专利名称：五元环化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有在医学领域是有用的例如制癌活性的生理活性的五元环化合物和制备该化合物的方法。
在这些药物中，据报道在它们的五元环上具有α,β-不饱和羰基的天然来源的前列腺素即前列腺素A和J抑制DNA合成，提示它们具有作为高度安全的制癌剂的可能用途。它们的多种衍生物被合成(参见JP-A 62-96438)。
发明目的本发明主要目的是开发具有生理活性例如制癌活性的化合物并提供制备所述化合物和包含所述化合物的药用组合物的方法。
本发明的这些和其它目的以及优点将参照附图做如下解释。
附图的简短介绍
图1说明己酰基GM的1H-NMR谱。
图2说明己酰基GM的13C-NMR谱。
图3说明己酰基GM的质谱。
图4说明己酰基GM的UV吸收谱。
图5说明己酰基GM的IR吸收谱。
图6说明二叔丁基GD的质谱。
图7说明二叔丁基GD的1H-NMR谱。
本发明概述如下。本发明第一项发明涉及式[Ⅰ]的五元环化合物或其光学异构体或其盐 其中在五元环上经虚线表示的键意指该五元环可为具有一个双键的环戊烯环或饱和的环戊烷环；如果五元环为环戊烯环，X为OR1,Y为=O和Z为H；如果五元环为环戊烷环，X为=O,Y为OR2和Z为OR3；R1为R4或-(CO)-R5；R2为H、R6或-(CO)-R7；且R3为H、R8或(CO)-R9(其中R4、R5、R6、R7、R8和R9可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，且R5、R7和R9可为H)，条件是R2和R3不同时为H；且W为从含有SH基团的化合物中除去SH基团的残基。
本发明第二项发明涉及制备式[Ⅰ]的五元环化合物或其光学异构体或其盐的方法，其特征在于该方法包括使含有SH基团的化合物与选自式[Ⅱ]化合物的化合物或其光学异构体和其盐反应， 其中R10为H、R12或-(CO)-R13；R11为H、R14或-(CO)-R15(其中R12、R13、R14和R15可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，且R13和R15可为H)，条件是R10和R11不同时为H。
本发明第三项发明涉及药用组合物，例如制癌组合物或用于诱导细胞凋亡的组合物，它包含作为活性成分的至少一种选自本发明第一项发明的五元环化合物的化合物或其光学异构体和其盐。本发明详细描述按照化学合成方法，使用以下式[Ⅲ]的4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(在下文中简单称作环戊烯酮)例如 作为原料，不加限制，能够得到在本发明中使用的式[Ⅱ]化合物。
在本发明中使用的环戊烯酮包括具有在4-和5-位以顺式构型存在的羟基的异构体和具有以反式构型存在的羟基的异构体。环戊烯酮的顺式或反式异构体或者顺式和反式异构体的混合物可用于本发明中。也可使用它们的光学异构体。
按照化学合成方法[Helvetica Chimica Acta,55:2838-2844(1972)]，得到环戊烯酮的顺式异构体。按照化学合成方法[CarohydrateRes.,247:217-222(1993)]或通过加热糖醛酸(例如葡糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡糖醛酸内酯)等，得到环戊烯酮的反式异构体(参见WO98/13328)。
例如，通过在121℃下将作为糖醛酸的1％的D-葡糖醛酸溶液加热4小时，在热处理的产物中产生环戊烯酮。用溶剂提取在热处理的产物中的环戊烯酮。浓缩提取液。然后经硅胶柱层析分离浓缩液。把包含环戊烯酮的洗脱部分浓缩。用氯仿从浓缩液中提取环戊烯酮。将浓缩的提取液经正相柱层析，由此分离在热处理的产物中的环戊烯酮。
经光学拆分如此分离的环戊烯酮，能够得到光学异构体(-)-4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。当然，可光学拆分所合成的环戊烯酮。
例如，将环戊烯酮溶于乙醇中。另外将己烷/乙醇(94/6)加入到在乙醇中的溶液中以制备环戊烯酮溶液。通过把该样品溶液经HPLC，能够光学拆分环戊烯酮，例如，在以下条件下Chiralpack AS(DicelChemical Industries)柱；柱温40℃；流动相己烷/乙醇(94/6)。
通过使环戊烯酮和/或其光学异构体同时或相继与具有氢、脂族基团、芳族基团或芳脂族基团的羧酸和/或其反应衍生物反应，在反应混合物中产生式[Ⅳ]化合物或其光学异构体 其中R16为H或-(CO)-R18；R17为H或-(CO)-R19；R18和R19可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，条件是R16和R17不同时为H。
以下具有氢、脂族基团、芳族基团或芳脂族基团并相应于式[Ⅳ]化合物中R18和R19的羧酸用于本发明中。
甲酸能够用作具有氢的羧酸。
具有烷基的羧酸和具有链烯基的羧酸能够用作具有脂族基团的羧酸。
具有线性或分支烷基的羧酸能够用作具有烷基的羧酸。尽管依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定能够适宜选择烷基链的长度，C1-30的基团通常为优选。
能够使用的具有线性烷基的羧酸的实例包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸和三十烷酸。
能够使用的具有分支烷基的羧酸的实例包括异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、新戊酸、4-甲基戊酸和1,2-二甲基戊酸。
具有线性或分支链烯基的羧酸能够用作具有链烯基的羧酸。尽管依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，能够适宜选择链的长度、链烯基的不饱和键的不饱和度和位置，C2-30的链烯基通常为优选。
能够使用的具有线性链烯基的羧酸的实例包括丙烯酸、乙烯基乙酸、丁烯酸、异丁烯酸、烯丙基乙酸、2-己烯酸、3-己烯酸、3-辛烯酸、4-十碳烯酸、1 0-十一烯酸、9-十六烯酸、6-十八烯酸、反式9-十八碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、桐酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、(z)-Δ13-二十二碳烯酸、顺式13-二十二碳烯酸、二十二碳六烯酸、二十六碳-17-烯酸和21-三十碳烯酸。
能够使用的具有分支链烯基的羧酸的实例包括甲基丙烯酸、顺式-2-甲基-2-丁烯酸、当归酸和α-乙基丁烯酸。
具有C1-4低级烷氧基作为取代基的烷基的羧酸如甲氧基乙酸能够用作具有取代脂族基团的羧酸。能够使用具有C2-5低级烷氧基羰基作为取代基的链烯基的羧酸如甲基马来酸。
能够使用的具有芳族基团的羧酸的实例包括具有C6-11芳基的羧酸，例如苯甲酸、甲苯甲酸、氯代苯甲酸、溴代苯甲酸、硝基苯甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、水杨酸、乙酰水杨酸、乙酰水杨酰基水杨酸、氨基水杨酸、对羟基苯甲酸、氨基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、乙酰胺基苯甲酸、香草酸、4,6-二羟-2-甲苯甲酸、萘甲酸、辛可部酸、黄尿酸、奎尼酸和犬尿喹啉酸。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，可选择含有所使用芳族基团的羧酸。
能够使用的具有芳脂族基团的羧酸的实例包括具有C1-30烷基C6-10芳基的羧酸，例如苯乙酸、苯丙酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸、肉桂酸、α-苯基丙烯酸和萘基乙酸。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，可选择具有所使用芳脂族基团的羧酸。
如在此使用的那样，脂族基团的实例包括线性或分支C1-30烷基和线性或分支C2-30链烯基。芳族基团的实例包括C6-10芳基。芳脂族基团的实例包括C1-30烷基C6-10芳基。这些基团可具有至少一个选自包括C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、卤素(例如氟、氯、溴或碘)、氨基、羟基、硝基、氧代基团、硫羟基团和硫酸根基团的官能团的取代基。
羧酸的反应衍生物通过酰卤、酸酐、羧酸酯和盐举例说明。依目的而定，可生成所使用羧酸的反应性衍生物。
羧酸和/或其反应性衍生物与环戊烯酮的反应可进行以致于在式[Ⅳ]化合物中的R16和R17为彼此相同的或不同的，或者以致于R16和R17中的一个保留是未反应的H。换言之，环戊烯酮中两个羟基中的两个或一个可反应。具有R18和R19的不同基团的羧酸和/或其反应衍生物可同时与环戊烯酮反应。或者，它们可相继反应。在后者情况中，通过保护环戊烯酮中的一个羟基，能够有效生成其中R18和R19为彼此不同或者其中R16和R17中仅有一个被酯化的化合物。
通过使环戊烯酮和/或其光学异构体同时或相继与含有脂族基团和芳族基团或芳脂族基团的醇和/或其反应衍生物反应，在反应混合物中产生式[Ⅴ]化合物或其光学异构体 其中R20和R21可为彼此相同的或不同的，并为氢、脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，条件是R20和R21不同时为H。
如上描述在本发明中使用的与式[Ⅴ]化合物中R20和R21相应的脂族基团、芳族基团或芳脂族基团。具有这样基团的醇类的实例包括如下。
具有烷基的醇和具有链烯基的醇能够用作具有脂族基团的醇。
具有线性或支链烷基的醇能够用作具有烷基的醇。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，能够适宜选择烷基的链长度。
能够使用的具有线性烷基的醇的实例包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇和十八烷醇。
能够使用的具有分支烷基的醇的实例包括异丁醇、叔丁醇、异戊醇和叔戊醇。
具有线性或分支链烯基的醇能够用作具有链烯基的醇。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，能够适宜选择链的长度、链烯基的不饱和键的不饱和度和位置。
能够使用的具有线性链烯基的醇的实例包括乙烯醇、烯丙醇、巴豆醇和3-己烯-1-醇。
能够使用的具有分支链烯基的醇的实例包括香叶醇、法呢醇、香叶基香叶醇、视黄醇、芳樟醇、橙花叔醇和橙花醇。
能够使用的具有芳族基团的醇的实例包括苯酚、甲氧甲苯酚、硝基苯酚、氯代苯酚、溴代苯酚、儿茶酚、间苯二酚、氢醌和萘酚。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，可选择具有所使用芳族基团的醇。在此其中羟基直接连接到芳族基团上的上述化合物分类为醇。
能够使用的具有芳脂族基团的醇包括苄醇、苯乙醇、苯甲酰甲醇、苯代乙二醇和苯基丙醇。依本发明化合物的生物活性、溶解性等而定，可选择具有所使用芳脂族基团的醇。
醇的反应衍生物通过烷基卤、芳基卤、羧酸酯、重氮化合物、盐和其为醇的脱水产物的链烯举例说明。依目的而定，可生成所使用醇的反应衍生物。
醇和/或其反应性衍生物与环戊烯酮的反应可进行以致于在式[Ⅴ]化合物中的R20和R21为彼此相同的或不同的，或者以致于R20和R21中的一个保留是未反应的H。换言之，环戊烯酮中两个羟基中的两个或一个可反应。具有R20和R21的不同基团的醇和/或其反应衍生物可同时与环戊烯酮反应。或者，它们可相继反应。通过保护环戊烯酮中的一个羟基，能够有效生成其中R20和R21为彼此不同的化合物或者其中R20和R21中仅有一个被醚化的环戊烯酮衍生物。
此外，通过使环戊烯酮与醇和/或其衍生物和羧酸和/或其衍生物同时或相继反应，能够生成其中环戊烯酮的一个羟基被醚化而另一个羟基被酯化的化合物。
已知的纯化方法包括化学方法和物理方法可用于式[Ⅱ]化合物(例如，式[Ⅳ]或式[Ⅴ]化合物或其光学异构体)的纯化和分离。常规纯化方法例如硅胶过滤、使用分子量分级滤膜、溶剂提取、分馏和多种层析法(使用例如离子交换树脂)能够用于从反应产物中联合纯化和分离式[Ⅱ]化合物或其光学异构体。
式[Ⅱ]化合物包括在4-和5-位以顺式构型存在的异构体和在4-和5-位以反式构型存在的异构体。所述化合物的顺式或反式异构体或者顺式或反式异构体的混合物可用于本发明中。也可使用它们的光学异构体。
式[Ⅱ]化合物或其光学异构体的盐包括，例如药学上可接受的盐。已知方法能够用于这样的转变。
通过使式[Ⅱ]化合物或其光学异构体和/或其盐与含有SH的化合物反应，在反应混合物中可得到本发明化合物。
例如，在酸性条件下，通过使式[Ⅱ]化合物、其光学异构体和/或其盐与含有SH基团的化合物如含有SH基团的氨基酸或其衍生物反应，在反应混合物中得到式[Ⅵ]化合物(在下文中称作环戊烯酮硫代衍生物) 其中R22为R23或-(CO)-R24；R23和R24为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团；R24可为H；且W为其中从含有SH基的化合物中除去SH基的残基。
另外，在中性条件下，通过使式[Ⅱ]化合物、其光学异构体和/或其盐与含有SH基团的化合物如含有SH基团的氨基酸或其衍生物反应，在反应混合物中得到式[Ⅶ]化合物(在下文中称作环戊酮硫代衍生物) 其中R25为H、R27或-(CO)-R28；R26为H、R29或-(CO)-R30；R27、R28、R29和R30可为彼此相同的或不同的，且为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团；R28和R30可为H；条件是R25和R26不同时为H。
含有SH基团的化合物的实例包括(但不局限于)甲硫醇、丁硫醇、巯基乙醇、含有SH基团的氨基酸和含有SH基团的氨基酸的衍生物。含有SH基团的氨基酸的实例包括半胱氨酸和高半胱氨酸。
根据以上提到的氨基酸衍生物举例说明含有SH基团的氨基酸的衍生物，例如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽类和含有半胱氨酸衍生物的肽类。含有半胱氨酸的肽类并不局限于具体的肽类，只要所述肽具有作为其成分的半胱氨酸即可。本发明的含有半胱氨酸的肽类包括小分子例如低聚肽(如谷胱甘肽)和大分子例如蛋白质。另外，通过在反应期间生成含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽类的条件下，例如在还原条件下加入处理步骤，含有胱氨酸或高胱氨酸的肽类可用作本发明的含有含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽类。含有半胱氨酸的肽类也包括含有糖类、类脂等的含有含有半胱氨酸的肽类。或者，也可使用如同以上所述的多种物质的盐、酸酐、酯等。
如以上描述的那样，通过使式[Ⅱ]化合物与含有SH基团的化合物反应，可形成本发明化合物。
包括化学方法和物理方法在内的已知纯化方法可用于纯化和分离由式[Ⅱ]化合物或其光学异构体和/或其盐与含有SH基团的化合物例如含有SH的氨基酸或其反应衍生物或其光学异构体反应生成的本发明化合物。常规纯化方法例如凝胶过滤法、使用分子量分级滤膜、溶剂提取法、分馏法和使用例如离子交换树脂的多种层析法能够联合用于从反应产物中纯化和分离本发明化合物或其光学异构体或其盐。
例如通过将环戊烯酮、正己酸、二甲基氨基吡啶和N,N’-二环己基碳二亚胺溶于二氯甲烷中并使该混合物反应生成的二己酰基环戊烯酮能够经硅胶柱层析法纯化。
例如通过使等摩尔的二己酰基环戊烯酮与谷胱甘肽(还原)反应，在反应衍生物中生成的式[Ⅷ]的环戊烯酮硫代衍生物随后能够通过使含有所述衍生物的反应混合物经过硅胶柱层析法纯化和分离。 另外，例如通过将环戊烯酮、叔丁基-2,2,2-三氯乙酰亚胺酸酯和三氟化硼乙醚复合物溶于二氯甲烷中并使混合物反应生成的4,5-二叔丁基环戊烯酮醚能够经薄层硅胶层析法纯化。
例如通过使4,5-二叔丁基环戊烯酮醚与谷胱甘肽(还原)反应，在反应混合物中生成的式[Ⅸ]的环戊酮硫代衍生物随后能够通过使含有所述衍生物的反应混合物经过硅胶柱层析法纯化和分离。 通过外消旋体混合物的机械拆分、选择性结晶、通过结晶拆分为非对映体盐或包合物、使用酶或微生物的动力学拆分、层析分离法等，能够分离本发明化合物的光学异构体使用适宜的手性固定相的气相层析法、液相层析法、薄层层析法等能够用于层析拆分。
使用手性固定相的方法、使用手性流动相的方法、分离为非对映体等的方法能够用于经过液相色谱法的光学拆分。
酰胺型固定相、脲型固定相、配体交换型固定相、多糖或多糖衍生物固定相、蛋白质固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等能够用作手性固定相。
依使用的固定相而定，己烷型流动相、醇型流动相、含水(缓冲液)流动相等能够适宜用作洗脱剂。
本发明化合物的盐或其光学异构体包括药学上可接受的盐。已知方法能够用于所述转化。
本发明化合物或其光学异构体或其盐具有生理活性例如制癌活性、抗肿瘤细胞的抗增生活性和诱导细胞凋亡活性。基于这些活性，包含作为活性成分的至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物的药用组合物是有用的，例如作为起抗癌症疾病作用的药用组合物例如制癌组合物或预防癌症的组合物。因此，根据本发明得到的药用组合物，作为用于对本发明化合物或其光学异构体或其盐敏感的疾病的药用组合物例如治疗或预防癌症的药用组合物是非常有用的。
本发明化合物或其光学异构体或其盐具有抗以下肿瘤细胞的抗增生活性或制癌活性，所述细胞包括例如人前髓细胞白血病细胞HL-60、人急性淋巴细胞白血病细胞MOLT-3、肺癌细胞A549、SV-40变形肺细胞WI-38VA13、肝癌细胞Hep G2、结肠腺癌细胞HCT116、人结肠腺癌细胞SW480、人结肠腺癌细胞WiDr、胃腺癌细胞AGS和骨髓瘤细胞。另外，这些化合物在肿瘤细胞中具有诱导细胞凋亡活性。本发明化合物或其光学异构体或其盐的抗肿瘤细胞的抗增生作用模式并不局限于本发明。
使用选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的至少一种具有制癌活性的化合物作为活性成分，并把它与已知药用载体一起配制，能够制成制癌组合物。通过将至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物与药学上可接受的液体或固体载体和任选溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等混合以配制它，一般能够制成本发明的制癌组合物。所述制剂可以固体制剂例如片剂、颗粒、散剂、撒布粉剂和胶囊剂的形式，或者以液体制剂例如正常溶液、混悬剂和乳剂的形式存在。另外，通过使用前加入适宜的载体，所述组合物可配制成其能够复制为液体制剂的干燥制剂。
按照以上提到的具体的给药途径和剂型，能够选择药用载体。例如对口服制剂而言，可使用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在口服制剂中也能够包括粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、鲜味剂、着色剂、矫味剂等。
通过将本发明活性成分，即至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物溶解于或悬浮于稀释剂中，按照常规方法能够制备非肠道制剂。所述稀释剂包括注射蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇和聚乙二醇。可任选将杀菌剂、稳定剂、渗透调节剂、光滑剂等加入到该溶液或悬浮液中。
本发明制癌组合物通过适宜于组合物剂型的途径来给药。给药途径并不局限于具体的某一种。能够内部或外部(或局部)或者注射给予组合物。例如，能够静脉、肌内、皮下、皮内等给予注射制剂。外用制剂包括栓剂。
适当确定制癌组合物的剂量并且依照具体的剂型、给药途径和目的以及所治疗患者的年龄、体重和症状而变化。根据选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物含在制剂中的量，成人每天剂量一般为0.1μg至200mg/kg。当然，剂量能依多种因素而变化。因此，在一些情况下，比以上更低的剂量可能是足够的，但是在另外一些情况下，则可能需要比以上更高的剂量。本发明的药用组合物可以其本身那样口服给药，或者能够通过加入到选择的食物和饮料中每日服用。
通过使用作为活性成分的至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的具有诱导细胞凋亡活性的化合物，按照如同以上描述的与制癌组合物的相同的方法能够制备本发明诱导细胞凋亡的组合物。按照如同以上描述的与制癌组合物的相同的方法能够给予它们。
按照以上所述与制癌组合物相同的方法，适当确定诱导细胞凋亡组合物的剂量。根据选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物在制剂中的量，成人每天剂量一般为0.1μg至100mg/kg。当然，剂量能依多种因素而变化。因此，在一些情况下，比以上更低的剂量可能是足够的，但是在另外一些情况下，则可能需要比以上更高的剂量。本发明的药用组合物可以其本身那样口服给药，或者能够通过加入到选择的食物和饮料中每日服用。
细胞凋亡被认为是在细胞基因组中原始编程性的死亡，并且不同于其为病理性细胞死亡的坏死。更详细地讲，认为以下过程导致死亡。由一些外部或内部因素触发的激活编程细胞凋亡的基因引起以该基因为基础的程序性死亡蛋白的生物合成。这样生成的程序性死亡蛋白摧毁细胞。用于诱导细胞凋亡的本发明组合物可诱导所需组织或细胞中细胞凋亡，而且因为该组合物能从活体中以自然方式消除不必要的或致病的细胞而显得特别有用。
本发明用于诱导细胞凋亡的组合物能够用于诱导细胞凋亡的方法中。更详细地讲，至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物能够用作活性成分来诱导细胞凋亡。所述方法用于阐明细胞凋亡的诱导作用机制，以及用于筛选细胞凋亡诱导剂和细胞凋亡诱导作用的抑制剂。
本发明化合物或其光学异构体或其盐具有生理活性例如制癌活性、抗肿瘤细胞的抗增生活性和诱导细胞凋亡活性。基于这些活性，包含至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物的食物或饮料用作具有以上提到的多种生理活性的功能性食物或饮料。
本发明化合物也用于生产本发明的食物或饮料，该化合物在使用通式[Ⅱ]化合物和含有SH基团的化合物的生产过程中被制备。
功能性食物或饮料包括包含至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物的食物或饮料，通过稀释该化合物来生产的食物或饮料和/或通过向其中加入该化合物来生产的食物或饮料。
生产功能性食物或饮料的方法并不局限于具体某一种。可以使用任何方法包括用于生产食物或饮料的烹饪、加工和其它一般使用的方法，只要生成的食物或饮料包含有效量的至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的具有生理活性的化合物即可。
功能性食物或饮料的形式包括(但不局限于)任何可食用的形式，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、凝胶剂、溶胶剂等，只要它们包含具有生理功能例如制癌活性或诱导细胞凋亡活性的至少一种选自本发明化合物或其光学异构体和其盐的化合物，只要它们通过向其中加入该化合物来生产和/或它们通过稀释该化合物来生产即可。
所述功能性食物或饮料含有具有生理活性的本发明化合物或其光学异构体或其盐。基于所述化合物的多种生理活性例如制癌活性和诱导细胞凋亡活性，这些功能性食物或饮料用作当服用时具有预防癌发生的作用、抑制癌症的作用等的健康食物或饮料。因此，它们用于维持生物体的体内稳态，特别用于保持胃肠道的健康。
当给予生理有效量的本发明化合物或其光学异构体或其盐时，未观察到毒性。例如，当在1000mg/kg的单次剂量下口服给予大鼠一种式Ⅲ化合物或者式Ⅸ化合物或其光学异构体或其盐时，未观察到死亡。
如上所述，在广泛领域包括药品、食品和饮料中，基于它们的多种生理功能，本发明化合物或其光学异构体或其盐是非常有用的。在食品或饮料中，本发明化合物也能够作为式Ⅱ化合物与含有SH基团的化合物(例如，含SH基团的氨基酸)或其衍生物(例如，含半胱氨酸的肽)的反应产物来产生。在本发明中也包括这种人工生成的化合物的用途。
环戊烯酮和2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮(环戊烯酮与含有SH基的化合物之间的反应产物)具有治疗病毒感染的作用。因此，提供包含作为活性成分的环戊烯酮和/或2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮的抗病毒组合物。
通过使用作为活性成分的至少一种选自环戊烯酮或其光学异构体和其盐的化合物以及2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮或其光学异构体和其盐，按照如同以上描述的与制癌组合物的相同的方法能够制备抗病毒组合物。按照如同以上描述的与制癌组合物的相同的方法能够给予它们。
按照如同以上描述的与制癌组合物相同的方法，适当测定抗病毒组合物的剂量。按照包含在制剂中的所述化合物的量，成人每日剂量一般为0.1μg至100mg/kg。当然，剂量能依多种因素而变化。因此，在一些情况下，低于以上的剂量可能是足够的，而在另外一些情况下，则可能需要高于以上的剂量。
通过使用作为活性成分的选自在抗病毒组合物中所用的这些化合物中的化合物，能够产生用于掺入有机体的抗病毒农药、抗病毒食物和抗病毒组合物。
当在100mg/kg的单次剂量下口服给予小鼠环戊烯酮时，未观察到死亡。当在1000mg/kg的单次剂量下口服给予大鼠2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮时，也未观察到死亡。
如上所述，环戊烯酮和2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮用作抗病毒化合物。
以下实施例进一步详细阐明本发明但对它们的范围不构成限制。实施例中的百分比(％)意指重量百分比。参考实施例1(1)将10g D-葡糖醛酸(Sigma,G 5269)溶于1升水中。在121℃下，把该溶液加热4小时，然后减压下浓缩至大约10ml的体积。向其中加入40ml乙酸丁酯∶乙酸∶水=3∶2∶2的混合物的上层液并混合。减压下浓缩经离心该混合物得到的上清液至大约10ml的体积。
将提取物加到用于柱层析(2×28cm,Fuji Sylysia)的硅胶BW-300SP上。在0.2kgcm2压力下使用压缩机并在5ml/mm的流速下，使用乙酸丁酯∶乙酸∶水=3∶2∶2的上层液作为洗脱液，进行分离。每部分含有10ml的分离洗脱液。在薄层层析法上分析每部分中的一份。结果，第61至第80的部分含有高纯度的环戊烯酮。收集这些部分并减压下浓缩。用40ml氯仿提取浓缩液。减压下浓缩提取液，得到100mg环戊烯酮。
使用Palpack型S柱(Takara Shuzo)在正相HPLC上分离制备液并在215nm下的紫外吸收基础上检测。该方法证实所述制备液具有98％的纯度。
(2)将按照在参考实施例1-(1)中描述的方法得到的113.9mg环戊烯酮溶于2.85ml乙醇中。另外把385ml己烷/乙醇(94/6)加入到在乙醇中的溶液中以制备17ng/ml环戊烯酮溶液。将该溶液经0.5-μm滤膜过滤以得到用于光学拆分HPLC的样品溶液。
在以下描述的条件下，将样品溶液经光学拆分HPLC。分别从前一个峰和后一个峰分开收集含有环戊烯酮的(-)异构体和(+)异构体的部分。减压下把所述部分蒸发至于，得到43.2mg环戊烯酮的(-)异构体和43.2mg的(+)异构体。
光学拆分HPLC条件柱Chiralpack AS(Dicel Chemical Industries,2.0cm×25.0cm)；柱温40℃；流动相己烷/乙醇(94/6)；流速14.0ml/min；检测UV 210nm；注射样品的量150μl(2.55mg)。
因为生成的环戊烯酮的(-)异构体和(+)异构体两者含有大约1％的对映体，在以上提到的条件下将它们再次光学拆分。结果，从前一个峰的30.0mg的(-)异构体中得到19.7mg无对映体的环戊烯酮(-)异构体。从后一个峰的37.4mg的(+)异构体中得到27.7mg无对映体的环戊烯酮的(+)异构体。光学拆分HPLC中环戊烯酮(-)异构体的洗脱时间为33分钟，而(+)异构体的洗脱时间为40分钟。
(3)将1ml无水吡啶(Nacalai Tesque,295-26)和0.1ml乙酸酐(Nacalai Tesque,002-26)加入到如在参考实施例1-(1)中描述的那样得到的29.6mg环戊烯酮中。在室温下，将该混合物搅拌3小时。用氯仿提取该反应混合物，得到36mg二乙酰基环戊烯酮。
使用DX302质谱仪(Nippon Denshi)，进行生成的二乙酰基环戊烯酮的质谱分析。另外，将二乙酰基环戊烯酮溶于CDCl3中并使用核磁共振仪JNM-A500(Nippon Denshi)，通过NMR进行结构分析。结果显示如下。假设氯仿的化学位移值为7.24ppm，表达1H-NMR的化学位移值。
MS m/z 199(M+H)+1H-NMRδ2.12(3H,S,-OCOCH3),2.16(3H,S,-OCOCH3),5.16(1H,d,J=3.0Hz,H-5),5.89(1H,m,H-4),6.40(1H,d-d,J=15,6.5Hz,H-2),7.43(1H,d-d,J=2.5,6.5Hz,H-3)。
(4)将如在参考实施例1-(2)中描述的那样得到的15.9mg环戊烯酮(-)异构体用于进行如在参考实施例l-(3)中描述的反应,得到15.1mg二乙酰基环戊烯酮(-)异构体。当所述异构体经如同在参考实施例1-(3)中描述的那样通过质谱和核磁共振谱进行结构分析时，得到与参考实施例1-(3)中相似的结果。
(5)将如在参考实施例1-(2)中描述的那样得到的16.7mg环戊烯酮(+)异构体用于进行如在参考实施例1-(3)中描述的反应，得到18.8mg二乙酰基环戊烯酮(+)异构体。当所述异构体如同在参考实施例1-(3)中描述的那样通过质谱和核磁共振谱进行结构分析时，得到与参考实施例1-(3)中相似的结果。
(6)将44.3mg苯甲酸(Nacalai Tesque,041-20)、7.5mg二甲基氨基吡啶(DMAP,Tokyo Kasei Kogyo,D1450)、51.0mg N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,Peptide Institute,1001)和5ml氯仿加入到13.8mg环戊烯酮中。在冰上将混合物搅拌4小时。将经过滤反应混合物得到的滤液加到硅胶柱(75ml)上并用氯仿洗脱，得到含有二苯甲酰基环戊烯酮的部分。减压下除去所述部分中的溶剂，把残余物溶于乙醇，使用氯仿和甲醇99∶1的混合物作为展开剂，以硅胶薄层层析法分离该溶液。从薄层上刮下Rf=0.45-0.55的硅胶并用氯仿提取，得到3.2mg二苯甲酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(3)中描述的那样，将由此得到的二苯甲酰基环戊烯酮经质谱和核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
MS m/z 323(M+H)+1H-NMRδ5.56(1H,d,J=3.0Hz,H-5),6.30(1H,m,H-4),6.54(1H,d-d,J=1.5,6.5Hz,H-2),7.44(4H,m,芳环的H),7.58(2H,m，芳环的H)，7.64(1H,d-d,J=2.0,6.5Hz,H-3),8.06(4H,m，芳环的H)。
(7)将22.1mg环戊烯酮的(-)异构体、71.9mg苯甲酸、12.1mgDMAP和80.3mg的DCC用于进行如在参考实施例1-(6)中描述的反应中，得到192mg环戊烯酮的二苯甲酰基(-)异构体。当所述异构体如同在参考实施例1-(6)中描述的那样经质谱和核磁共振谱进行结构分析时，得到与参考实施例1-(6)中那些相似的结果。
(8)将20.4mg环戊烯酮的(+)异构体、65.6mg苯甲酸、11.0mg的DMAP和74.3mg的DCC用于进行如在参考实施例1-(6)中描述的反应中，得到21.4mg环戊烯酮的二苯甲酰基(+)异构体。当所述异构体如同在参考实施例1-(6)中描述的那样经质谱和核磁共振谱进行结构分析时，得到与参考实施例1-(6)中相似的结果。
(9)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和153mg己酸(NacalaiTesque,070-26)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，分离反应混合物并经硅胶薄层层析法纯化。从薄层上刮下Rf=0.3-0.4的硅胶并用氯仿提取，得到11mg二己酰基环戊烯酮。
将由此得到的二己酰基环戊烯酮溶于CDCl3中，使用核磁共振仪JNM-EX270 FT NMR系统(Nippon Denshi)经核磁共振(NMR)证实。假设四甲基硅烷的化学位移值为0ppm，表达1H-NMR的化学位移值。
结果显示如下。
1H-NMRδ7.44(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.98Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.32Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),2.42(2H,t,J=7.26Hz),2.38(2H,t,J=7.76Hz),1.65(4H,m),1.26(8H,m),0.88(6H,t)。
(10)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和301mg肉豆蔻酸(Tokyo Kasei Kogyo,M0476)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.45-0.55的硅胶并用氯仿提取，得到53mg二肉豆蔻酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二肉豆蔻酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.45(1H,dd,J2-3=5.94Hz,J3-4=2.31Hz,H-3),642(1H,dd,J2-3=5.31Hz,J3-4=1.32Hz,H-2),5.92(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.64Hz,H-5),2.42(2H,t,J=7.26Hz),2.38(2H,t,J=7.91Hz),1.63(4H,m),1.26(32H,m),0.88(6H,t)。
(11)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和190mg辛酸(NacalaiTesque,07l-11)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.25-0.35的硅胶并用氯仿提取，得到27mg二辛酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二辛酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.44(1H,dd,J2-3=6.1Hz,J3-4=2.16Hz,H-3),6.41(1H,dd,J2-3=6.1Hz,J3-4=1.48Hz,H-2),5.92(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),2 42(2H,t,J=7.59Hz),2.38(2H,t,J=7.91Hz),1.65(4H,m),1.29(16H,m),0.88(6H,t)。
(12)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和190mg 3-辛烯酸(Tokyo Kasei Kogyo,00070)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.25-0.35的硅胶并用氯仿提取，得到25mg二-3-辛烯酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二-3-辛烯酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.44(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=2.32Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.49Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.55(4H,m),5.16(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),3.12(4H,dd,J=12.85Hz,J=6.59Hz),2.04(4H,m),1.33(8H,m),0.89(6H,t)。
(13)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和115mg正丁酸(TokyoKasei Kogyo,B0754)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.20-0.30的硅胶并用氯仿提取，得到16mg二丁酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二丁酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.45(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=2.13Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.65Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.64Hz,H-5)。
(14)将30mg环戊烯酮、10mg的DMAP和226mg正癸酸(TokyoKasei Kogyo,D0017)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上冷却的同时，向其中加入108mg的DCC。反应1小时后，使用氯仿作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.35-0.45的硅胶并用氯仿提取，得到35mg二癸酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二癸酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.44(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.97Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.3Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.15(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),2.42(2H,t,J=7.24Hz),2.38(2H,t,J=7.91Hz),1.65(4H,m),1.26(24H,m),0.88(6H,t)。
(15)将30 mg环戊烯酮、16mg的DMAP、66mg三乙胺(TokyoKasei Kogyo,T0424)和122mg正戊酸酐(Tokyo Kasei Kogyo,V0006)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上使该混合物反应1小时。使用氯仿∶甲醇=200∶1作为展开剂，经硅胶薄层层析法分离反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.7-0.8的硅胶并用氯仿提取，得到39mg二戊酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二戊酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.45(1H,dd,J2-3=6.11Hz,J3-4=1.66Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.11Hz,J3-4=1.66Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),2.43(2H,dd,J=7.59,7.59Hz),2.39(2H,dd,J=7.59,7.59Hz),1.65(4H,m),1.38(4H,m),0.93(6H,dd,J=7.26,7.26Hz)。
(16)将30mg环戊烯酮、16mg的DMAP、66mg三乙胺和86mg丙酸酐(Tokyo Kasei Kogyo,P0513)溶于5.9ml二氯甲烷中。在冰上使该混合物反应1小时后。使用氯仿∶甲醇=200∶1作为展开剂，经硅胶薄层层析法展开反应混合物。从薄层上刮下Rf=0.5-0.6的硅胶并用氯仿提取，得到31mg二丙酰基环戊烯酮。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二丙酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ7.45(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=2.15Hz,H-3),6.42(1H,dd,J2-3=6.27Hz,J3-4=1.49Hz,H-2),5.91(1H,m,H-4),5.16(1H,d,J4-5=2.97Hz,H-5),2.46(2H,dd,J=15.01,7.59Hz),2.42(2H,dd,J=15.01,7.59Hz),1.18(6H,dd,J=7.59,7.59Hz)。
(17)将2g环戊烯酮、733mg的DMAP、4.1ml反式-2-己烯酸(Tokyo Kasei Kogyo,H0383)和5.57g的DCC溶于200ml二氯甲烷中。在室温下，使混合物反应2小时。使用己烷∶乙酸乙酯=8∶1作为溶剂，使反应混合物经硅胶柱层析法，得到在硅胶薄层层析法生成单一斑点的部分。减压下浓缩该部分，得到大约900mg二-2-己烯酰基环戊烯酮的油。
如同在参考实施例1-(9)中描述的那样，将由此得到的二-2-己烯酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ0.92(6H,m,11-H+11’-H),1.48(4H,m,10-H+10’-H),2.18(4H,m,9-H,9’-H),5.22(1H,d,J=3.0Hz,5-H),5.85(2H,m,7-H+7’-H),5.98(1H,m,4-H),6.41(1H,dd,J=1.0,6.0Hz,2-H),7.04(2H,m,8-H+8’-H),7.47(1H,dd,J=2.0,6.0Hz,3-H)。
将在环戊烯酮5-位上连接的2-己烯酰基的碳的位置定义为从羰基开始6-位至11-位。将在环戊烯酮4-位上连接的2-己烯酰基的碳的位置定义为从羰基开始6’-位至11’-位。
(18)将1.2g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入1.7ml异丁酸酐(Nacalai Tesque)、427mg的DMAP和1.46ml三乙胺(NacalaiTesque)。在室温下，使混合物反应1小时并减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中并用10％枸橼酸和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤。减压浓缩该溶液。使用己烷∶乙酸乙酯=8∶1作为展开剂，经硅胶柱层析法将浓缩液分离，得到在硅胶薄层层析法中生成Rf=0.2的斑点的部分(使用己烷∶乙酸乙酯=6∶1作为展开剂)，。减压下经蒸发除去所述部分中的溶剂，得到470mg含有高纯度二异丁酰基环戊烯酮的油。
如同在参考实施例1-(3)中描述的那样，将由此得到的溶于重氯仿的二异丁酰基环戊烯酮经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ1.18(12H,m,7-H,8-H,10-H,11-H),2.61(2H,m,6-H,9-H),5.10(1H,d,J=3.0Hz,5-H),5.88(1H,m,4-H),6.39(1H,dd,J=1.5,6.0Hz,2-H),7.41(1H,dd,J=2.5,6.0Hz,3-H)。
假设重氯仿的剩余质子的化学位移值为7.24ppm，表达上述结果。
(19)将1.5g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入2.7g甲氧基乙酸(Nacalai Tesque)、794mg的DMAP和5.36g的DCC(Nacalai Tesque)。在室温下，使混合物反应2小时并减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中并用10％枸橼酸和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤。减压下浓缩该溶液。使用己烷∶乙酸乙酯=2∶3作为展开剂，经硅胶柱层析法将浓缩液分离，得到在硅胶薄层层析法(使用己烷∶乙酸乙酯=1∶1作为展开剂)生成Rf=0.34的斑点的部分。减压下经蒸发除去所述部分中的溶剂，得到300mg含有高纯度二甲氧基乙酰基环戊烯酮的油。
如同在参考实施例1-(3)中描述的那样，将由此得到的溶于重氯仿中的二甲氧基乙酰基环戊烯酮经核磁共振进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMRδ3.45(6H,s,7-H,9-H),4.13(4H,m,6-H,8-H),5 30(1H,d,J=3.0Hz,5-H),5.99(1H,m,4-H),6.44(1H,dd,J=1.5,6.5Hz,2-H),7.46(1H,dd,J=2.0,6.5Hz,3-H)。
假设重氯仿的残余质子的化学位移值为7.24ppm，表达上述结果。
(20)将1.1g环戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入3.4g甲基马来酸、610mg的DMAP和4.12g的DCC。在室温下，使混合物反应2小时并减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中并用10％枸橼酸和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤。减压下浓缩溶液。使用己烷∶乙酸乙酯=3∶2作为展开剂，经硅胶柱层析法将浓缩液分离，得到经硅胶薄层层析法(使用己烷∶乙酸乙酯=1∶1作为展开剂)生成Rf=0.6的斑点的部分和Rf=0.45的斑点的部分。
减压下经蒸发除去所述部分中的溶剂，自Rf=0.6部分得到300mg含有高纯度二甲基富马酰基环戊烯酮的固体，自Rf=0.45部分得到300mg含有高纯度二甲基马来酰环戊烯酮的油。
如同在参考实施例1-(3)中描述的那样，将溶于重氯仿的所述产物经核磁共振谱进行结构分析。结果显示如下。
1H-NMR二甲基富马酰基环戊烯酮δ3.80(6H,s,10-H,15-H),5.31(1H,d,J=3.0Hz,5-H),6.03(1H,m,4-H),6.48(1H,dd,J=1.0,6.0Hz,2-H),6.90(4H,m,7-H,8-H,12-H,13-H),7.50(1H,dd,J=2.0,6.0Hz,3-H)。二甲基马来酰基环戊烯酮δ3.76(6H,s,10-H,15-H),5.31(1H,d,J=3.0Hz,5-H),6.07(1H,m,4-H),6.31(4H,m,7-H,8-H,12-H,13-H),6.44(1H,dd,J=1.5,6.0Hz,2-H),7.58(1H,dd,J=2.0,6.0Hz,3-H)。
假设重氯仿的残余质子的化学位移值为7.24ppm，表达上述结果。
(21)在氩气流下，将44mg环戊烯酮和492mg苄基2,2,2-三氯乙酰亚胺酸酯(Aldrich,14,033-3)溶于2.5ml二氯甲烷(Wako PureChemicalIndustries,135-02441)中。伴随搅拌下，向其中缓慢加入1ml的28μl/ml三氟化硼乙醚复合物(Wako Pure Chemical Industries,022-08362)在二氯甲烷中的溶液。在室温下搅拌8小时后，减压下浓缩混合物。使用氯仿∶甲醇=19∶1作为展开剂，使浓缩液经硅胶薄层层析法，以纯化4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚和4,5-二苄基环戊烯酮醚。4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚和4,5-二苄基环戊烯酮醚的Rf值分别为0.3、0.45和0.8。4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚和4,5-二苄基环戊烯酮醚的收率分别为3.7％、3.7％和2.5％。
使用核磁共振仪JNM-EX270 FT NMR系统(Nippon Denshi)，经核磁共振(NMR)证实4-苄基环戊烯酮醚、5-苄基环戊烯酮醚和4,5-二苄基环戊烯酮醚的结构。假设四甲基硅烷的化学位移值为0ppm，表达1H-NMR中的化学位移值。结果显示如下。4-苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H,dd,J=6.0Hz,J=1.68),δ7.36(5H,m),δ6.3(1H,dd,J=6.0Hz,J=1.33Hz),δ4.88(1H,d,J=11.55),δ4.75(1H,d,J=11.55),δ4.55(1H,m),δ4.28(1H,m),δ2.78(1H,m)。5-苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.39(6H,m),δ6.22(1H,dd,J=6.24Hz,J=1.32Hz),δ5.09(1H,d,J=11.87),δ4.79(1H,m),δ4.77(1H,d,J=11.87),δ3.98(1H,d,J=2.97),δ2.06(1H,m)。4,5-二苄基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H,dd,J=6.27Hz,J=1 98),δ7.34(10H,m),δ6.29(1H,dd,J=6.10Hz,J=1.49Hz),δ4.88(1H,d,J=11.85),δ4.74(1H,d,J=11.85),δ4.71(2H,d,J=11.55),δ4.56(1H,m),δ4.33(1H,d,J=2.64)。
(22)在氩气流下，将44mg环戊烯酮和287mg叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酸酯(Aldrich,36,478-9)溶于2.5ml二氯甲烷中。伴随搅拌下，向其中缓慢加入1ml的28μl/ml三氟化硼乙醚复合物在二氯甲烷中的溶液。在室温下搅拌8小时后，减压下浓缩混合物。如同在参考实施例1-(21)中描述的那样，使浓缩液经硅胶薄层层析法，以纯化4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚和4,5-二叔丁基环戊烯酮醚。4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚和4,5-二叔丁基环戊烯酮醚的Rf值分别为0.35、0.27和0.73。4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚和4,5-二叔丁基环戊烯酮醚的收率分别为9.2％、1.9％和11％。
如同在参考实施例1-(21)中描述的那样，经NMR证实4-叔丁基环戊烯酮醚、5-叔丁基环戊烯酮醚和4,5-二叔丁基环戊烯酮醚的结构。结果显示如下。4-叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.34(1H,dd,J=5.94Hz,J=0.99),δ6.25(1H,dd,J=6.10,J=1.49),δ4.59(1H,m),δ4.08(1H,d,J=2.31),δ2.85(1H,m),δ1.33(9H,s)。5-叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.37(1H,dd,J=6.27Hz,J=1.98),δ6.23(1H,dd,J=6.27,J=1.32),δ4.75(1H,m),δ4.04(1H,d,J=2.63),δ2.23(1H,m),δ1.32(9H,s)。4,5-二叔丁基环戊烯酮醚1H-NMRδ7.35(1H,dd,J=6.27Hz,J=1.65),δ6.24(1H,dd,J=6.26,J=0.99),δ4.62(1H,ddd,J=3.3,J=1.65,J=0 99),δ4.16(1H,d,J=3.31),δ1.38(18H,s)。
(23)将100μl的1M环戊烯酮水溶液和500μl的200mM谷胱甘肽(还原的，Nacalai Tesque,170-10)水溶液(pH3.0)混合在一起。在60℃下，使混合物反应5小时。经0.5-μm Cosmonice滤膜过滤反应混合物并在以下条件下经HPLC分离。
柱TSKgel ODS-80Ts(5μm)2.0mm×25cm；流动相A∶0.1％TFA水溶液；B∶含有0.1％TFA/50％乙腈的水溶液；流速7.5ml/min；梯度流动相A(10分钟)→流动相A至A∶B=1∶1(55分钟)→A∶B=1∶1至流动相B(15分钟)；检测220nm下的吸收。
将200μl反应混合物经HPLC。收集保留时间为35.7分钟和36.1分钟的峰并减压下蒸发至干，得到5.5mg干燥固体。
分析该干燥固体的结构。分别使用用于NMR谱的JNM-A500、用于质谱(MS)的DX302分光计(Nippon Denshi)、用于紫外(UV)吸收光谱的UV-2500分光光度计(Shimadzu)和用于红外吸收(IR)光谱的FTIR-8000PC红外分光计(Shimadzu)进行测量。结果显示如下。
1H-NMRδ2.09(2H,m,5’-H),2.28(1H,dd,J=13.0,20.0Hz,5-H),2.44(2H,m,4’-H),2.78(1H,dd,J=8.5,14.0Hz,1’-H),2.85或2 89(1H,dd,J=3.0,6.0Hz,5-H),2.92或2.95(1H,dd,J=1.0,5.5Hz,1’-H),3.86(2H,S,9’-H),3.95(2H,m,4-H,6’-H),4.46(1H,m,2’-H),6.47或6.49(1H,d,J=3.0Hz,3-H)。
将样品溶于0.1N DCl在重水中的溶液中。假设HOD的化学位移值为4.65ppm，来表示结果。
13C-NMRδ26.3(5’-C),31.7(4’-C),31.9或32.1(1’-C),39.3(4-C),41.9(9’-C),42.2或42.3(5-C),53.3(6’-C),54.1(2’-C),133.5(3-C),1.54.4(2-C),大约173(3’-C,7’-C,8’-C,10’-C),205.8(1-C)。
将样品溶于0.1N DCl在重水中的溶液中。假设二噁烷的化学位移值为67.4ppm，表示结果。
在1H-NMR和13C-NMR中确定的峰的编号如在以下式[Ⅹ]中表明。
FAB-MSm/z 404(M+H)+,426(M+Na)+甘油用作基质。
UVλmax251nm(水)IRνKBrmaxcm-12949,1710,1660,1539,1404,1203按照漫反射方法进行测量。
这些结果揭示所述干燥固体为2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮。
(24)通过实施其中小鼠感染流感病毒的实验，检查环戊烯酮和2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮的治疗作用。
将每一只4周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内感染已在鸡蛋中繁殖的1×104FFU的人流感病毒Al/FM/1/47(ATCC VR-97)。
在病毒感染后，立即将1mg/kg的环戊烯酮或者3mg/kg或30mg/kg的2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮腹膜内给予用流感病毒感染的小鼠。
将磷酸盐缓冲液给予对照小鼠。
结果，对照组11只小鼠中的4只在第16天死亡。另一方面，对分别给予1mg/kg的环戊烯酮、3mg/kg和30mg/kg的2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮各组的死亡小鼠的数目分别为11只中有1只，11只中有1只和10只中有1只。因此，证实由于给予环戊烯酮或2-羟基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮的抗流感病毒活性。
实施例1(1)将参考实施例1-(9)中得到的13mg二己酰基环戊烯酮溶于300μl乙醇中。向其中加入700μl磷酸盐缓冲盐水(PBS,TakaraShuzo,T900)和13mg谷胱甘肽(还原的，Nacalai Tesque,170-50)。另外向其中加入150μl的1M Tris-HCl(pH7.5)以把pH调节至大约7。在室温下，使混合物反应30小时并使用乙酸乙酯∶乙酸∶水=13∶4∶4作为流动相经硅胶柱层析法，得到使用所述流动相作为展开剂经硅胶薄层层析生成Rf=0.2的斑点的部分。减压下蒸发除去溶剂，得到12mg反应产物。
(2)分析在实施例1-(1)中得到的反应产物的结构。分别使用用于核磁共振(NMR)谱的JNM-A5 00(Nippon Denshi)、用于质谱(MS)的DX302质谱仪(Nippon Denshi)、用于紫外(UV)吸收光谱的UV-2500分光光度计(Shimadzu)和用于红外吸收(IR)光谱的FTIR-8000PC红外分光计(Shimadzu)进行测量。
结果显示如下。
1H-NMRδ0.86(3H,t,J=7.0Hz,11-H),1.29(4H,m,10-H,9-H),1.57(2H,m,8-H),1.89(2H,m,6’-H),2.33(3H,m,5’-H,5-H),2.52(2H,m,7-H),2.72(1H,dd,J=10.0,13.0Hz,1’-H)或2.79(1H,dd,J=9.5,13.5Hz,1’-H),2.99(2H,m,1’-H,5-H),3.32(1H,m,7’-H),3.70(2H,m,11’-H),4.22(1H,m,4-H),4.48(1H,m,2’-H),7.46(1H,d,J=3.0Hz,3-H)或7.47(1H,d,J=2.5Hz,3-H),8.47(1H,m,3’-H),8.70(1H,m,10’-H)。
将样品溶于重二甲基亚砜中。假设重二甲基亚砜的残余质子的化学位移值为2.49ppm，表示结果。
13C-NMRδ13.7(11-C),21.7(9-C或10-C),23.9(8-C),26.8(6’-C),30.4(9-C或10-C),31.4(5-C),32.4(1’-C)或32.6(1’-C),32.9(7-C),38.0(4-C)或38.1(4-C),41.0(5-C)或41.19(5-C),41.23(11’-C),52.3(2’-C)或52.6(2’-C),53.1(7’-C),146.7(3-C),148.95(2-C)或149.00(2-C),169.9(6-C),170.4(8’-C),170.6(9’-C),171.0(12’-C),171.8(4’-C),198.3(1-C)或198.4(1-C)。
将样品溶于重二甲基亚砜中。假设重二甲基亚砜的化学位移值为39.5ppm，表示结果。
在1H-NMR和13C-NMR中确定的峰的编号如在以下式[Ⅺ]中表明。 FAB-MSm/z 502(M+H)+524(M+Na)+间硝基苄醇用作基质。
UVλmax227,273nm(MeOH)IRνKBrmaxcm-13359,2933,1768,1730,1647,1517,1236,1103按照漫反射方法进行测量。
这些结果揭示所述反应产物为式[Ⅷ]的2-己酰氧基-4-谷胱甘肽-S-基-2-环戊烯-1-酮(在下文中简单称作己酰基GM)，其为本发明的环戊烯酮硫代衍生物。所述环戊烯酮硫代衍生物为两个非对映体的混合物。从反应产物中可分离各自对映体。
在图1-5中，显示己酰基GM的分析结果。图1阐明己酰基GM的1H-NMR谱。横轴表示化学位移值(ppm)和纵轴表示信号强度。图2阐明己酰基GM的13C-NMR谱。横轴表示化学位移值(ppm)和纵轴表示信号强度。图3阐明己酰基GM的质谱。横轴表示m/z值和纵轴表示相对强度(％)。图4阐明己酰基GM的UV吸收谱。横轴表示波长(nm)和纵轴表示吸收度。图5阐明己酰基GM的IR吸收谱。横轴表示波数(cm-1)和纵轴表示透射率(％)。
实施例2(1)将参考实施例1-(22)中得到的185mg的4,5-二叔丁基环戊烯酮醚溶于3.6ml乙醇中。向其中加入3.6ml的PBS和252mg谷胱甘肽(还原的)。另外向其中加入1M Tris-HCl(pH7.5)以把pH调至大约7。然后在室温下使混合物反应1小时。
减压下将反应混合物蒸发至干并使用乙醇∶乙酸∶水=3∶1∶1作为流动相经硅胶柱层析法，得到使用乙醇∶乙酸∶水=3∶2∶2作为展开剂经硅胶薄层层析生成Rf=0.3的斑点的部分。在硅胶薄层层析法中，经苔黑酚-硫酸方法能够检测4,5-二叔丁基环戊烯酮醚并且经茚三酮方法能够检测谷胱甘肽(还原的)。因此，经这两种方法能够检测反应产物的Rf=0.3的斑点。减压下浓缩该部分。向其中加入己烷，以沉淀白色粉末。因此，得到240mg反应产物。
(2)使用JNM-500核磁共振仪(Nippon Denshi)和DX302质谱仪，测量在实施例2-(1)中得到的反应产物的1H-NMR谱和质谱。结果，揭示所述反应产物为式[Ⅸ]的2,3-二叔丁氧基-4-谷胱甘肽-S-基-1-环戊酮(在下文中简单称作二叔丁基GD)，其为非对映体混合物。
FAB-MSm/z 532(M-H)-554(M+Na-2H)-三乙醇胺用作基质。
图6阐明二叔丁基GD的质谱。在图6中，横轴表示m/z值和纵轴表示相对强度(％)。
图7阐明二叔丁基GD的1H-NMR谱。重二甲基亚砜用作溶剂。在图7中，横轴表示化学位移值(ppm)和纵轴表示信号强度。
实施例3(1)将在含有10％胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基(NipponSuisan Kaisha)(已于56℃处理30分钟)中的含有HL-60(ATCC CCL-240)细胞的100μl悬浮液以5×104细胞/ml浓度分散到96孔微滴定板的每个孔中。将每一种10μl的用水连续稀释2倍的8.3mM己酰基GM在25mM Tris-HCl缓冲液中的溶液的稀释液加入到该板的每孔中。在5％CO2存在下，于37℃下将该板孵育48小时。在光学显微镜下检查细胞后，向该孔中加入10μl的5mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT；Sigma)在磷酸盐缓冲盐水中的溶液。将该板孵育另外4小时。向孔中加入100μl含有0.04N HCl的2-丙醇，搅拌混合物，并测量在590nm下的吸光度。
结果，己酰基GM在6.25μM的最终浓度下对肿瘤细胞明显呈现抗增生活性。另外，在光学显微镜下观察到细胞凋亡体，显示诱导细胞凋亡的作用。
(2)将每一种10μl的用70％乙醇水溶液连续稀释2倍的19mM二叔丁基GD在70％乙醇水溶液中的溶液稀释液加入到96孔微滴定板的每个孔中并空气干燥。然后如同以上描述的那样，将100μl的HL-60悬浮液分散。使用利用MTT的测量系统，检查对肿瘤细胞的诱导细胞凋亡活性和抗增生活性。
结果，二叔丁基GD在最终浓度34μM下对肿瘤细胞明显呈现抗增生活性。另外，在光学显微镜下观察到细胞凋亡体，显示诱导细胞凋亡的作用。
(3)在37℃下，于含有10％胎牛血清(JRH)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker)(已在56℃下处理30分钟)中培养HL-60细胞，并以2.5×105细胞/5ml的浓度悬浮于RPMI 1640培养基中。
将每一种10μl的适当稀释的己酰基GM在20mM Tris-HCl缓冲液中的溶液或二叔丁基GD在70％乙醇水溶液中的溶液加入到5ml的所述悬浮液中。在5％CO2存在下，于37℃下将所述混合物孵育24小时。将10μl其已知为诱导细胞凋亡的试剂的放线菌素D(Sigma)水溶液(0.5mg/ml)用于替代样品并在用于证实的相同条件下孵育所述混合物。
在光学显微镜下检查培养的细胞。对加入样品和放线菌素D培养的细胞观察到核的浓缩、细胞的皱缩和诱导细胞凋亡体的形成。对加入10μl盐水或70％乙醇培养的对照细胞未观察到这样的现象。
另外，将如上描述的培养24小时的部分细胞用0.4％台盼蓝染色并在光学显微镜下检查。对未染色的活细胞数目和染为蓝色的死亡细胞计数。测定导致50％生存力(生存力50μM)的每一种样品的浓度。结果，己酰基GM的生存力50为9.22μM且二叔丁基GD的生存力50为46.3μM。
使用如在Saibo Kogaku,Bessatsu(Cell Technology，增刊)Jikken方案系列细胞凋亡Jikken方案(实验性方案系列用于细胞凋亡的实验方案)(Shujun-sha)第129-130页中描述的FACScan，实施细胞凋亡细胞的测量和如在Bio Manual UP系列Saishin细胞凋亡Jikken-ho(BioManual UP系列:用于细胞凋亡的现代实验方法)(Yodo-sha)第61-63页中所述分析DNA断裂。结果，对加入样品和放线菌素D培养的细胞观察到细胞凋亡细胞和DNA断裂。对加入10μl盐水或70％乙醇培养的对照细胞未观察到这样的现象。
实施例3(1)将2μl拓扑异构酶Ⅱ(TopoGEN；2单位/μl)、2μl的10倍浓缩缓冲液
、2μl的0.1％牛血清清蛋白(TakaraShuzo)、11μl蒸馏水和2μl蒸馏水(对照)或2μl的一种用水把己酰基GM调节为不同的浓度的溶液混合在一起。向其中加入1μl的0.25μg/μl pBR322 DNA(Takara Shuzo)。在37℃下，使生成的混合物反应。反应30分钟后，向其中加入2μl含有1％十二烷基硫酸钠、50％甘油和0.02％溴酚蓝的水溶液以终止反应。
将20μl所述反应混合物施加于使用琼脂糖L03(Takara Shuzo)和TAE缓冲液[40mM Tris、5mM乙酸钠、1mM乙二胺四乙酸二钠盐；使用乙酸调节至pH 7.8制备的1％琼脂糖凝胶中并在TAE缓冲液中电泳。在电泳后，将凝胶浸入1μg/μl溴化乙锭水溶液中。将凝胶暴露于紫外射线以目视观察DNA的电泳模式。对于加入水的对照而言，DNA的形式从超螺旋型完全变为松弛型，而如果拓扑异构酶Ⅱ活性受到抑制，则DNA的形式从超螺旋型至松弛型的变化部分或完全受到抑制。
结果，对于加入水的对照而言，DNA的形式从超螺旋型完全变为松弛型。另一方面，DNA的形式从超螺旋型至松弛型的变化部分或完全受到在100μM或更高的浓度下的己酰基GM的抑制，证实己酰基GM具有抑制拓扑异构酶Ⅱ的活性。
(2)除了将拓扑异构酶Ⅰ(TopoGEN；0.01单位/μl)用于替代拓扑异构酶Ⅱ以外，如同在实施例3-(1)中描述的那样，测定己酰基GM的抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性并且使用含有100mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM EDTA、1mM亚精胺和50％甘油的溶液作为10倍浓缩缓冲液。
结果，对于加入水的对照而言，DNA的形式从超螺旋型完全变化为松弛型。另一方面，DNA的形式从超螺旋型至松弛型的变化部分受到在1000μM或更高的浓度下的己酰基GM的抑制，证实己酰基GM具有抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性。
如上所述，与对拓扑异构酶Ⅰ的活性相比较，己酰基GM对拓扑异构酶Ⅱ呈现选择性抑制活性。只在正常细胞的分裂期中，暂时表达拓扑异构酶Ⅱ，而当细胞癌变时，该酶在整个细胞周期高度表达。在癌变中，拓扑异构酶Ⅰ的表达水平和活性增加。
实施例4注射制剂在0.1％的浓度下，将己酰基GM加入到盐水中(在日本药局方中描述)以制备注射制剂。
片剂制备每片含有100mg的二叔丁基GD和适宜量的结晶纤维素的片剂并包糖衣。
软膏剂己酰基GM 1g吸收软膏剂99g(在日本药局方中描述)首先用少量吸收软膏剂充分捏和己酰基GM。向其中缓慢加入剩余的吸收软膏剂。将该混合物捏和均匀以制备软膏剂。
将该软膏剂施用于患处，每天4至5次。
如上所述，本发明提供具有多种生理活性例如制癌活性、抗肿瘤细胞的抗增生活性和诱导细胞凋亡活性的特定的五元环化合物或其光学异构体或其盐。本发明也提供含有至少一种选自这些化合物中的化合物作为其活性成分的药用组合物。所述药用组合物用作治疗或预防对所述化合物敏感的疾病，尤其是用作制癌组合物的药用组合物。
此外，具有生理活性的适宜量的本发明化合物或其光学异构体或其盐能够包含在本发明的食物或饮料中。基于所述化合物的多种生理活性例如制癌活性和诱导细胞凋亡活性，本发明提供的食物或饮料用作具有在生物体内维持体内平衡的功能例如预防癌发生、制癌作用和诱导细胞凋亡活性的健康性食物或饮料。因此，本发明提供包含用于保持胃肠道健康的功能性物质的食物或饮料。
权利要求
1．式[Ⅰ]的五元环化合物或其光学异构体或其盐 其中在五元环上经虚线表示的键意指该五元环可为具有一个双键的环戊烯环或饱和的环戊烷环；如果五元环为环戊烯环，X为OR1，Y为=O和Z为H；如果五元环为环戊烷环，X为=O,Y为OR2和Z为OR3；R1为R4或-(CO)-R5；R2为H、R6或-(CO)-R7；且R3为H、R8或(CO)-R9(其中R4、R5、R6、R7、R8和R9可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，且R5、R7和R9可为H)，条件是R2和R3不同时为H；且W为从含有SH基团的化合物中除去SH基团的残基。
2．药用组合物，其包含作为活性成分的至少一种选自权利要求1的五元环化合物或其光学异构体和其盐的化合物。
3．权利要求2的药用组合物，其为制癌组合物。
4．权利要求2的药用组合物，其为诱导细胞凋亡的组合物。
5．制备式[Ⅰ]的五元环化合物或其光学异构体或其盐的方法 其中在五元环上经虚线表示的键意指该五元环可为具有一个双键的环戊烯环或饱和的环戊烷环；如果五元环为环戊烯环，X为OR1,Y为=O和Z为H；如果五元环为环戊烷环，X为=O,Y为OR2和Z为OR3；R1为R4或-(CO)-R5；R2为H、R6或-(CO)-R7；且R3为H、R8或(CO)-R9(其中R4、R5、R6、R7、R8和R9可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，且R5、R7和R9可为H)，条件是R2和R3不同时为H；且W为从含有SH基团的化合物中除去SH基团的残基，其特征在于所述方法包括使含有SH基团的化合物与选自式[Ⅱ]化合物或其光学异构体和其盐的化合物反应 其中R10为H、R12或-(CO)-R13；R11为H、R14或-(CO)-R15；(其中R12、R13、R14和R15可为彼此相同的或不同的，并为脂族基团、芳族基团或芳脂族基团，且R13和R15可为H)，条件是R10和R11不同时为H。
全文摘要
由通式(Ⅰ)表示的5－元环化合物、其旋光异构体或其盐。这些化合物具有包括制癌作用在内的生理活性。在所述式中,经5－元环中虚线显示的键表示该5－元环可为具有双键的环戊烯环或饱和的环戊烷环,并当所述5－元环为环戊烯环时,X为OR
文档编号C07K5/02GK1323315SQ99812261
公开日2001年11月21日 申请日期1999年8月10日 优先权日1998年8月19日
发明者小林英二, 大野木宏, 小山信人, 猪饲胜重, 佐川裕章, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社