专利名称：：用于检测和治疗i型糖尿病的胰岛素原肽化合物的制作方法
技术领域：
：本发明的背景已知I型(或胰岛素依赖型)糖尿病mellitus(本文也称为DM-I)在人类，大鼠和小鼠中自发产生Castano，LandEisenbarth，G.(1990)Ann.Rev.Immunol.8647-679)。与人类主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原的某些单元型(即HLA-DR3，-DR4和-DQ3.2)(例如见PLat2.P.etal.(1981)Diabetologia21108-115；Todd，J.etal.(1987)Nature329599-604)；生物繁殖(BB)大鼠RT1u(例如见Colle，E.(1990)Clin.Immunol.&Immunopathol.571-9；Parfrey.N.A.etal.(1989)Crit.Rev.Immunol.945-65)和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠H-2g7(例如，见KikutaniH.andMakino，S.inAdv.Immunol.(Dixon，F.J.，ed.)，PP.285-323.NewYork，NyAcademicPress，Inc.，1992)相关的DM-I具有遗传感病性。DM-I的病理学由含特异性针对胰岛素分泌β细胞之免疫细胞的胰岛进展型发炎侵入(即insulitis)组成(例如，见Bottazzo，G.F.etal.(1985)N.Eng.J.Med.313353-360；Foulis，A.K.etal.(1991)J.Pathol，16597-103；Hanenberg，H.etal.(1991)Diabetologia32126-134)。该病理学在不确定的时间期限(几月到几年)内形成。已清楚I型糖尿病的形成作为涉及遗传诱因，环境影响和其它未确定辅助因子的复杂关系的结果而出现。在了解DM-I之致病性的尝试中，最难理解的信息是刺激性自身抗原的定义，以及细胞或体液介导的自身反应性是否是一级事件。在准糖尿病和新诊断为糖尿病的人类和动物中可发现针对胰岛细胞胞质和表面抗原(即，ICA，ICSA)，胰岛素(IAA)和谷氨酸脱羧酶(GAD)的血清自身抗体(例如，见Rowley，M.etal.(1992)Diabetes41548-551；Palmer，J.etal.(1983)Science2221337-9；Maclaren，N.etal.(1988)Diabetes38534-538；Baekkeskor，S.etal.(1990)Nature347151-156；Velleso，L.A.etal.(1993)Diabetologia3639-46)。不幸的是尚未成功地预言抗这些抗原的抗体滴度和糖尿病临床发作间的关系。而且，由于胰岛被破坏使许多其它β-细胞抗原暴露出来，如69kd的胰岛细胞自身抗原(ICA69)(Pietropaolo，M.etal.(1993)J.Clin.In-vest.92359-371)，38kd和62kd的胰岛素分泌颗粒蛋白(Roep，B.O.etal.(1991)Lancet3371439-1441；Brudzynski.k.etal.(1992)J.Autoimm.5453-463)和proislet(Harrison，L.C.et.al.(1992)J.Clin.Invest.891161-65；Harrison，L.etal.inAdvancesinEn-docrinology&Metabolism(Mazzaferri，E.L.etal.，ed.)，pp.35-94，st.Louis，MOMosby-YeaBook，1990)。然而，尚不清楚对这些抗原的细胞和/或体液免疫反应是否是不断发展中的胰岛细胞损伤的原因或简单后果。简单地说，尚未阐明致病机制的免疫特征和诱导致糖尿病攻击的精确抗原。在美国有超过50万人患有胰岛素依赖性糖尿病。1921年前，形成DM-I的人预期在诊断后不会活过一年。作为糖代谢异常的后果患者出现慢性高血糖的临床症状(例如，过分口渴和排尿，迅速失重)。一旦纯化并施用胰岛素，糖尿病人的预期寿命显著增大。然而，DM-I是一种慢性疾病，它需要进行一生的治疗以防止急性疾病并减少长期并发症的危险。限制饮食并每天进行胰岛素注射对病人可能难以负担，即使进行治疗也可能流行诸如白内障，视网膜病，青光眼，肾病和循环疾病的并发症。因此，需要对I型糖尿病进行更有效的治疗，特别是针对该病的自身免疫基础而不仅仅是治疗症状的疗法。另外，如果DM-I的糖尿病前期持续长并且无临床症状，在这期间就会失去治疗干预的重要机会。然而尚缺乏可鉴定糖尿病前期病人的有效诊断试验。需要能鉴定早期或在个体中诱发糖尿病的固定β-细胞异常的方法以便能够在该疾病过程的早期进行治疗，这可帮助防止一生依赖胰岛素。本发明的概述本发明涉及调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物。在一个实施方案中，本发明的胰岛素原肽化合物刺激T细胞免疫反应。例如，具有DM-I的人与非糖尿病对照人相比具有更大数量的与本文所述的特异性胰岛素原肽反应的循环T细胞。因此，受试者与刺激性胰岛素原肽化合物的免疫反应性可用作DM-I的指标。在另一实施方案中，本发明的胰岛素原肽化合物抑制I型糖尿病受试者T细胞的免疫反应。本发明进一步提供了治疗和预防方法，涉及使用本发明的胰岛素原肽化合物以抑制或防止在I型糖尿病受试者中与胰岛素原的T细胞反应。在优选的实施方案中，调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物来自横跨胰岛素原B链和C肽间接头的区域。在另一实施方案中，胰岛素原肽化合物是来自该区的胰岛素原肽的修饰形式。该修饰形式包括与天然胰岛素原氨基酸序列相比具有氨基酸取代但仍保留天然肽的某些结构和功能特征的肽。在本发明范围内的胰岛素肽化合物的其它修饰形式包括具有末端或侧链共价修饰的肽和肽类物及模拟物。可选择这些修饰的胰岛素原肽以改变肽的特征，例如稳定性，可溶性，免疫原性等。本发明的胰岛素原肽化合物可掺入适于给受试者用药的药用组合物中。本发明的另一方面涉及经过在受试者生物样品中检测对本发明的胰岛素原肽化合物的免疫活性而检测受试者I型糖尿病指标的方法。本发明还有另一个方面涉及经过给受试者施用调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物抑制受试者I型糖尿病形成或进展的方法。附图的简述图1是合成肽位置的示意图，包含与酶促裂解成胰岛素(A+B链以二硫键连接)和C肽前胰岛素原结构相关的MHCII类(RT1，B/D)结合基序。该结合基序横跨含有一对在加工过程中被位点特异性蛋白质内切酶裂解的碱性残基(Arg-Arg)的胰岛素原B和C链氨基酸。图2A-C表示在存在或缺乏抗MHCII类抗体的条件下对GAD412(A组)，GAD520(B组)和PI(C组)肽特异性的T细胞系的增生(作为对照，用APC和培养基培养的GAD412T细胞的平均CPm＝850±297；GAD520＝74±30；PI＝1763±181)。图3是用伴刀豆球蛋白A刺激72小时后PI肽-特异性T细胞系表达细胞表面抗原的流式细胞光度图。经过对10,000个细胞的FACScan分析产生各第一抗体(在括号中)的直方图和阳性表达百分数。本发明的详细描述本发明涉及调节I型糖尿病受体T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物以及涉及该化合物检测和治疗DM-I的用途。(在本申请中，术语I型糖尿病，胰岛素依赖性糖尿病和DM-I可互相交换使用)。本发明至少部分基于的发现是对本发明的胰岛素原肽特异性的T细胞在具有DM-I的人循环中存在的频率比在非糖尿病对照的循环中要高得多。另外，对本发明的胰岛素原肽特异性的T细胞克隆当转移进首次用于实验的遗传上合适的动物中时能引起糖尿病。这些资料与在DM-I发作期间产生该肽的胰岛素原区域受特异性自身抗原攻击相一致。因此，提供了使用胰岛素原肽化合物的涉及DM-I诊断、治疗和预防的方法。I.胰岛素原肽化合物本发明的一个方面涉及调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物。本文所用的术语“胰岛素原肽化合物”指包括来自胰岛素原的肽(即具有天然胰岛素原区域氨基酸序列的肽)以及该肽的修饰形式。这些修饰形式包括与天然胰岛素原序列相比具有氨基酸取代但保留其结构和功能特征的肽，具有共价修饰(例如，末端或侧链修饰)的肽，肽类似物和模似物及来自在产生该肽的区域内与胰岛素原同源的其它蛋白质的肽。本发明的胰岛素原肽化合物能调节I型糖尿病受试者T细胞的免疫反应。术语“调节”指包括刺激或抑制免疫反应。因此，在本发明的各种实施例中，肽化合物可以是“刺激型肽化合物”(即刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的化合物)或“抑制型肽化合物”(即抑制I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的化合物)。术语“抑制型肽化合物”指包括抑制对天然胰岛素原肽的T细胞反应的肽(或其它相似的刺激型肽化合物)。胰岛素的未加工的(即不成熟的)和加工的(即成熟)的形式的示意图在图1中显示。本文使用的术语“胰岛素原”指胰岛素的不成熟形式，包括从该蛋白质氨基末端到羧基末端相邻连接的B链，C肽和A链的氨基酸残基(图1中的氨基酸残基25至110)。正常加工时，胰岛素原在B链和C肽之间和在C肽和A链之间的连接处裂解以产生成熟B链和A链。术语“胰岛素原”前体指胰岛素的不成熟形式，它除了胰岛素原序列外，还包括相邻连接到B链氨基末端的先导序列(图1中的氨基酸残基1-24)。胰岛素原前体正常加工时，从B链上裂解下先导序列。由于胰岛素原的全部编码序列包含在胰岛素原前体内，可预料本文所述的来自胰岛素原特定区域的肽也可来自胰岛素原前体相当序列。本发明的优选的胰岛素原肽化合物来自横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域。来自该区域的肽在图1中以图示说明(标记为“合成PI肽”)。人胰岛素原前体的完整核苷酸和氨基酸序列分别在SEQIDNO1和2中显示(也见Bell，G.etal.(1979)Na-ture282525-527；Sures，I.etal.(1980)Science20857-59)。使用SEQIDNO2编号氨基酸序列时，人胰岛素原B链与氨基酸残基25-54相对应，C肽与氨基酸残基57-87相对应(在加工过程中残基55-56的二肽从胰岛素原上裂解)。因此，本文使用的“横跨胰岛素原B链和C肽之间接头”的胰岛素原区域指包含B链和C链的氨基酸残基的区域，至少包括接头的残基30-33。横跨该接头的优选的区域包括从大约47位到大约63位的氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物是“刺激型胰岛素原肽化合物”。术语“刺激型胰岛素原肽化合物指包括刺激T细胞反应，如T细胞增生和/或细胞因子生产的肽化合物。优选的是，刺激型胰岛素原肽化合物与上面所述的横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同。特别优选的刺激型肽化合物来自人胰岛素原。在一个实施方案中，肽包含氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser-Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(GLu/Asp)-(Zaa)m-Y2(SEQIDNO3)，其中可有可无的(Xaa)和(Zaa)代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。优选的是，肽是长度为大约10-35个氨基酸(即n+m＝3至28)。更优选的是，肽是长度大约10-20个氨基酸(即n+m＝3至13)。尤其更优选的是肽是大约12-17个氨基酸长(即，n+m＝5到10)。在特别优选的实施方案中，来自人胰岛素原的刺激型肽化合物包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2(SEQIDNO4)，它与SEQIDNO2中所示的人胰岛素原前体氨基酸残基47至64相对应。除了来自人胰岛素原肽化合物外，本发明还包含其它种类胰岛素原相当区域的刺激型胰岛素原肽化合物。例如，大鼠胰岛素原I相当区域(例如残基47-63)的胰岛素原肽包含氨基酸序列Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Val-Glu-(Glu/Asp)-Pro-Gln-Val(SEQIDNO5)。来自大鼠胰岛素原II相当区域的刺激型胰岛素原肽包含氨基酸序列Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Met-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Val-Glu-(Glu/Asp)-Pro-Gln-Val(SEQIDNO6)。(大鼠胰岛素原前体I和II基因的完整核苷酸和氨基酸序列在Lomedico.P.etal.(1979)Cell18545-558中公开)。其它种类的胰岛素原氨基酸序列在本领域中也是已知的并且可用于设计与横跨胰岛素原B链和C肽接头的区域相同的相似刺激型胰岛素原肽(例如，Perler.F.etal.(1980)Cell20555-566公开了鸡胰岛素原前体基因的序列；WattV.M.etal.(1985)J.Biol.Chem.26010926-29公开了豚鼠胰岛素原前体基因的序列)。以用于肽合成的任意合适的方法、包括化学合成和重组DNA技术可制备本发明的胰岛素原肽化合物。优选的是，化学合成该肽。化学合成肽的方法在本领域是熟知的(例如，见Bodansky，M.Princi-plesofPeptideSynthesis，SpringerVerlag，Berlin(1993)和Grant，G.A.(ed.).SyntheticPeptidesAUser’SGuide，W.H.FreemanandCompay，NewYork(1992))。自动肽合成仪可以商品买到(例如，AdvancedChemTechModel396；Milligen/Biosearch9600)。在宿主细胞中重组表达编码该肽的DNA来制备肽的方法在本领域中也是熟知的(例如，见Sambrooketal.(1989)MolecularcloningALabora-toryManual.2ndEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPrers)。除了具有与天然胰岛素原特定区域(例如，优选横跨胰岛素原B链-C肽接头的区域)相同的氨基酸序列的胰岛素原肽化合物外，本发明还包含与胰岛素原天然区域基本相似的胰岛素原肽化合物。与胰岛素原天然区域基本相似的肽化合物可以是刺激型(即刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的化合物)或作为选择，可以是抑制型(即抑制I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的化合物)。与胰岛素原特定区域(例如，横跨胰岛素原B链-C肽接头的区域)“基本相似”的本文所述的肽化合物包括保留天然肽的某些结构和功能特征但在一个或多个氨基酸位置与特定区域内的天然胰岛素原氨基酸序列有区别(即经氨基酸取代)的肽。例如，与天然胰岛素原肽基本相似的刺激型肽保留刺激I型糖尿病受试者T细胞的T细胞反应的能力，而与天然胰岛素原肽基本相似的抑制型肽保留与主要组织相容性复合物(MHC)结合的能力但缺乏刺激由I型糖尿病受试者T细胞产生的T细胞反应的能力。本领域中普遍接受抗原型肽基本上由三类氨基酸位置组成1)肽与MHC分子相互作用所必需的位置(本文称为“MHC接触残基”)，2)肽与T细胞受体(TCR)复合物相互作用从而刺激T细胞激活所必需的位置(本文称为“TCR接触残基”)和3)“中性”位置，对MHC接触或TCR接触都不是关键性的(例如见Rothhard，J.B.andGefter，M.L.(1991)Ann.Rev.Immunol.9527-565；Jorgensen，J.L.etal.(1992)Ann.Rev.Immunol.10835-873；Rothbard，J.B.andTaylor，W.R.(1988)EMBOJ.793-100；DelisiC.andBerzof-sky，J.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.827048；Berzofsky，J.etal.(1988)inImmunologicalReviews，PP.5-31，Copenhagen，Denmark；Munksgaard；Margalit，H.etal(1987)J.Immunol.1382213-2229；O’Sullivan，D.etal.(1990)J.Immunol，1451799-1808；Corr，Metal.(1993)J.EXP.Med.1781877-1892；Falk，K.etal.(1994)Im-munogenetics39230-242；Sidney，J.etal.(1994)J.Immunol.1524516-4525；Chicz，R.M.etal.(1993)J.EXP.Med.17827-47；Kropshofer，H.etal.(1992)J.EXP.Med.175(1799-1803)。因此，可选择与天然刺激型胰岛素原肽基本相似的刺激型肽化合物具有在一个或多个中性位置进行氨基酸取代但保留关键性MHC接触残基和TCR接触残基使肽保留结合MHC分子的能力和刺激T细胞反应的能力。另外或作为选择，刺激型肽化合物可在涉及MHC接触和/或TCR接触的一个或多个位置具有氨基酸取代，只要该取代不改变肽刺激T细胞反应的能力(例如，可耐受在MHC和/或TCR接触位置的保守氨基酸取代)。与上述修饰的刺激型肽化合物相反，与天然胰岛素原肽基本相似的抑制型肽化合物可选择保留结合MHC分子的能力但缺乏刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的能力。因此，这些抑制型肽化合物在关键性TCR接触残基处具有氨基酸取代使该肽不能刺激T细胞反应但保留关键性MHC接触残基(或在关键性MHC接触位置耐受保守性氨基酸取代)使该肽仍能接合MHC分子。抑制性肽化合物也可在中性残基处具有取代。经过在天然胰岛素原肽内取代氨基酸残基并选择具有所需刺激或抑制活性的肽可制备从天然胰岛素原序列改变来的刺激型或抑制型肽。例如，可用其它残基系统取代胰岛素原肽的氨基酸残基且然后在标准试验中试验取代的肽以评价该取代对免疫反应的影响。典型的是，为了保留功能活性，进行保守氨基酸取代。本文使用的术语“保守性氨基酸取代”指包括其中用具有相似侧链的氨基酸残基取代该氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已限定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰氨，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分技侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。其它一般优选的取代涉及用具有小侧链的另一氨基酸残基(如丙氨酸或甘氨酸)取代该氨基酸残基的取代。例如，合成SEQIDNO5中所示的一组刺激型大鼠胰岛素原肽的胰岛素原肽类似物使在该肽中含丙氨酸取代，如下面所示的一组肽AAFYAPKSRREVEDPAA(SEQIDNO7)AAFYTAKSRREVEDPAA(SEQIDNO8)AAFYTPASRREVEDPAA(SEQIDNO9)AAFYTPKARREVEDPAA(SEQIDNO10)AAFYTPKSAREVEDPAA(SEQIDNO11)AAFYTPKSRAEVEDPAA(SEQIDNO12)AAFYTPKSRRAVEDPAA(SEQIDNO13)AAFYTPKSRREAEDPAA(SEQIDNO14)AAFYTPKSRREVADPAA(SEQIDNO15)AAFYTPKSRREVEAPAA(SEQIDNO16)对其它抗原性肽的研究表明可耐受用丙氨酸残基取代非关键性氨基酸残基(例如，该肽保留结合MHC分子的能力；见Jardetzkyetal.(1990)EMBOJ.91797-1803)。用前面所述的诸如自动化学合成的标准技术可制备氨基酸取代的肽。在评价免疫反应的标准试验中检测了氨基酸取代对肽结合MHC分子和/或刺激T细胞反应的能力的影响。优选的是将胰岛素原特异性T细胞克隆或杂交瘤用于该试验。可按实例1和3所述制备T细胞克隆。可用标准方法从T细胞克隆制备T细胞杂交瘤，例如，使用聚乙二醇将胰岛素原肽特异性T细胞克隆与TcRαβ-胸瘤(如BW5147细胞系)融合。胰岛素原特异性T细胞的抗原特异性可用胰岛素原肽刺激途径和抗原特异性白细胞介素-2(IL-2)生产分析来监测。在对IL-2生产的标准分析中，使用诸如HT-2细胞的IL-2依赖性细胞系在生物测定中分析培养物上清中IL-2的存在。将上清加入HT-2细胞中24小时后，在3H-胸苷(3H-TdR)存在的条件下再培养12-14小时，随后收获细胞并测量3H-TdR吸收。对IL-2的其它合适的分析，如酶联免疫吸附试验在本领域中是熟知的。在评价氨基酸取代肽的一个试验中，分析了取代肽直接刺激胰岛素原肽-特异性T细胞克隆和/或杂交瘤的能力。试验了典型地以0.5-20μg/ml之间的浓度范围的一组具有氨基酸取代的胰岛素原肽类似物对胰岛素特异性T细胞克隆和/或杂交瘤的刺激。根据其刺激克隆或杂交瘤产生IL-2的能力选择保留激活胰岛素原特异性T细胞克隆和/或杂交瘤之能力的刺激型肽化合物，如上所述。在评价氨基酸取代肽的另一试验中，分析了取代肽与野生型胰岛素原肽竞争结合存在抗原的细胞表面的MHC分子的能力。在加入野生型胰岛素原肽和胰岛素原特异性T细胞克隆或杂交瘤前用存在放射性抗原的细胞预培养各取代的胰岛素原肽类似物(例如2小时)。在合适的时间期限(例如24小时)后收获上清并分析IL-2的存在，如上所述。以其抑制在正常情况下受刺激性胰岛素原肽诱导的T细胞克隆或杂交瘤生产IL-2的能力来鉴定竞争性抑制剂。而且，可根据直接刺激试验和竞争性抑制试验的结合结果选择抑制性肽化合物，例如，选择缺乏直接刺激T细胞反应能力但保留竞争性抑制对天然胰岛素原肽的T细胞反应能力的抑制性肽化合物。野生型和取代型肽结合MHC分子的能力也能直接使用标记肽和纯化MHC分子在结合试验中进行分析(例如，平衡透析，柱结合试验等，如在Sette，A.(1987)Nature328395-399中描述)。根据动物实验(在实施例1和2中进一步描述)，本发明的优选的胰岛素原肽化合物预测的MHC结合基序包含氨基酸序列(Ser/Thr)-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-(Glu/Asp)(SEQIDNO17)，其中Xaa代表任意氨基酸。术语“MHC结合基序”指存在于肽内(全部蛋白质区域)的使肽与MHC分子的抗原结合位点结合的氨基酸残基形式。这就是说，特定MHC分子的结合基序限定为片段结合MHC分子所必需的肽片段的关键性氨基酸残基。产生本发明的优选的胰岛素原肽的横跨B链-C肽接头的胰岛素原区域(例如，氨基酸残基47-63)包括2个预测的MHC结合基序Thr51-Gtu57和Ser54-Asp60。可经过制备在这些位置含氨基酸取代(例如丙氨酸取代)的一组胰岛素原肽来直接评价在MHC结合中所涉及的这些残基。还试验了除Thr51，Ser54，Glu57和Asp60外全部由丙氨酸组成的另一肽。因此，用于评价胰岛素原肽MHC结合基序的一组肽的例子在下面列出GFFYAPKSRRAVEDPQV(SEQIDNO18)GFFYTPKARREVEAPQV(SEQIDNO19)AAAATAASAAEAADAAA(SEQIDNO20)如上所述，这些肽的活性可在直接T细胞刺激试验和/或竞争抑制试验中测定以评价在该肽的MHC结合能力中所涉及的(Ser/Thr)-(Glu/Asp)基序。除了氨基酸取代的胰岛素原肽外，本发明还包含具有其它修饰的胰岛素原肽化合物。例如，可修饰该肽的氨基末端或羧基末端。术语“氨基衍生基团”(例如上面提供的通式中的Y1)指包括本发明的肽化合物的氨基末端修饰。N-末端修饰的例子包括烷基，环烷基，芳基，芳烷基和酰基基团。优选的N-末端修饰是乙酰化。N-末端残基可与各种不同于氨基酸的基团连接，如聚乙二醇(如四乙二醇羧酸单甲基酯)，焦谷氨酸，琥珀酰，甲氧琥珀酰，苯甲酰基，苯乙酰基，2-，3-或4-吡啶烷酰，芳酰，烷酰(包括乙酰和环烷酰，例如，环己烷基丙酰)，芳烷酰，芳基氨基羰基，烷基胺基羰基，环烷基氨基羰基，烷氧基羰基(氨基甲酸帽)和环烷氧基羰基及其它。术语“羧基衍生基团”(例如，在上面提供的通式中的Y2)指包括本发明的肽化合物的羧基末端修饰。C端修饰的例子包括C-末端残基的羰基碳修饰成羧基末端酰胺或醇(即，还原形式)。一般来说，共价结合于C末端残基的羰基碳上的酰胺氮具有两个取代基，各为氢，烷基或烷芳基(取代的或未取代的)。优选的C端是酰胺基，如-CONH2，-CONHCH3，-CONHCH2C6H5或-CON(CH3)2，但也可以是2-，3-或4-吡啶乙基，羧酸，酯，羰基酯，烷基，芳烷基，芳基，环己烷酰胺，六氢吡啶和其它单个或两个取代的酰胺。可连接到C-端残基上的其它基团包括六氢吡啶-4-羧酸或酰胺和顺-或反-4-氨基-环己烷羧酸或酰胺。而且，可耐受非关键性氨基酸残基(例如，“中性”残基)一个或多个侧链的修饰而不改变该肽的功能。氨基酸侧链或末端残基的共价修饰可经过将该肽的靶氨基酸残基与能和选定侧链或末端残基反应的有机衍生试剂发生反应来导入该肽中。典型侧链修饰的例子在下面进一步描述最常见的是半胱酰残基与α-卤素乙酸盐(和相应的胺)反应，如氯乙酸或氯乙酰胺以产生羧甲基或羧基氨甲基衍生物。也可经过与溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-imidozoyl)丙酸，氯乙酰磷酸，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫酸，甲基2-吡啶基二硫酸，对-氯-苯甲酸汞，2-氯汞-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯甲酰-2-噁-1，3-二唑反应修饰半胱氨酰残基。经过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应可修饰组氨酰残基，因为该试剂对组氨酰侧链具有相当的特异性。对溴苯甲酰甲基溴也有用；反应优选在pH6.0下在0.1M卡可酸钠中进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐发生反应。用这些试剂进行的修饰具有逆转赖氨酰残基电荷的影响。用于修饰含α氨基残基的其它合适的试剂包括imodoesters，如甲基吡啶甲酰亚胺，磷酸吡哆醛；吡哆醛，氯硼氢酸，三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和与乙醛酸进行的转氨酶催化的反应。经过与一种或几种常规试剂反应可修饰精氨酰，其中的试剂为苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-环已烷二酮和茚三酮。精氨酸残基的修饰需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的pKa高。而且，这些试剂可与赖氨酸及精氨酸ε-氨基反应。对酪氨酰残基本身的特异性修饰已被广泛研究，特别感兴趣的是经过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记导入酪氨酰残基。最常见的是N-acetylimidizol和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。使用125I对酪氨酰残基进行碘标记以制备标记的蛋白质用于放射免疫试验，上面所述的氯胺T方法是合适的。经过与诸如1-环己烷基-3-(2-吗林基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-脱甲基戊基)碳化二亚胺的碳化二亚胺(R′-N-C-N-R′)反应选择性地修饰羰基侧面基团(天冬氨酰或谷氨酰)。而且，天冬氨酰和谷氨酰经过与铵离子反应可转变成天冬酰氨酰和谷氨酰氨酰残基。谷氨酰氨酰和天冬酰胺酰残基常脱酰胺化成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。作为选择，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺化。这些残基的每一种形式都在本发明的范围内。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基之羟基的磷酸化，赖氨酸精氨酸和组氨酸侧链α氨基的甲基化(T.E.Creighton(1983)ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco.PP.79-86)。可在上面所述的直接T细胞刺激试验和/或竞争性抑制试验中评价共价修饰的肽的活性(例如，末端或侧链修饰的肽)。本发明的胰岛素原肽化合物也包括天然胰岛素原肽的肽类似物和肽模拟物。术语“肽类拟物”或“肽模拟物”指由连接的残基组成的化合物，使该化合物模拟天然胰岛素原肽的结构。“残基”指以酰胺键或类似酰胺键掺入肽化合物的氨基酸或氨基酸类似物。设计肽模拟物和类似物的方法在本领域中是已知的。例如，见Farmer，P.S.inDrugDesign(E.J.Ariens，ed.)AcademicPress，NewYork，1980，Vol.10，PP.119-143；Ball.J.B.andAlewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition355；Morgan，B.A.andGainor，J.A.(1989)Ann，Rep.Med.Chem.24243-252；andFreidinger，R.M.(1989)TrendsPhar-macol.Sci.10270。“氨基酸类似物“指不同于天然存在的氨基酸的基团，它在结构上和功能上可用作肽化合物中特定氨基酸的取代物而对肽功能(例如肽与MHC分子的相互作用)，无程度明显的有害干扰。在有些情况下，用氨基酸类似物的取代实际上可增强肽的特性(例如，肽与MHC分子的相互作用)。氨基酸类似物的例子包括D-氨基酸。用一个或多个D-氨基酸取代胰岛素原肽化合物可使用熟知的肽合成方法实现。使用上面所述的对L-氨基酸取代的试验可检测用D-氨基酸取代氨基酸的效力。用其它抗原性肽研究D-氨基酸取代对该肽的MHC结合能力的影响表明在关键性MHC连接位置的单个D-氨基酸取代典型地减少该肽对MHC分子的亲和力但在这些位置以外进行的D-氨基酸取代具有相当好的耐受性。例如见Gaeta等的PCT公开号WO92/02543。本发明的肽类似物或模拟物包括同型空间配位体。本文使用的术语“同型空间配位体”指由于第一序列的空间构象适合于对第二序列特异性的结合位点而可取代第二序列的2个或多个残基的序列。该术语特别包括本领域的技术人员熟知的肽主链修饰(即酰胺链模拟物)。该修饰包括酰胺氮，α-碳，酰胺羰基的修饰，酰胺键的完全取代，延伸，缺失或主链交联。一些肽主链修饰物是已知的，包括ψ[CH2S]，ψ[CH2NH]，ψ[CSNH2]，ψ[NHCO]，ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。在上面使用的命称中，ψ表示缺乏酰胺键。取代酰胺基团的结构在括号内限定。同型空间配位体的其它例子包括用一个或多个benzodiazepine分子取代的肽(例如，见James，G.L.etal.(1993)Science2601937-1942)。其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，主链交联成结构内酰胺和其它环形结构，或颠倒-反式氨基酸掺入(ψ[NHCO])。“反式”指用D氨基酸取代序列中的L-氨基酸，“颠倒-反式”或“反式-颠倒”是扭转序列的氨基酸(颠倒)并用D-氨基酸取代L-氨基酸。例如，如果亲本肽是Thr-Ala-Tyr。颠倒修饰形式是Tyr-Ala-Thr，反式形式是thr-ala-tyr.，颠倒-反式形式是tyr-ala-thr(小写字母指D-氨基酸)。与亲本肽相比，颠倒-反式肽具有反相主链而基本上保留侧链的原始空间构象，导致颠倒-反式异构体具有密切相似于亲本肽的拓扑结构且能结合到选定的MHC分子上。见Goodmanetal.“PerspectivesinPeptideChemistry”PP.283-294(1981)。也见Sisto的美国专利号4,522,752对“颠倒-反式”肽的进一步描述。本发明的胰岛素原肽修饰形式，包括L-或D-氨基酸取代，末端或侧链的共价修饰，肽类似物和模拟物，可选择所需的肽的物理或化学特征的改变，例如，增强稳定性，可溶性，生物可获得性，增强或减小免疫原性等。尽管本发明的优选的肽化合物来自胰岛素原区，或是来自胰岛素原的肽的修饰形式，但本领域的技术人员可预料到来自与胰岛素原产生该肽的区域同源的其它蛋白质的肽也可用于调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应。例如，本发明的肽化合物可来自具有与胰岛素原横跨B链-C肽接头的区域(例如，胰岛素原氨基酸47-63)同源的区域的蛋白质。解释起动病理事件导致抗自身抗原之自身免疫反应的一个假说是自身抗原模拟受试者曾接触过的环境或微生物抗原。因此，该环境或微生物抗原用作激活自身破坏免疫成份的免疫刺激物。因此，横跨B链-C肽接头的胰岛素原区域的氨基酸序列(例如，胰岛素原氨基酸47-63)可与其它蛋白质(例如潜在的环境或微生物抗原)相比较以鉴定具有同源区的蛋白质。来自另一蛋白质该同源区的肽或按本文所需修饰的其修饰肽也可用于调节(例如，刺激或抑制)I型糖尿病受试者T细胞免疫反应。II.药用组合物本发明的胰岛素原肽化合物可配制成适于药用上施用的组合物。该药用组合物典型地包括胰岛素原肽(或上面所述的其修饰形式)和药用上可接受的载体。在优选的实施方案中，药用组合物包括与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本上相似的胰岛素原肽化合物。优选的是，胰岛素原肽来自人胰岛素原。本文使用的术语“药用上可接受的载体”试图包括与药用上施用相配伍的任意和全部溶剂，分散介质，包膜，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。用于药用活性物质的该培养基和试剂的使用是本领域中熟知的。除了与活性化合物不配伍的任何常规介质或试剂外，其在组合物中的应用是可预料到的。补充的活性化合物也能掺入组合物中。本发明的药用组合物配制成与其预期用药途径相配伍。例如，用于肠胃外，皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括下列成份无菌稀释剂，如注射用水，盐溶液，固定的油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或甲基paraben；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸，柠檬酸或磷酸盐，以及用于调节张力的的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH值，如盐酸或氢氧化钠。肠胃处用制品可包装进安瓿，处理的注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶。适于注射用的药用组合物包括无菌水溶液(溶于水中)或分散物以及随时可制备成无菌可注射的溶液或分散物的无菌粉末。为进行静脉内用药，为进行静脉内用药，合适的载体包括生理盐水，制菌水，CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并应液化到易注射的程度。它在生产和贮存条件下应是稳定的并应保护使免受诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。例如，载体可以是含水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。例如经过使用诸如卵磷脂的包膜，在分散的情况下经过维持所需的颗粒大小，及经过使用表面活性剂可维持合适的流动性。防止微生物作用可用各种抗细菌和抗真菌剂，如parabens，氯丁醇，酚，抗坏血酸，thimerosal等实现。在许多情况下，组合物优选包括等渗剂，如糖类，多元醇，如甘露醇，苏糖醇，氯化钠。延长可注射组合物的吸收可经过在组合物中包含一种延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶来实现。经过将活性化合物(即，胰岛素原肽或其衍生物)以所需量按需与上面列举的成份中的一种或组合掺入合适的溶剂中随后过滤灭菌可制备无菌可注射的溶液。一般来说，经过将活性化合物掺入含碱性分散介质和上面列举的所需其它成份的无菌载体中可制备分散物。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，它产生活性成份加上来自其前面无菌过滤溶液的任何其它所需成份的粉末。口服组合物一般包括隋性稀释剂或食用载体。它们可包装进明胶胶囊中或压成片剂。为了口服治疗用药，活性化合物可掺入赋形剂中并以片剂，锭剂或胶囊形式使用。作为组合物的一部分，可包括药用上配伍的结合剂，和/或佐剂物质。片剂，丸剂，胶囊，锭剂等可含有任一下列成份，或相似特征的化合物结合剂，如微晶形纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸，Primogel，或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotesi滑动剂，如胶体二氧化硅；增甜剂，如蔗糖或糖精；香味剂，如薄荷，甲基水杨酸或橙香剂。在一个实施方案中，可用保护化合物抵抗迅速从身体排除的载体制备活性化合物，如控制释放的配方，包括埋植和微包裹传递系统。可使用生物可降解的生物相容的多聚体，如乙烯乙烯基乙酸，聚酐，聚羟基乙酸，胶原，聚邻酯和聚乳酸。制备该配方的方法对本领域的技术人员而言是显而易见的。这些物质也可从AlzaCorpora-tionandNoVaPharmaceutical，Inc.以商品获得。脂质体悬液(包括针对具有抗病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞的脂质体)也可作用药用上可接受的载体。其制备可按照本领域中的技术人员已知的方法，例如按美国专利号4,522,811中所述进行。例如，经过将合适的脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰胆碱，花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂中。然后蒸发，在容器表面留下一层干脂薄膜来制备脂质体配方。然后将不变链蛋白或肽的水溶液导入容器中。然后用手旋转容器使脂物质离开容器侧面并分散脂聚集体，从而形成脂质体悬液。特别具优势的是以易于用药且剂量均匀的剂量单位形式配成口服或肠胃外用组合物。本文使用的剂量单位形式是指适于作为治疗受试者的单一剂量的物理上分离的单位；各单位含有计算为生产所需疗效的预定量的活性化合物以及所需的药用载体。对本发明的剂量单位形式的限定直接取决于(a)活性化合物的独特的特征及所要实现的具体疗效，(b)在本领域中合成治疗个体的该活性化合物的内在的限制。在一个实施方案中，药用组合物包含耐受量的本发明的胰岛素原肽化合物。本文使用的术语“耐受量”试图包括足以在受试者中诱导不与产生该肽的肽化合物或相关肽或蛋白质(如，胰岛素原)发生反应的肽化合物量。尽管不打算受机制限制，但与化合物的不反应性可能由诱导对化合物特异性的T细胞无反应力，对抗原具特异性的T细胞缺失(例如破坏)或诱导T抑制细胞途径引起。诱导受试者不反应性所必需的化合物的产生耐受性量很可能根据使用的肽化合物的特定形式，用药途径，受试者的疾病状态等而变化。在本领域中作为人I型糖尿病模型被接受的动物模型(例如，Biobreeding大鼠或NOD小鼠)可用于试验特定肽化合物，用药途径等以测定本发明的肽化合物的合适的产生耐受量。III.在受试者中检测DM-I指标的方法本发明的胰岛素原肽化合物可用于检测受试者I型糖尿病指标的试验中。正如在实施例3中所进一步详细描述的那样，人I型糖尿病病人的生物学样品与非糖尿病对照人的生物学样品相比表现出对本发明的胰岛素原肽的免疫活性增加。因此，可检测针对本发明的刺激型胰岛素原肽化合物的免疫活性作为受试者I型糖尿病的指标。本发明提供了检测受试者I型糖尿病指标的方法，包含a)从受试者获得生物样品；b)将样品与刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物接触；c)检测样品对胰岛素原肽化合物的免疫活性作为受试者I型糖尿病的指示剂。适用于该方法的胰岛素原肽化合物包括上文详述的刺激型化合物。优选的是，胰岛素原肽化合物与横跨胰岛素原B链和C肽之间接头的胰岛素原区域相同或基本相似，如上所述。为了检测人生物学样品中DM-I的指标，优选的胰岛素原肽化合物来自人胰岛素原。典型地是，用于该方法的生物学样品是来自受试者的血样品，或其下面部分，如具核细胞(如，淋巴细胞)或血清，尽管也可使用可能含有免疫活性的任意合适的生物样品。可用标准技术从受试者获得血液样品或其它生物学样品。而且，可用标准技术分离血液样品(例如，获得具核细胞，血清等)。在该方法的一个实施方案中，检测的免疫活性是对胰岛素原肽化合物的T细胞反应。例如，可在该化合物存在的条件下培养受试者血样中的外周血单核细胞或纯化的T细胞。经过诱发对该化合物的T细胞反应的足够一段时间后，测定对该化合物的T细胞反应。例如，经过测量T细胞增生(例如，经标准氚标记的胸苷吸收)或细胞因子生产(在下面进一步描述)可分析T细胞反应。在测量T细胞反应前或任选时，可从生物学样品制备胰岛素原特异性T细胞克隆并定量(例如，见实施例3)。经过有限稀释分析可测定生物学样品中胰岛素原-特异性T细胞的频率(例如，如在Sabbaj.setal.(1992)J.Clin.Immunol.12216-224中所述)。作为选择，可使用次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(hprt)克隆试验测定胰岛素原特异性T细胞的频率(如在Allegretta，M.etal.(1990)Sci-ence247719-721；andLodge，P.etal.(1994)Neurology44(Suppl.2)A147中所述)。该克隆试验技术的一个关键性特征在于以该系统检测的T细胞在克隆前假定与目的抗原的反应中进行多循环的体内刺激。因此，经过利用可在体外进行的试验据认为反应了受试者T细胞特异性和克隆活性的精确情况。这些结果可与非糖尿病对照进行比较。作为选择或除了测量T细胞增生外，可测量T细胞细胞因子生产作为抗胰岛素原肽化合物免疫活性的指标。T细胞因子生产的测定可使用例如，标准酶联免疫吸附试验(ELISA)或对特定细胞因子特异性的放射免疫试验(RIA)进行(例如，诸如白细胞介素-2[IL-2]，干扰素-γ[IFN-γ]和肿瘤坏死因子/淋巴毒素[TNF/LT]的发炎前细胞因子)。在该方法的非限定性例子中，受试者外周血单核细胞的大批培养物(5×106细胞)在含胰岛素原肽的合适培养基中进行起动培养。大批培养物起动培养7天后，加入IL-2(作为T细胞生长因子)，然后每隔3到4天更新。起动培养14天后，收获细胞并在缺乏IL-2的新鲜培养基中调到2×106细胞/ml48小时。48小时后，收获上清以测定细胞因子的存在。例如可维持培养物到4周，定期监测上清中细胞因子生产。冷冻上清直至分析。分析细胞因子水平的试剂盒可以商品形式买到(例如，IL-2的ELISA可从Gen-zyme获得；TNF/LT的ELISA可从R&D系统获得；IFN-γ的RIA可从Centocor获得)。另外，这些结果可与非糖尿病对照进行比较。在检测受试者I型糖尿病指标之方法的另一实施方案中，以该方法检测的免疫活性是结合到胰岛素原前体肽化合物上抗体。含免疫球蛋白的生物学样品(例如，血清)可从受试者获得并与胰岛素原肽化合物接触以测定对胰岛素原肽具特异性的抗体是否存在于该样品中。可使用标准方法检测对胰岛素原肽化合物具特异性的抗体的存在，如EL1SA和RIA。IV.抑制受试者DM-I形成或发展的方法本发明的另一方面涉及抑制受试者I型糖尿病形成或发展的方法，包含给受试者施用调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的本发明的胰岛素原肽化合物。受试者可能患有I型糖尿病，可能在该疾病的“糖尿病前期”或可能容易形成该疾病(例如，受试者可能具有I型糖尿病的遗传素质)。尽管不打算受机制的限制，但可使用本文所述的肽化合物抑制受试者DM-I的形式或进展，例如，经过排除病原性T细胞，诱导病原性T细胞的无反应性或刺激特定的抑制子途径以抑制胰岛素细胞破坏的进展。在一个实施方案中，如上面的详细描述，将本发明的刺激型胰岛素肽化合物施用给受试者以抑制I型糖尿病的形成或发展。在其它自身免疫系统的研究中已证实在体外刺激抗原特异性T细胞反应的肽可用于诱导体内T细胞耐受性。例如，在实验性自身免疫脑炎(EAE)中，保留结合MHC分子之能力的髓磷脂基础蛋白质的修饰肽在体外增强刺激T细胞的能力，当在该疾病发作前或后用药时能防止EAE诱导(例如，见Wraith，D.C.etal.(1989)Cell59247-255；Smilek，D.etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA889633-9637)。而且，对主要猫过敏原FeldI的外周T细胞耐受性可经过FeldI肽皮下表达免疫显性T细胞抗原决定簇来诱导(例如，见Briner，T.J.etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA907608-7612)。因此，经过施用产生耐受性量的该肽和/或经过以产生耐受性途径用药施用该肽可将本发明的刺激型胰岛素原肽用于调节I型糖尿病受试者T细胞反应的反应性。优选的产生耐受性用药途径是皮下注射(例如，见Brineretal.，出处同上)，口服用药(例如，见Whitacre，C.etal.(1991)J.Immunol.1472155-2163)和胸内注射(例如，见Posselt，A.M.etal.(1992)Science2561321-1324)。另外，本发明的刺激型肽化合物，如修饰的胰岛素原肽或来自与胰岛素原同源的环境或微生物抗原的修饰肽可用于免疫接种对DM-I形成敏感或诱发的个体。在合适载体中的合适的肽化合物可施用给易感性个体以排除自身攻击型免疫成份和/或产生对不与自身组织交叉反应的修饰肽化合物的保护性免疫反应。在另一实施方案中，在上面详细描述的本发明的抑制型肽化合物施用给受试者以抑制I型糖尿病的形成或进展。在其它自身免疫系统的研究中已证实抑制型肽，如MHC抑制肽(即，保留结合MHC分子的能力但不刺激T细胞反应的肽)可用于防止和/或治疗自身免疫反应。该方法成功的例子包括治疗EAE(例如，见Wauben，M.H.etal.(1992)J.Exp.Med.176667-677；Sakai，K.etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA869470-9474)，辅助关节炎(Waubenetal.，出处同上)和NOD小鼠糖尿病(例如，见Hurtenbach，U.etal.(1993)J.Exp.Med.1771499-1504)。本发明的肽化合物以适于体内药用上施用的生物学相容性形式施用给受试者，其意思是指化合物的形式是其中该试剂的治疗效果超过任何毒性效果。术语“受试者”指包括活的有机体它易于患I型糖尿病，例如，哺乳动物，特别是人类。按本文所述的化合物的施用可以以任何药学形式，包括治疗活性量，单独或与另一治疗化合物和药用上可接受的载体结合。本发明的化合物的治疗上有效量的用药定义为在剂量和时间期限内足以实现所需结果的量。例如，所需结果可包括抑制至少一种DM-I的症状，延缓或停止该疾病的进展或其它临床可得的结果。化合物的治疗有效量可根据诸如疾病状态，年龄、性别和个体体重及化合物在个体中诱导所需反应的能力的因素而变化。可调节剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，组合物可立即施用，或一些分开的剂量在一定时间期限内可每天施用。可按治疗情况的紧急状态所示按比例减小剂量。组合物中活性化合物的浓度取决于化合物的吸收，失活或排泄速率以及本领域的技术人员已知的其它因素。应注意该剂量值也随所要减轻的症状的严重性而变化。还要明白对于任何特定的受试者，具体剂量方案应根据个体需要和施用或监测该组合物施用的人的职业判断随时间进行调整，本文阐述的剂量范围仅是举例性的并不打算限制所要求的组合物的范围或实施。可施用该化合物用于预防和/或治疗处理。在治疗应用中，将该化合物以足以减轻或至少部分控制该疾病和/或其综合症的症状的量施用给易患该疾病的受试者。足以实现该目的的量称为“治疗上有效的剂量”。对该用途有效的量可大范围地变化，但本文所述的该化合物的治疗性系统剂量的非限制性例子是对于70kg的受试者其范围从每天0.1mg到大约2,000mg肽，更典型的是每天剂量从大约0.5mg到大约700mg肽。在预防应用中，该化合物以足以增强受试者自身免疫调节能力的量施用给易感染或有该疾病危险的受试者。这一量在本文称为“预防有效量”。而且，该用途的有效量可大范围地变化，本文所述的该化合物的预防性系统剂量的非限制性例子是对于70kg的受试者其范围为每天从0.1mg到大约500mg肽，更典型的是每天从大约0.5mg到大约200mg肽的剂量。该化合物可以适于实现所需结果的常规方式施用。例如，在一个实施方案中，该试剂经静脉内施用。在另一实施方案中，该试剂以口服施用。在其它实施方案中，该试剂经皮下，胸内，肌肉内或膜膜内用药。根据用药途径，该试剂可用一种物质包裹以保护该试剂免受灭活该化合物的酶，酸和其它天然条件的作用和/或以缓释配方传递该化合物。特定肽化合物，剂量、载体，用药途径等的有效性可在充分鉴定的人I型糖尿病动物模型中评价，其中在这些动物模型中的阳性结果预期在人类有效。优选的动物模型包括Biobreeding大鼠(例如，见Parfrey，N.A.etal.(1989)Crit.Rev.Immumol.945-65；Logo-thetopoulous，L.etal.(1984)Diabetes3333-36)和NOD小鼠(例如，见Kikutani.H.etal.，inAdv.Immunol.(F.J.Dixon.ed，).PP.285-323.NewYork，NYAcademicPress，(1992)。本发明以下列不应构成限制的实施例进一步说明。在本申请中引用的所有参考文献，专利和公开的专利申请的内容在此编入以供参考。实施例1胰岛素原肽特异性T细胞克隆诱导InsulitisI型糖尿病(也称为胰岛素依赖型糖尿病mellitus)是在人类和动物中发生的一种自身免疫疾病，其特征在于胰腺分泌胰岛素的胰岛β细胞被破坏。在人类流行病学研究中已证实与人MHCHLA-DR3，-DR4和-DQ3.2II型等位基因相连的一种强遗传诱因(例如，见Wolf，E.etal.(1983)Diabetologia24224-230；Platz，P.etal.(1981)Diabetologia21108-115；Warram，J.etal.(1994)inJoslin’sDiabetesMellitus，R.KahnandG.Weir(eds.).，Philadelphia，PA，Lea&Febiger，PP.201-215；和Tait，B.D.etal.，(1991)Bailliere’sClin.Endocrinol.&Metab.5211-228)。这表明在这些特异性MHCII型分子的关系中，病原性胰腺自身抗原和抗原存在与T淋巴细胞之间存在明显的联系。在本实施例中，大鼠MHCII型(RT1.B1)结合基序用于预测在2个胰岛β-细胞成份谷氨酸脱羧酶(GAD)和胰岛素前体激素胰岛素原(PI)中潜在自身反应性CD4+T细胞抗原决定簇。合成含结合基序的17个氨基酸长的GAD和PI的肽片段并用于从DA(PR)大鼠(MHC型RT.1AuB/D1E/Ca)产生肽特异性的MHCII型限制性的CD4+T细胞系。一旦建立，将对大鼠胰岛GAD和PI特异性的DA(RP)-衍生的T细胞系经吸收转移进首次用于实验的DA(RP)大鼠中。转移10天后，在接受胰岛素原特异性T细胞的大鼠胰腺中形成insulitis，而在接受GAD特异性T细胞的大鼠胰腺中观察不到insulitis。病原性PI肽特异性T细胞是CD4+/CD8-且与抗原反应分泌TH1样细胞因子。因此，本实施例用对胰岛素原肽片段具特异性的T细胞提供了一种自身免疫性insulitis的新的抗原特异性模型。在本实施例中使用下面方法材料和方法动物，具有MHC型RT1.AUB′D′E/Ca的DA(PR)大鼠用于这些实验。该大鼠品系不形成自发性insulitis或糖尿病。DA(RP)品系大鼠最初从HeinzKunz博士(Pittsburgh大学病理系，Pittsburgh，PA)处获得，繁殖群落在AnimalResearchFacilityoftheDartmouthMed-icalSchool，Lebanon，NH维持。用于实验的雄性和雌性DA(RP)大鼠年龄为50-70天。所有方法和动物照料根据NationalInstitutesofHealth关于实验室动物康乐准则进行。MHCII型结合基序肽合成以标准F-moc化学法使用Rapi-dAmideMultiplePeptideSynthesis(RaMPS)系统(NEN-Dupont，Wilmington，DE)合成含结合基序的PI和GAD肽序列。由于MHCII型限制性T细胞典型地识别13-25个氨基酸长的肽(Zamvil，S.etal.(1986)Nature324258-260；Wraith，D.C.etal.(1989)Cell59247-255)，GAD和PI肽在该基序的每一端延伸4至6个氨基酸并合成产生17个氨基酸长的肽(命名为GAD412，GAD520和PI)。而且，肽N端乙酰化使形成α-螺旋及MHC相互作用(Mains，R.etal.(1983)TrendsNewrosci，6229-235)。肽特异性T细胞系的产生和吸收转移。针对GAD412，GAD520和PI肽产生单个T细胞系。为了起动T细胞系，在加有5mg/mlH37RA(DIFCO，Detroit，MI)的完全Freund氏佐剂(CFA)中乳化肽并以200μg肽的终浓度皮内注射进DA(RP)大鼠后爪垫中，9天后，经Fluothane麻醉(AyerstLaboratories，NewYork，NY)处死大鼠以获得腘淋巴结。用镊子将淋巴结机械解离成单细胞悬液，在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗2次并重悬于含50μg/ml肽的起始培养基中。起始/增生培养基由RPMI1640，1％自身大鼠血清，5％NCTC-109(BioWhittakerProducts，Walkersville，MD)，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μg/mlfungizone(ICNBiomedicals，CostaMesa，CA)和5×10-5M2-疏基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)组成。三天后，使用Histopaque-1.077(Sigma)经密度离心收集T-淋巴细胞，在PBS中洗涤2次，重悬于含10％胎牛血清和5％来自伴D豆球蛋白A刺激的脾细胞的IL-2富集血清的培养基中。用肽体外起始刺激后使肽特异性T细胞系进入静止期7-10天，然后用带放射性的胸腺细胞(2000rad)和20μg/ml肽再刺激。为了进行吸收转移实验，在静脉内(i.v.)注射进首次用于实验的受体前抗-GAD和抗-PIT细胞用肽(20μg/ml)或促细胞分裂的植物凝血素伴刀豆球蛋白-A(5μg/ml)刺激72小时。i.v.10天后转移肽特异性T细胞(浓度范围为25-120×106)，在乙醚麻醉下处死大鼠以获得胰腺。组织在10％福尔马林中固定，石蜡包埋，切片(6微米)，封片并用苏木精和曙红染色。肽特异性T细胞系的抗原特异性和MHC限制收集肽特异性T细胞并以一式三份(5-7×104/孔)用或不用肽(5-20μg/ml)，放射性(2000rad)胸腺细胞(5×105/孔)作为抗原供给细胞(APC)，OX-3，OX-6或OX-17(抗-RT1.B和D)抗体，或W3/25(抗-CD4)，OX-8(抗-CD8)抗体共同培养72小时，包括最后用3H-胸苷(0.5μli/孔)脉冲的18小时。用液闪计数测量3H-胸苷掺入(Wallac，Gaithersburg，MD)，结果以刺激诱导±三份培养物的标准偏差(SD)表示。肽特异性T细胞的细胞因子生产情况试验了胰岛素原特异性T细胞与PI肽反应的细胞因子生产。白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)的胰岛素原肽特异性水平在使用IL-2依赖型HT-2细胞的生物测定中测量，用对大鼠IFN-γ(GIBCOBRL，Gaithers-burg，MD)特异性的ELISA测量IFN-γ生产。简单地说，在40小时时从PI-特异性T细胞，PI肽，APC+抗-MHCII类抗体的体外培养物中收集100μl等分试样的上清液进行IL-2和IL-4测定，在72小时时进行IFN-γ测定。含白细胞介素-2的上清与1×103HT-2细胞保温48小时，包括用3H-胸苷脉冲培养物的最后12小时。将含白细胞介素-4的上清与已用IL-2受体抗体(PC61.5.3，ATCC，Rockville，MD)预培养的1×103HT-2细胞保温。48小时后，收获HT-2细胞并以液闪计数测量3H-胸苷的吸收。肽特异性T细胞系的流式细胞光度术分析在测定表面抗原表达前用20μg/ml肽或5μg/ml伴刀豆球蛋白A刺激PI-特异性和GAD-特异性T细胞72小时。1×106抗-PIT细胞的样品各用第一抗体(OX-19(CD5)；w3/25(CD4)；OX-8(CD8)；R7.3(2βT细胞受体)；OX-3，OX-6，OX-17(RT1.B和RT1.D)；OX-22(CD45RC)；12.5-20μg/ml腹水蛋白；HarlanBioproductsforSci-ence，Indianapolis，IN)在冰上染色30分钟，洗涤2次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)-连接的山羊抗-小鼠F(ab)′2抗体(Cappel-OrginonTeknika，WestChester，PA)在冰上保温30分钟，洗涤2次并用1％多聚甲醛/PBS固定。对照染色为用IgG1同种型对照抗体(MOPC21，Sigma，St，Louis，MO)代替第一抗体染色细胞，另外，不染色细胞和仅用第二抗体染色细胞。在FacSan流式细胞光度计(Becton-Dickinson，LincolnPark.NJ)上分析细胞。RINm5Finsulinoma细胞RINm5Finsulinoma细胞(Gadzar，A.etal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA773519-3523)从Dr.WalterHsu，LowaStateUniversity获得。RIN细胞在补充J10％加热灭活的胎牛血清(Hyclone)，100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素和2mML-谷氨酰胺(BioWhittaker)的RPMI1640中培养。生长5天，50-70％的RIN细胞汇合后收集耗尽的RIN细胞上清。离心上清，无菌过滤并贮存于-20℃直至用于PI特异性T细胞试验。以20％v/v的浓度将RIN细胞上清加入体外的PI-特异性T细胞中。结果合成含MHC型II结合基序的胰岛素原(PI)和GAD肽并用于产生T细胞系。表I列出了合成的PI和GAD肽的氨基酸序列。图1代表大鼠胰岛素原前体，MHCII型结合基序和胰岛素裂解产物及C肽邻近关系的示意图。表I含MHCII型(RT1.B1)结合基序的全成肽的氨基酸序列a)大鼠胰岛素原**胰岛素原I47GFFYTPKSRREVEDPQV63(SEQIDNO5)胰岛素原II47GFFYTPMSRREVEDPQV63(SEQIDNO6)b)大鼠胰岛GAD412412LLQCSAILVKEKGILQG428(SEQIDNO21)c)大鼠胰岛GAD520520YIPQSLRGVPDSPERRE536(SEQIDNO22)*代表胰岛素原加工成胰岛素时的裂解位点；在胰岛素B-链和C-肽分离时Arg-Arg残基以二肽释放。经iv尾静脉注射将胰岛素原特异性和GAD-特异性T细胞系经吸收转移进DA(RP)大鼠。转移肽特异性T细胞10天后，摘取胰腺并经用苏木精和曙红染色检查组织病理学信号。与未处理的胰腺相比，接受GAD412-或GAD520-特异性T细胞的胰腺(范围＝3.0-12.0×107细胞/大鼠)中观察不到可检测的insulitis。与此相反，静脉内注射对PI肽特异性的3.0-7.0×107T细胞/大鼠导致所有DA(RP)大鼠(n＝18)发生insulitis。在PI-特异性T细胞转移10天后为止平均涉及发炎的胰岛/胰腺切片/大鼠为40＋6％(范围为每胰腺切片21-62％)。在胰腺切片中，涉及炎症的胰岛严重性从不涉及到早期胰周围炎症到显著的胰腺炎。免疫组织化学分析表明PI-诱导的胰腺炎主要由CD4+T细胞和巨噬细胞组成，后者是大鼠中延迟型过敏和自身免疫反应的渗入型细胞。考察了GAD和PI-特异性T细胞系的表型和功能特征以测定抗原特异性和MHC限制。图2显示了抗-GAD和抗-PIT细胞系和其MHCII型限制型的3H-胸苷掺入试验结果。刺激指数(S.I)定义为实验样品平均cpm除以对照孔(仅含培养基)的平均cpm。在用肽进行第二次体外刺激时对各细胞系的细胞重复3H-胸苷掺入试验2-3次。GAD和PI-特异性T细胞与其各自的肽相对应并不与含II型结合基序的其它肽发生交叉反应。含S-E结合基序的GADT细胞系的增生受加入抗-RT1.B抗体(OX-3&OX-6)而不受抗RT1.D(OX-1)抗体的抑制(图2，A组GAD412；B组GAD520)。20μg/mlPI肽对PI-特异性T细胞的增生受单独的抗RT1.B(54-67％)和RT1.D(22-25％)分子的抗体部分抑制，并受一起加入RT1.B和D抗体明显抑制(＞90％)(图2，C组)。抗-MHCII型抗体的抑制效应与各自使用的抗原供应细胞(APC)来源相同(即，DA(RP)或RT1.B/D′同类系Lewis品系大鼠)。而且，PI-特异性T细胞与胰岛素/大鼠胰腺瘤细胞系含胰岛素原的上清液反应而增生，这种增生可经加入抗RT1.B抗体而抑制。GAD特异性和PI特异性细胞增生被抗CD4而不是CD8的单克隆抗体阻止表明只有CD4阳性T细胞与GAD和PI肽发生反应。体外监测对具有或不具有MHCII型抑制抗体的PI肽发生反应的PI特异性T细胞的细胞因子生产。即使在抑制增生的抗MHCII型抗体存在的条件下，PI-特异性T细胞与PI肽反应分泌显著量的IL-2和IL-4。而且，以对大鼠IFN-γ(GIBCO)特异性的ELISA测量时PI-特异性T细胞与单独的PI肽(22.5±0.2ng/ml)反应而分泌IFNγ。与PI肽和单个II型抗体(Ox-3和Ox-17)反应的IFN-γ生产平均为23.8＋0.3ng/ml，然后在甘中与PI肽反应的3H-胸苷掺入明显受加入Ox-3和Ox-17抑制的培养物下降至12.5＋0.2ng/ml(图2.C)。T细胞系的细胞表面抗原表达使用FACScan(Becton-Dickin-son)以流式细胞光度术分析限定且在图3中显示。PI-特异性T细胞系对TcRαβ为阳性，是CD4+/CD8+表型显性且表现出可忽略的CD45RC表达(＜1％)。对GAD412和GAD520系特异性的细胞表现出的细胞表面表型相似。少数CD8+细胞中的PI-特异性T细胞系耗尽(使用磁珠；DYNAL，LakeSuccers，NY)既不丧失剩余的CD4+/CD8-细胞对PI肽有力反应的能力，也不抑制CD4+细胞经吸收转移胰腺炎的能力。因此，在DA(RP)大鼠中，似乎对PI肽片段特异性的CD4+T细胞可介导吸收转移胰腺炎，而不是对相比的GAD肽特异性T细胞介导，尽管所有肽引起有力的抗原特异性CD4+T细胞增生。为了分析GAD和PI特异性T细胞系体内抗原特异性的持久性，从用GAD-或PI特异性T细胞注射转移18天后的大鼠中取出脾。以3H-胸苷掺入测量时，用PI特异性细胞注射的大鼠中的脾细胞表现出与PI肽而不是GAD特异性反应的能力(抗-PIT细胞系与PI肽反应的刺激指数(S.I.)＝41.9VS，与GAD反应＝1.9)。同样，发现用GAD特异性T细胞注射的大鼠脾细胞对GAD肽(S.I.＝21.6)而不是PI肽(S.I.＝1.3)显著增生。而且，接受PI-特异性T细胞的大鼠胰岛在+18天比在+10天表现出更严重的胰腺炎(63±10％的胰岛涉及发炎)。用GAD特异性T细胞注射的大鼠胰腺在转移后18天仍无胰腺炎的证据显示。特别感兴趣的发现是在横跨B链和胰岛素C肽之间内源性裂解位点的胰岛素原中鉴定了病原性T细胞抗原决定基。当胰岛素原正常酶促加工成胰岛素B-链和C肽时，裂解含2个重叠结合基序的准确区域(如表I所示)使两个基序被破坏(见图1)。上述胰岛素原区域仅在胰岛β-细胞或其中以另一方式加工胰岛素原的其附近处大量完整存在。这些结果证实了病原性T细胞抗原决定基可能位于在正常酶促加工期间随后被降解的分子部分中。由于在胰腺胰岛的β细胞中发现最高浓度的胰岛素原，所以很可能该分子而不是其单个的降解产物(即胰岛素和C-肽)作为I型糖尿病病因中的自身抗原。几乎99％的胰岛素原注定经调节释放途径从β-细胞颗粒变成胰岛素，然而，剩余的胰岛素原沿组成型释放途径在分泌泡囊中传递(见Sizonenko，S.etal.(1991)Biochem.J.278621-625；Sizo-nenko.S.etal.(1993)Diabetes42933-936；Hutton，J.C.etal.(1989)Diabetologia32271-281；Halban，P.A.etal.(1991)Dia-betologia34767-778)。与I型糖尿病临床发作相关的感兴趣的发现是在最近诊断的糖尿病中循环胰岛素水平比非糖尿病高2倍多(Heaton，D.etal.(1988)Diabetologia31182-184；Heding，L.etal.(1981)Acta.Med.Scand.Suppl.656509)。在本实施例中，可使用GAD和PI肽成功地产生肽-特异性T细胞系；其中大部分在体外识别其各自的肽中是CD4+和MHCII型限制型。发现PI-特异性和GAD特异性T细胞转移后在脾中至少维持3周且保留其抗原特异性。然而，吸收转移实验显示只有PI-特异性T细胞能介导体内胰腺炎。尽管脾细胞与GAD的反应在胰腺炎可检测前出现且表明了GAD在NOD小鼠自身免疫性胰腺炎病因中的作用(见Kaufman，D.L.etal.(1993)Nature36669-72；Tisch，R.etal.(1993)Nature.36672-75)，但本试验发现对选定GAD肽特异性的大鼠T细胞不产生胰岛损伤。本试验经过证实胰岛素原反应性T细胞是以产生胰腺炎鉴定了除GAD外的另一潜在的明显自身抗原。已表明在BB大鼠中胰腺炎超前糖尿病2-3周(见Colle，E.(1990)Clin.Immunol.Immunopathol，571-9)。由于在I型糖尿病的人类和小鼠中循环胰岛素水平不明显减小，直至＞95％的胰岛被破坏(Kati，J.D.etal.(1993)Cell741089-1100)，所以不断发展中的研究是在接受PI-特异性T细胞的大鼠中监测胰腺炎和较长期间的血糖水平以确定是否明显的糖尿病是包含发炎细胞的胰岛增加的结果。实施例2胰岛素原肽-特异性T细胞克隆在BB大鼠中诱导糖尿病在与实施例1所述相似的实验中，免疫(LewisXWF)F1，BB(DP)和BB(DR)大鼠用于产生T细胞系以确定在具有RT1u单倍型的大鼠中是否胰岛素原肽也是免疫原。与在实施例1中描述的RT1′大鼠一样，全部RT1u和RT11/u大鼠发生反应。F1杂种和BB(DR)大鼠对胰岛素原肽都产生有力的，抗原特异性的显性CD4+细胞系。BB(DP)以特异性方式反应。然后将抗-PI细胞经吸收转移进首次用于实验的动物并评价动物中胰腺炎的形成和充分发展的糖尿病。非特异性的，抗PI细胞的产生糖尿病特性的阴性对照包括接受对髓磷脂碱性蛋白特异性的同源细胞系的30万个细胞的BB(DR)大鼠(不形成糖尿病或EAE)和接受相似数目的GAD特异性T细胞的大鼠(既不形成胰腺炎也不形成糖尿病)。这些研究的结果在下面表II中进行了概括表II</tables>*在(LewxWF)F1动物中，胰腺炎涉及转移10天后不到20％的胰岛；在DA(RP)中，转移10天后胰腺炎涉及超过40％的胰岛。全部吸收转移采用静脉内注射20至30万之间的激活的抗-PI细胞。将(LewisxWF)F1抗-PI细胞系注射进相同F1首次用于实验的大鼠中在一些动物中产生轻微胰腺炎，但没有一个变成糖尿病。然而，吸收型转移BB(DR)抗-PI细胞系(及随后的同样来自BB(DR)大鼠的其它抗PI-T细胞系)在BB(DR)或糖尿病前期(DP)大鼠中导致形成明显的胰岛素依赖型糖尿病mellitus。对于BB(DP)和BB(DR)大鼠，细胞转移仅在那些得到抗PI细胞的动物中导致糖尿病，未接受细胞或注入抗-GAD细胞的产仔配偶在注射时间后30天或更长保持正常。因此，本实施例证实PI-特异性T细胞当转移进遗传上合适的受体动物时足以诱导糖尿病。实施例3胰岛素原肽反应性T细胞存在于I型糖尿病人的循环中在本实施例中，研究了I型糖尿病和非糖尿病对照个体外周血以确定与人胰岛素原肽反应的T细胞是否存在于糖尿病个体中。从I型糖尿病(n＝9)和非糖尿病的，年龄相当的对照(n＝8)中获得外周血。以标准密度离心获得淋巴细胞并在人胰岛素原肽(10μg/ml)或减毒肽(10μg/ml)存在的条件下培养。肽的氨基酸序列如下人胰岛素原47GFFYTPKTRREAEDLQVG64(SEQIDNO4)减毒肽828LMQYIKANSKFIGITEL840(SEQIDNO23)为了产生抗原特异性克隆，在96-孔平板中培养2×105个细胞/孔，而为了产生抗原-特异性细胞系，在24孔平板中培养5×106个细胞/孔，均在含自身血清的培养基中培养10-14天。后来的7-14天培养期间包括添加含白细胞介素2的培养基。细胞培养起动14天后，进行抗原特异性增生试验，其中T细胞细和克隆用或不用合适的肽及带放射性的自身白细胞培养4.5天，最后12小时包括用3H-胸苷脉冲。这些数据概括在下面表III中。表III</tables>经3H-胸苷吸收作为抗原特异性增生测量值而进行的测定，在I型糖尿病人中检测到胰岛素原反应性T细胞系(9个中的8个)和克隆(9个中的9个)(100％)，而8个中仅2个(25％)非糖尿病对照从外周血表现出胰岛素原-反应性T细胞。与预期诱导抗原反应一样，发现所有受试者具有减毒反应性T细胞。因此，本实施例证实了胰岛素原-反应性T细胞系和克隆可从I型糖尿病人外周血中产生，而该细胞系和克隆不易从非糖尿病对照外周血中产生。相当实施方案本领域的技术人员使用不超出常规的实验将认识到或能确定许多相当于本文所述的本发明具体实施方案的实施方案。这些相当的实施方案试图包含在下面权利要求中。序列描述(1)一般资料(i)申请人(A)名称TrusteesofDartmouthCollege(C)城市Hanover(D)州NewHampshire(E)国家USA(F)邮编03755(ii)发明题目用于检测和治疗I型糖尿病的胰岛素原肽化合物(iii)序列数23(iv)联系地址(A)联系人LAHIVE&COCKFIELD(B)街道60StateStreet，suite510(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)国家USA(F)邮编02109-1875(v)计算机可读形式(A)媒体类型FLOPPY盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件ASCIIText(vi)最近申请资料(A)申请号US(B)申请日(C)分类(vii)以前申请资料(A)申请号US08/272,220(B)申请日08-JULY-1994(C)分类(viii)代理/代理人资料(A)姓名DeConti，GiulioA.，Jr.(B)登记号31,503(C)参考/摘要号DCI-092PC(ix)电信信息(A)电话(617)227-7400(B)电传(617)227-5941(2)SEQIDNO1资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..330(xi)序列描述SEQIDNO1AUGGCCCUGUGGAUGCGCCUCCUGCCCCUGCUGGCGCUGCUGGCCCUG48MetAlaLeuTrpMetArgLeuLeuProLeuLeuAlaLeuLeuAlaLeu151015UGGGGACCUGACCCAGCCGCAGCCUUUGUGAACCAACACCUGUGCGGC96TrpGlyProAspProAlaAlaAlaPheValAsnGlnHisLeuCysGly202530UCACACCUGGUGGAAGCUCUCUACCUAGUGUGCGGGGAACGAGGCUUC144SerHisLeuValGluAlaLeuTyr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它包含含有下式的氨基酸序列，Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2。其中Xaa和Zaa可有可无，它们代表氨基酸残基，n和m是1至15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。8.权利要求7的化合物，它是10-35个氨基酸长。9.权利要求7的化合物，它是10-20个氨基酸长。10.权利要求7的化合物，它是12-17个氨基酸长。11.权利要求7的化合物，它包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2。12.权利要求2的化合物，它抑制I型糖尿病受试者T细胞的免疫学反应。13.一种药用组合物，它包含调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物和一种药用上可接受的载体。14.权利要求13的药用组合物，其中该化合物与横跨胰岛素原B链和C肽之间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。15.权利要求14的药用组合物，其中该化合物来自人胰岛素原。16.权利要求15的药用组合物，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2。其中Xaa和Zaa可有可无，它们代表氨基酸残基，n和m是1至15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。17.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是10-35个氨基酸长。18.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是10-20个氨基酸长。19.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是12-17个氨基酸长。20.权利要求16的药用组合物，其中在该化合物中包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2。21.权利要求13的药用组合物，其中该化合物是胰岛素原肽的修饰形式。22.权利要求13的药用组合物，它包含产生耐受量的胰岛素原肽化合物。23.一种在受试者中检测I型糖尿病指标的方法，包含a)从受试者获得生物学样品；b)将该样品与刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物接触；和c)检测样品中对胰岛素原肽化合物的免疫学活性作为受试者中I型糖尿病的指标。24.权利要求23的方法，其中该化合物与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。25.权利要求24的方法，其中该化合物来自人胰岛素原。26.权利要求25的方法，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2，其中Xaa和Zaa可有可无，它代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。27.权利要求23的方法，其中检测的免疫学活性是对胰岛素原肽化合物的T细胞反应。28.权利要求23的方法，其中检测的免疫学活性是与胰岛素原肽化合物的抗体结合。29.一种抑制受试者中I型糖尿病形成或发展的方法，包含给受试者施用调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物。30.权利要求29的方法，其中的化合物与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。31.权利要求29的方法，其中该试剂是来自人胰岛素原的化合物。32.权利要求29的方法，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2，其中Xaa和Zaa可有可无，它代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。33.一种调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物用于生产抑制受试者I型糖尿病形成或进展的药物的用途。34.权利要求33的应用，其中该化合物与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。35.权利要求33的应用，其中该化合物来自人胰岛素。36.权利要求33的应用，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2，其中Xaa和Zaa可有可无，它代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。37.权利要求36的应用，其中该化合物是10-35个氨基酸长。38.权利要求36的应用，其中该化合物是10-20个氨基酸长。39.权利要求36的应用，其中该化合物是12-17个氨基酸长。40.权利要求33的应用，其中该化合物包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2。41.权利要求33的应用，其中该化合物是胰岛素原肽的修饰形式。42.权利要求33的应用，其中包含产生耐受量的胰岛素原肽化合物。权利要求1.一种胰岛素原肽化合物，它调节I型糖尿病受试者T细胞的免疫学反应。2.权利要求1的化合物，它与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。3.权利要求2的化合物，它刺激I型糖尿病受试者T细胞的免疫反应。4.权利要求3的化合物，其中的免疫学反应是T细胞增生。5.权利要求3的化合物，其中的免疫学反应是细胞因子生产。6.权利要求3的化合物，它来自人胰岛素原。7.权利要求6的化合物，它包含含有下式的氨基酸序列，Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2。其中Xaa和Zaa可有可无，它们代表氨基酸残基，n和m是1至15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。8.权利要求7的化合物，它是10-35个氨基酸长。9.权利要求7的化合物，它是10-20个氨基酸长。10.权利要求7的化合物，它是12-17个氨基酸长。11.权利要求7的化合物，它包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2。12.权利要求2的化合物，它抑制I型糖尿病受试者T细胞的免疫学反应。13.一种药用组合物，它包含调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物和一种药用上可接受的载体。14.权利要求13的药用组合物，其中该化合物与横跨胰岛素原B链和C肽之间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。15.权利要求14的药用组合物，其中该化合物来自人胰岛素原。16.权利要求15的药用组合物，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2。其中Xaa和Zaa可有可无，它们代表氨基酸残基，n和m是1至15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。17.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是10-35个氨基酸长。18.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是10-20个氨基酸长。19.权利要求16的药用组合物，其中该化合物是12-17个氨基酸长。20.权利要求16的药用组合物，其中在该化合物中包含氨基酸序列Y1-Gly-Phe-Phe-Tyr-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-Ala-Glu-(Glu/Asp)-Leu-Gln-Val-Gly-Y2。21.权利要求13的药用组合物，其中该化合物是胰岛素原肽的修饰形式。22.权利要求13的药用组合物，它包含产生耐受量的胰岛素原肽化合物。23.一种在受试者中检测I型糖尿病指标的方法，包含a)从受试者获得生物学样品；b)将该样品与刺激I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物接触；和c)检测样品中对胰岛素原肽化合物的免疫学活性作为受试者中I型糖尿病的指标。24.权利要求23的方法，其中该化合物与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。25.权利要求24的方法，其中该化合物来自人胰岛素原。26.权利要求25的方法，其中该化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2，其中Xaa和Zaa可有可无，它代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。27.权利要求23的方法，其中检测的免疫学活性是对胰岛素原肽化合物的T细胞反应。28.权利要求23的方法，其中检测的免疫学活性是与胰岛素原肽化合物的抗体结合。29.一种抑制受试者中I型糖尿病形成或发展的方法，包含给受试者施用调节I型糖尿病受试者T细胞免疫学反应的胰岛素原肽化合物。30.权利要求29的方法，其中的化合物与横跨胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域相同或基本相似。31.权利要求29的方法，其中的试剂是来自人胰岛素的化合物。32.权利要求29的方法，其中的化合物包含含有下式的氨基酸序列Y1-(Xaa)n-(Ser/Thr)-Pro-Lys-(Ser/Thr)-Arg-Arg-(Glu/Asp)-(Zaa)m-Y2，其中Xaa和Zaa可有可无，它代表氨基酸残基，n和m是从1到15的整数，Y1是氢或氨基衍生基团，Y2是氢或羧基衍生基团。全文摘要本发明公开了调节I型糖尿病受试者T细胞免疫反应的胰岛素原肽化合物。本发明的胰岛素原肽化合物优选来自包含胰岛素原B链和C肽间接头的胰岛素原区域。还公开了包含该胰岛素原肽化合物的药用组合物。对本发明的胰岛素原肽化合物的免疫反应可在受试者中用作I型糖尿病的指标。因此，本发明提供了使用胰岛素原肽化合物用于I型糖尿病的诊断试验。还公开了经过施用胰岛素原肽化合物在受试者中抑制I型糖尿病形成或发展的方法。文档编号C07K14/62GK1157621SQ95194541公开日1997年8月20日申请日期1995年7月7日优先权日1994年7月8日发明者W·F·希可,A·C·克里非申请人:达特茅斯大学理事会