二甲基吡啶;酰胺类如二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺，二甲基乙酰胺。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于上述反应后，最后用乙腈处理得纯产物。
全文摘要
一种保护脱氧核苷-3′-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺是由保护脱氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N′，N′，-四异丙基亚磷酰二胺为磷酰化试剂及四唑和/或四唑二烷基胺盐作活化剂在极性溶剂中进行磷酰化反应而成，产物分离纯化的后处理工艺简单。因此本法具有实用性，适用于大规模生产。
文档编号C07H19/073GK1072414SQ9210863
公开日1993年5月26日 申请日期1992年11月17日 优先权日1992年11月17日
发明者蒋飞龙 申请人:蒋飞龙