专利名称：化合物及其用于治疗糖尿病并发症的用途的制作方法
按照35U.S.C.§202(c)，特此声明美国政府在本文所公开的发明中拥有一定权益，本发明得到国立卫生院基金部分支持(支助号DK44050、DK50317和DK50364)。
存在4种特别严重的糖尿病并发症，即糖尿病肾病、因为破坏视网膜致盲的糖尿病视网膜病变、涉及外周神经功能丧失的糖尿病神经病变和因为毛细血管损伤引起的循环障碍。视网膜病变和肾病均被认为是与该病病情有关的全身性循环障碍的组成部分。最近综述了微血管紊乱在晚期糖尿病中的作用(Tooke，Diatetes，44721(1995))。在本发明整个公开内容中，术语“糖尿病相关性病症(diabetes-associatedpathologic conditions)”和同义术语意指包括各种周知的视网膜病变、神经病变、肾病、大血管病变以及其它糖尿病并发症。
关于糖尿病引起的病理和衰老引起的病理的相似性已有非常广泛的报道。研究表明，许多糖尿病相关性病症在临床上非常类似于衰老通常引起的病理变化。例如已经证实糖尿病患者动脉和关节过早僵硬、肺弹性和肺活量过早降低。此外，与年龄相当的非糖尿病个体相比，糖尿病患者发生动脉粥样硬化、心肌梗塞和中风的频率更高。糖尿病也更容易感染，而且与非糖尿病个体相比，在更年轻的年龄就可能发生高血压、骨丢失加速、骨关节炎和T细胞功能损伤。
糖尿病相关性病症和衰老的相似性似乎提示，它们存在共同机理(mechanistic rationale)。作为糖尿病相关性病症和衰老的共同生化基础，已经提出了各种机制。人类受试对象资料最强有力支持的假说以非酶性糖基化机制为前提。该假说提出，衰老过程和糖尿病相关性病症如上述病症至少部分是因为葡萄糖和葡萄糖衍生的代谢物通过Maillard反应进行的蛋白质修饰和交联引起的(Monnier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81583(1984)和Lee等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，123888(1984))。因为这样的糖基化反应产生的修饰蛋白本文称为高级糖化终末产物-修饰蛋白(AGE-蛋白)。广为人知的是，3-脱氧葡糖醛酮(3DG)是形成AGE-蛋白的多步骤反应顺序中的重要中间体。3DG是可与蛋白反应的葡萄糖衍生的代谢物，导致细胞内和细胞外蛋白(例如胶原蛋白和基底膜)的交联。
糖尿病并发症时，人们认为与该疾病相关的慢性高血糖动态加速产生AGE-蛋白的反应。支持该机制的证据包括的资料显示，糖尿病受试对象的长寿命蛋白(long-lived protein)如胶原蛋白和晶状体的AGE-蛋白含量明显高于相当年龄的正常对照。因此，晶状体的修饰和交联速率加快可解释糖尿病患者为什么在较年轻的年龄的白内障发病率高。同样，重要的结构蛋白即胶原蛋白的修饰和交联速率加快可解释为什么会在糖尿病患者观察到早期发生关节和动脉硬化以及肺容量降低。因为这些蛋白是长期存在的，所以其修饰效果往往是累积性的。
证实糖尿病并发症和高血糖的因果关系的另一个因素是高血糖记忆。该现象的一个特别典型的实例是初期糖尿病经治疗恢复正常血糖水平的狗发生严重肾病。虽然所述狗的眼睛在治疗时的组织学是正常的，但是尽管血糖浓度已经正常，随着时间的推移这些狗仍然发生糖尿病性肾病(Engerman等，Diabetes，36808(1987))。因此，在高血糖早期发生不可逆性潜在眼损害，之后临床症状才明显。
已经证实糖尿病病人和动物的早期和晚期糖修饰的AGE-蛋白的浓度较正常高。实际上，AGE-蛋白的增加高于血糖水平的增加。荧光测定可估测AGE-蛋白浓度，因为一定比例的糖分子重排产生蛋白结合的荧光分子。
AGE-蛋白的病理作用不限于糖尿病。蛋白糖化涉及早老性痴呆(Harrington等，Nature，370247(1994))。蛋白荧光增加还可见于衰老。实际上，某些理论将衰老过程归因于氧化损害和糖引起的蛋白修饰的联合作用。因此，减少AGE-蛋白形成的疗法也可用于治疗其它病因相似的人类疾病状态，而且可能延缓衰老过程。
普遍认为，AGE-蛋白形成始于蛋白质的氨基与糖(主要是葡萄糖)反应。一种典型的文献引用描述是“赖氨酸残基的ε氨基糖化形成最初的加合物为Amadori化合物，果糖赖氨酸…糖化是复杂的系列反应中的初始步骤，所述反应总称为Maillard或褐色反应，它最终导致形成交联、沉淀、氧化、褐色的荧光蛋白”。K.J.Knecht等，Archivesof Biochem.Biophys.，294130(1992)。
由糖形成AGE-蛋白是一个多步骤过程，包括与糖的早期、可逆性反应产生含果糖-赖氨酸的蛋白。然后这些修饰的蛋白继续反应产生不可逆的修饰AGE-蛋白。显然AGE-蛋白与含糖化赖氨酸残基的蛋白不同，因为针对AGE-蛋白的抗体不与果糖-赖氨酸反应。此外显而易见的是，AGE-蛋白以多种化学形式存在；然而几乎没有鉴定的AGE-蛋白。在最近的研究中，将化学类型(ε-氨基-(羧甲基)赖氨酸鉴定为一种重要的最终的AGE-蛋白结构(Reddy等，Biochem.，3410872(1995)和Ikeda等，Biochemistry，-358075(1996))。该研究不能化学鉴定另一种AGE-蛋白表位，它构成约50％修饰部位。新近开发了一种研究由核糖形成AGE-蛋白的动力学的方法(Khalifah等，Biochemistry，354645(1996))。然而，该研究提出核糖可能在AGE-蛋白形成中起重要的生理作用，支持以下提出的糖化-赖氨酸和果糖-赖氨酸的较广义的定义。
其它参考文献指出了含糖化赖氨酸残基的蛋白和AGE蛋白的不同，“在数小时和数周后分别达到Schiff碱和Amadori产物的平衡水平。早期糖基化产物的可逆平衡特性是重要的，因为它意味着即使对非常长寿命蛋白而言，这种产物的总量也在较短的时间内达到稳态平台.....因为这些早期糖基化产物不能几年内继续累积于慢性糖尿病患者的胶原蛋白和其它稳定组织蛋白上，所以其浓度与糖尿病性肾病的存在或严重程度不相关是不令人惊奇的...然而胶原蛋白和其它血管壁长寿命蛋白上的某些早期糖基化产物不会解离。相反，它们经过一个缓慢复杂系列的化学重排形成不可逆的高级糖基化终末产物”。M.Brownlee等，New England Journal of Medicine，3181315(1988)。科学文献描述的产生这些修饰蛋白的唯一途径包括蛋白和糖分子的初始反应。
许多参考文献指出，通过多步骤途径形成AGE-蛋白而且3-脱葡糖醛酮(3DG)是该途径的重要中间体。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)；M.Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)；T.Niwa等，Nephron，69438(1995)；W.L.Dills，Jr.，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993)；H.Yamadat等，J.Biol.Chem.，26920275(1994)；N.Igaki等，Clin.Chem.，36631(1990)。
图1说明了普通接受的由糖和蛋白反应形成3GD的途径。由图1可见，糖(葡萄糖)分子开始与蛋白质-赖氨酸氨基(I)形成Schiff碱。产生的Schiff碱然后重排产生果糖-赖氨酸修饰蛋白(II)。产生(II)的反应是自由可逆的。(II)可重排产生3DG和游离的蛋白赖氨酸。随后的3DG和蛋白反应是AGE-蛋白形成中第一个不可逆步骤。
迄今已知，从没有关于其它途径可产生3DG的报道，或者实际上从没有报道酶催化代谢途径是3-DG的主要来源，而不是图1所示的非催化反应。
糖尿病患者的血清3DG显著高于非糖尿病患者(12.78±2.49μM与1.94±0.17μM)。(Toshimitsu Niwa等，Nephron，69438(1995))。尽管如此，此毒性化合物还是见于正常健康个体。所以，机体对该分子产生去毒途径是不令人惊奇的。醛还原酶催化这些反应中的一个反应，该酶通过将30G还原为3-脱氧果糖(3DF)使3DG脱毒，3DF可有效分泌到尿中(Takahashi等，Biochem，341433(1995))。另一个脱毒反应是通过酮醛(oxoaldehyde)脱氢酶将3DG氧化为3-脱氧-2-酮基葡萄糖酸(DGA)(Fujii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，210852(1995))。
迄今的研究结果表明，糖尿病时负面影响至少其中一种酶醛还原酶的效率。当从正常大鼠肝脏分离时，在赖氨酸67、84和140上部分糖化该酶的一部分，与正常非修饰酶相比，该酶的催化效率低(Takahaski等，Biochem.，341433(1995))。因为糖尿病患者的糖化蛋白的比率较血糖量正常个体高，所以糖尿病患者的3DG水平可能高，而通过将3DG还原为3DF去除该活性分子毒性的能力可能降低。
已经研究了醛还原酶的机制。这些研究证实，醛糖还原酶抑制剂(ARI)抑制此重要的脱毒酶(Barski等，Biochem.，3411264(1995))。目前正在对ARI用于降低糖尿病并发症的潜力进行临床研究。已经证实归为一类的这些化合物对短期糖尿病并发症具有一定效果。然而，它们对长期糖尿病并发症缺乏临床效果，而且使喂饲高蛋白饲料的大鼠的肾功能恶化。从以下可看出，此发现与作为本发明基础的新发现的赖氨酸回收代谢途径一致。高蛋白膳食将增加果糖-赖氨酸消耗，果糖-赖氨酸通过肾脏赖氨酸回收途径转化为3DG。ARI治疗抑制所产生的3DG通过还原为3DF脱毒，与未接受ARI的大鼠相比，结果导致肾脏损害加重。这是因为ARI对醛糖还原酶的抑制作用降低了还原3DG和3DF的醛糖还原酶的有效性。
由以下概述的专利综述可知，以前研究了3-DG在人类疾病中的作用。
Ulrich等的美国专利5,476,849描述了用氨基-苯甲酸和衍生物抑制形成AGE-蛋白的方法。推测这些化合物作用是与3-DG反应并在其可与蛋白反应以启动形成AGE-蛋白的不可逆步骤之前将其由系统中去除。
Cerami等的美国专利4,798,583和5,128,360描述了应用氨基胍防止形成AGE-蛋白和糖尿病引起的动脉壁蛋白交联。证实氨基胍与早期糖基化产物反应。本文定义的此早期产物是3DG。这些专利并没有设想抑制形成3-DG的可能性。他们仅仅专注于络合此毒性分子。
France等的美国专利5,468,777描述了防止由非酶性褐色化蛋白在口腔引起的牙齿着色的方法和药物。该申请认为半胱氨酸和半胱氨酸衍生物特别有用。
Ulrich等的美国专利5,358,960描述了用氨基取代的咪唑抑制AGE-蛋白形成的方法。证实了这些化合物与早期糖基化产物(3DG)反应。在该专利中未述及可能存在的3DG代谢来源。该专利设想3DG只作为非酶性褐色化蛋白中的中间体产生。
Ulrich等的美国专利5,334,617描述了用作AGE-蛋白形成抑制剂的氨基酸。认为赖氨酸和其它双功能氨基酸在该方面特别有用。认为这些氨基酸与来自葡萄糖和蛋白反应的早期糖基化产物反应。似乎在该专利中描述的早期糖基化产物是3DG。
Ulrich等的美国专利5,318,982描述了用1，2，4-三唑作抑制剂对AGE-蛋白形成的抑制作用。该专利描述的抑制剂包括二氨基-取代物，该取代物能够与3DG反应并络合。此专利描述这些化合物与早期糖基化产物(本文定义为3DG)反应。
Ulrich等的美国专利5,272,165描述了2-亚烷基-氨基胍作为AGE-蛋白形成的抑制剂的用途。认为该专利描述的抑制剂与3DG是高度反应性的。该专利未提及抑制3DG的代谢形成。
Ulrich等的美国专利5,262,152描述应用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白形成。该专利描述的化合物是α-效应胺类。W.P.Jencks，第三版，McGraw Hill，New York。已知此类化合物与二羰基化合物例如3DG反应。
Ulrich等的美国专利5,258,381描述应用2-取代-2-咪唑啉抑制AGE-蛋白形成。该专利描述的化合物含有邻近的氨基，它们能够容易地与3DG反应。
Ulrich等的美国专利5,243,071描述了应用2-亚烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白形成。该专利描述的化合物与3DG具有高度反应性，而且其作用是络合该活性毒性分子。
Ulrich等的美国专利5,221,683描述了应用二氨基吡啶化合物抑制AGE-蛋白形成。认为特别有用的所述二氨基吡啶化合物与3DG反应形成含有稳定的6元环的复合物。
Ulrich等的美国专利5,130,337描述了应用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白形成。该专利描述的抑制剂是α-效应胺类，本领域已知它们将与3DG快速反应并形成稳定复合物。
Ulrich等的美国专利5,130,324描述了应用2-亚烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白形成。该专利描述的化合物的作用是与早期糖基化产物(3DG)反应，所述早期糖基化产物由葡萄糖与蛋白质反应产生。
Ulrich等的美国专利5,114,943描述了应用氨基-取代的嘧啶抑制AGE-蛋白形成。认为该专利描述的化合物与3DG快速反应而且使其脱毒。
没有一个上述专利提出将对代谢性形成3DG的抑制作用用作防止糖尿病并发症的治疗性干预的手段。实际上，甚至这些专利中没有一个专利提示，3DG的产生涉及酶性途径。
Ulrich等的美国专利5,108,930描述了检测生物样品氨基胍水平的方法。认为该测定在通过测量氨基胍的消除时间确定肾功能中具有潜在性效用。用于该专利描述的测定方法的主要效用是测量氨基胍的组织水平，以便在动物和人类研究中能够维持足以抑制AGE-蛋白形成的剂量。该专利未提及使用尿的3DG、3DF或DGA比率确定糖尿病患者发生并发症的风险。
Szwergold等的美国专利5,231,031描述了评估糖尿病相关性病症的风险和确定对这些并发症的治疗功效的方法。该专利描述了测量糖尿病患者红细胞中的两种磷酸化化合物。该专利没有化学鉴定这两种化合物。然而，两种化合物均不是3DG或3DF，在本发明的诊断实施方案中测定其在尿中的水平。
通过测量糖基化终末产物监测糖尿病患者的代谢控制的方法是已知的。已知糖基化血红蛋白浓度反映了前几周的平均血糖浓度。颁发给A.Cerami等的美国专利4,371,374描述了通过定量尿中的糖基化蛋白降解产物监测血糖水平的方法，更具体地说所述糖基化蛋白的降解产物为非酶性糖基化氨基酸和肽。该方法意味着利用碱性硼酸亲和力以与见于糖基化终末产物的共平面顺式-二醇基团形成特异性复合物，从而分离并定量这类终末产物。
颁发给A.Cerami的美国专利4,761,368描述了分离和纯化存在于褐色多肽例如牛血清白蛋白和聚-L-赖氨酸的发色团。发色团2-(2-呋喃甲酰基)-4(5)-2(呋喃甲酰基)-1H-咪唑(FFI)是2分子葡萄糖与2个赖氨酸来源的氨基缩合衍生的共轭杂环。该专利进一步描述将FFI用于检测蛋白样品的“老化”(高级糖基化的程度)的方法中，其中通过测量所述样品中的上述发色团的量，然后比较该测量结果与标准品(其FFI含量与所述样品的“年龄”有关的蛋白样品)，从而确定所述样品“年龄”。
糖尿病患者的现有治疗方案中没有实现的长期存在的需要是用于以下目的的有效方法鉴定具有发生糖尿病相关性病症风险的糖尿病患者；通过治疗性干预预防、降低或延迟这类病症的发生以及确定这样的治疗性干预的利益。
发现此发现在本发明中具有实用性，一方面，本发明提供一类化合物，这类化合物具有酶抑制活性而且有效抑制果糖-赖氨酸酶性转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸。通过测定容易确定本发明化合物的有关的酶抑制活性。所述测定方法包括提供果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶来源和本发明化合物的水溶液，其中本发明化合物的量足以证实其抑制活性；使所获得的溶液接受促进作为上述激酶、果糖-赖氨酸和三磷酸腺苷相互作用的产物的果糖-赖氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷形成的条件；以及检测至少一种这样的产物的产量，与相同量的果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷和果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶来源而未加入本发明化合物的水溶液相比，本发明化合物降低了这类产物的量。刚才描述的测定方法也属于本发明的范畴。
按照另一方面，本发明提供用于预防、降低或延迟糖尿病患者发生糖尿病并发症的药用制剂，该制剂包括作为活性成分的上述本发明化合物和药学上可接受的载体。
按照本发明的再一方面，提供预防、降低或延迟具有糖尿病并发症发生风险的糖尿病患者发生糖尿病并发症的方法，该方法包括给予所述患者抑制果糖-赖氨酸酶性转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸的有效量本发明化合物。该方法可用于预防或治疗其它病因相似的疾病状态，详见下文。
按照本发明的又一方面，本发明提供评价糖尿病患者发生糖尿病相关性病症的风险的方法。该方法包括给予所述患者产生预定量糖化赖氨酸残基的量的糖化赖氨酸残基来源；以正常受试对象(即非糖尿病受试对象或没有糖尿病临床症状的受试对象)的3-脱氧葡糖醛酮与3-脱氧果糖的比率为基准，测定获自所述患者的生物样品中的3-脱氧葡糖醛酮与3-脱氧果糖的比率。与无症状受试对象相比，糖尿病患者样品中的3-脱氧葡糖醛酮与3-脱氧果糖的比率高，说明糖尿病患者发生糖尿病相关性病症的风险较高。
本发明还提供评价治疗性干预在防止糖尿病并发症中的效用的方法。该方法包括检测在开始治疗性干预之前和之后获自糖尿病患者的生物样品中的3-脱氧葡糖醛酮、3-脱氧果糖和果糖-赖氨酸的浓度。然后比较所述样品中的3-脱氧葡糖醛酮和3-脱氧果糖浓度和与果糖-赖氨酸的浓度。与在开始治疗性干预之前采集的生物样品中检测的相对于果糖-赖氨酸浓度的3-脱氧葡糖醛酮和3-脱氧果糖浓度和相比，开始治疗性干预之后采集的生物样品中的该浓度和降低，说明治疗性干预有效。
本发明再一方面，提供告知糖尿病患者可能导致发生糖尿病相关性病症的食品的方法。该方法包括检测食品中的糖化赖氨酸残基的含量，将该信息例如在食品包装上或在糖尿病患者使用的公开出版物上告知糖尿病患者。
按照本发明，发现生物样品例如尿液中的3DF水平升高与发生糖尿病并发症风险显著相关。因此，本发明的另一实施方案提供评价糖尿病患者发生糖尿病相关性病症的风险的方法，该方法基于参照一个或多个3DF预定基线水平，将存在于糖尿病患者生物样品中的3DF的测量结果作为所述患者是否发生糖尿病并发症的可能性的指标。
本发明的另一方面包括降低患者对与摄食糖化蛋白有关的癌症的敏感性的方法。该方法包括给予药用组合物，该组合物含有对果糖-赖氨酸酶性转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸具有抑制活性的活性化合物。本发明还包括预防、降低或延迟发生AGE-蛋白形成引起的癌症的方法。该方法包括给予治疗量的抑制产生3-脱氧葡糖醛酮的药物。
作为进一步评价与给予含糖化蛋白膳食有关的恶性转化的分子机制的手段，提供在易感受试动物诱导癌症的方法，该方法包括用糖化蛋白膳食喂饲所述动物足够时间，使得生物体液中的3-脱氧葡糖醛酮水平升高至少3倍。相对于非处理对照动物评价这类动物。
按照本发明还提供筛选影响癌症发生的物质的方法。通过喂饲受试动物糖化蛋白膳食使得生物体液3DG水平升高至少3倍，从而诱发癌症。然后将动物分为两组，其中一组动物接受待评价化合物，而另一组动物用作阴性对照。合适时间后处死两组动物，评价两组动物存在和/或没有的癌瘤。
最后，在本发明的另一个实施方案中，提供筛选预防、降低或延迟发生癌症的物质的方法。该方法包括以下步骤用糖化蛋白饲料喂饲易感受试动物，喂饲所述饲料的量和时间足以维持生物体液的3-脱氧葡糖醛酮(3DG)含量不同于喂饲基本上不含糖化蛋白饲料的相似易感受试动物的3DG含量。然后将受试物质给予一部分所述受试动物，而另一部分动物不给予受试物质。再后处死动物，比较每个所述部分的易感受试动物的组织切片，评价所述受试物质的作用。
图2图示赖氨酸回收途径包括的反应。
图3为尿液分布形式的示意图，图示摄食2gFL以及连续监测24小时的一个个体的随时间变化的3DF、3DG和FL。
图4为摄食2g果糖赖氨酸的7个志愿者尿液分泌3DF随时间变化的示意图。
图5为对照组动物和保持摄食含0.3％糖化蛋白膳食的实验组的3DF和N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶(NAG)的比较图。
图6图示摄食对照饲料或富含糖化蛋白饲料的大鼠尿液3DF和3DG水平之间的线性关系。
图7A和7B图示正常个体和糖尿病患者尿液的禁食水平3DG对禁食水平3DF的作图。
发明详述提供以下定义帮助理解本发明，详述如下1.糖化赖氨酸残基-本文使用的表述“糖化赖氨酸残基”是指还原糖和含赖氨酸蛋白反应产生的修饰赖氨酸残基的稳定加合物。
大部分的蛋白赖氨酸残基作为预期的正电荷氨基酸位于蛋白表面。因此，与血清或其它生物体液接触的蛋白上的赖氨酸残基可与溶液中的糖分子自由反应。该反应存在多个阶段。初始阶段包括赖氨酸游离氨基与糖的酮基形成Schiff碱。然后此初产物经过Amadori重排产生稳定的酮胺化合物。
可用多种糖发生该系列反应。当涉及的糖为葡萄糖时，最初的Scchiff碱产物将参与在葡萄糖的C-1上的醛部分与赖氨酸ε-氨基之间的亚胺形成。Amadori重排形成与果糖C-1碳连接的赖氨酸、1-脱氧-1-(ε-氨基赖氨酸)-果糖(本文称为果糖-赖氨酸或FL)。
可用其它醛糖例如半乳糖和核糖进行相似的反应(Dills，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993))。对于本发明的目的，不管修饰糖分子的准确结构如何，糖化赖氨酸残基的涵义包括任何还原糖和蛋白质赖氨酸的ε-氨基残基反应的早期产物。
此外，术语糖化赖氨酸残基、糖化蛋白和糖基化蛋白或糖基化赖氨酸残基在本文中可交互使用，这与通常交互使用这样的表述的科学杂志中的现时用法一致。
2.果糖-赖氨酸-术语“果糖-赖氨酸”(FL)本文用来指任何糖化赖氨酸，无论是掺入蛋白/肽的糖化赖氨酸还是通过蛋白水解消化从蛋白/肽释放的糖化赖氨酸。该术语不特别限于通常称为果糖-赖氨酸的化学结构，据报道蛋白赖氨酸残基和葡萄糖反应形成果糖-赖氨酸。如上所述，赖氨酸氨基可与各种各样的糖反应。实际上，一个报道指出，在一组16种(16)不同测试糖中葡萄糖是活性最低的糖(Bunn等，Science，213222(1981))。因此，与葡萄糖类似，无论在本说明书何处提及术语果糖-赖氨酸，均包括半乳糖和赖氨酸形成的塔格糖-赖氨酸，同样包括所有其它糖的缩合产物，无论所述糖是天然糖还是合成糖。从本说明书可知，蛋白-赖氨酸残基和糖的反应包括多个反应步骤。该反应系列的最后步骤包括蛋白交联并产生称为AGE-蛋白的多聚类物质，其中某些物质为荧光物质。蛋白水解消化这类修饰蛋白不会产生与糖分子共价结合的赖氨酸。因此，当“果糖-赖氨酸”的本文中使用时，该术语的涵义不包括这些类型的物质。
3.果糖-赖氨酸-3-磷酸-通过从ATP酶性转移高能磷酸基至FL形成该化合物。本文使用的术语果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)意指包括所有能够酶性形成的磷酸化果糖-赖氨酸部分，无论是游离的还是蛋白结合的。
4.果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶-该术语是指，如上定义，当另外提供高能磷酸来源时能够使FL酶性转化为FL3P的一种或多种蛋白。
5.3-脱氧葡糖醛酮-3-脱氧葡糖醛酮(3DG)是1，2-二羰基-3-脱氧糖(也称为3-脱氧己糖醛酮)，当裂解FL3P产生游离赖氨酸和无机磷酸时形成3-脱氧葡糖醛酮。对于本发明目的，术语3-脱氧葡糖醛酮包括裂解FL3P时形成的所有可能的二羰基糖，FL3P如上所述具有广泛的定义。
6.FL3P赖氨酸回收途径-赖氨酸回收途径存在于人体肾脏，也可能存在于其它组织，它再生为游离氨基酸的未修饰赖氨酸或再生掺入多肽链的未修饰赖氨酸。进一步的解释见下文，该途径是引起糖尿病并发症的一个重要因素。
7.AGE-蛋白-在科学杂志和本文使用的术语“AGE-蛋白”(高级糖化终末产物修饰蛋白)是指糖和蛋白反应的终末产物(Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)和Niwa等，Nephron，69438(1995))。显然，例如蛋白赖氨酸残基和葡萄糖反应不会随着果糖-赖氨酸的形成而停止。FL可以经受多个脱水和重排反应产生非酶性3DG，3DG再与游离氨基反应，导致有关蛋白的交联和褐色化。实际上，适当的证据表明，以上定义的3DG是该修饰反应中的中心中间体。
9.“糖化膳食”-本文使用的该表述是指其中糖化蛋白代替部分正常蛋白的任何特定膳食。表述“糖化膳食”和“糖化蛋白膳食”在本文中可交互使用。
至少部分、也可能所有糖尿病并发症是因为葡萄糖和其它活性糖共价修饰蛋白所致。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)。如上所述，已经证实糖尿病病人和动物的糖修饰蛋白浓度较正常个体高。事实上，糖尿病相关性AGE-蛋白的增加高于血糖水平的增加。
以前，人们普遍认为体内3DG来源于含糖化赖氨酸残基的蛋白分解。还普遍认为这些糖化赖氨酸不能用作氨基酸来源。由下文可知，以前相信的这种观点是错误的。
10.“易感受试动物”-本文使用的该表述是指因为存在某些遗传突变其恶性转化和形成肿瘤的倾向性较高的实验动物品系。在本文所述的研究中使用结节性硬化基因(Tsc-2)突变的Eker大鼠。本领域一般技术人员知道形成肿瘤的倾向性高的其它实验大鼠或小鼠品系。术语“相似的易感受试动物”是指用作对照非处理动物的遗传背景相似的动物。
如上所述，本发明产生于对以前未知代谢途径的发现，该途径以酶催化反应产生3DG。可以酶性抑制该酶性途径，因此减少毒性3DG的产生。
在对糖尿病肾脏的一系列研究过程中，链脲霉素(streptozotoxin)诱发的糖尿病大鼠肾脏的高氯酸提取物的31P NMR光谱检测显示一个异常的NMR光谱新的峰。本发明者的以前的研究证实，在大鼠晶状体和人红细胞中存在果糖-3-磷酸(A.Petersen等，Biochem.J.，284363-366(1992)；Lal等，Arch.Biochem.Biophys.，318191(1995)；Szwergold等，Science，247451(1990)和Lal等，InvestigativeOpthalmology and Visual Science，36(5)969(1995))。早期的研究在大鼠晶状体中鉴定了其它非寻常磷酸化糖(Szwergold等，Diabetes，44810(1995)和Kappler等，Metabolism，44，1527(1995))。因此，有充分理由认为，该新鉴定的峰是另一种磷酸化糖。进一步深入的实验研究表明，这种新化合物不是一种单纯的糖，而是在果糖组分的3位磷酸化的果糖-赖氨酸。
用两种方法证实了该鉴定。用以下实施例2公开的方法合成真正的果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)，显示在31P NMR光谱中与糖尿病大鼠肾脏峰共振。还将合成果糖-赖氨酸注射入非糖尿病大鼠。注射后这些大鼠肾脏的FL3P水平显著升高。
进行了2个实验以证实FL3P以酶催化反应直接衍生自FL。合成以氘在果糖部分的C3位标记的果糖-赖氨酸，并将其注射入大鼠。注射后3小时，从这些大鼠取出肾脏，用高氯酸进行提取。NMR光谱学显示，分离自这些大鼠的FL3P物质在果糖部分C3位含有氘标记。此外，大鼠肾脏组织匀浆显示在同时需要ATP和果糖-赖氨酸的反应中可产生FL3P。最后提及的实验证实存在特异性FL3P激酶，因为在生理条件下只将果糖赖氨酸和ATP一起温育时不形成FL3P。涉及肾脏皮质部分的进一步实验证实，该激酶活性不是均匀分布于肾脏，而是集中在肾小管近侧区，该区是最早证实人类和动物糖尿病肾脏损害的解剖部位之一。
FL3P水溶液是不稳定的。它快速降解形成3DG、赖氨酸和无机磷酸盐。体内也发生这种反应。目前仍然不知道FL3P体内降解是自然发生的反应还是酶催化反应。然而，非常怀疑酶催化参与降解，因为在完好肾脏非常快速由果糖-赖氨酸产生3DG。
图2图示FL3P赖氨酸回收途径反应步骤。在第一步中，果糖-赖氨酸和ATP在FL3P激酶催化的反应中反应形成果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)和ADP。果糖部分的3-位磷酸化使果糖赖氨酸分子不稳定。然后获得的F3LP分解形成3-脱氧葡糖醛酮(3DG)、无机磷酸盐和未修饰游离的可再利用的赖氨酸，赖氨酸可用于蛋白质合成。醛还原酶使3DG还原为3-脱氧果糖(3DF)，从而使3DG脱毒，3DF分泌到尿液中。
尽管图2图示用最普遍的糖化赖氨酸即果糖-赖氨酸的此途径，但是对于本领域技术人员非常显而易见的是，各种各样的相似分子可以经该途径反应。实际上，见下文详细解释，FL3P赖氨酸回收途径的底物选择是非常广泛的，保证以上给定术语的广泛定义。
其它实验表明，赖氨酸回收途径见于各种动物，包括绵羊、猪、狗、兔、母牛、小鼠和鸡。该途径也存在于人类。已知赖氨酸是一种必需氨基酸，其在大多数食物的浓度较低，所以可以认为FL3P赖氨酸回收途径是遍在存在的。此外，食物中相当比例的赖氨酸残基是以糖化形式存在的，烹制食物时将增加这种修饰赖氨酸的比例。因为这些糖化赖氨酸残基不能用于合成蛋白质，所以赖氨酸回收途径具有极大的实用价值，并为存在该途径的生物体提供选择优势。
糖尿病对赖氨酸回收途径具有2个作用。分离自糖尿病患者的血液蛋白的糖化赖氨酸浓度比非糖尿病个体高。所以与非糖尿病个体相比，必须使糖尿病患者的更多赖氨酸进入赖氨酸回收途径。此外，根据对糖尿病患者和正常个体尿液中的3DG与3DF比率的初步观测结果可以看出，糖尿病患者通过该途径使3DG脱毒的能力降低。这两个因素一起使糖尿病患者尿液3DG浓度增高(见图7；此外参见Lal等，Arch.Biochem.and Biophys.，342(1)254-60(1997))。
除了肾脏之外，在其它组织，尤其是红细胞、晶状体和外周神经组织中，也已经鉴定出了参与赖氨酸回收途径的因子。糖尿病并发症累及所有这些组织。红细胞定位与糖尿病微血管并发症例如糖尿病性视网膜病有关，肾脏定位与糖尿病性肾病有关，而外周神经定位与糖尿病外周神经病有关。这些因子还见于胰腺。正在进行实验以确定这些因子在皮肤中的存在情况。如果发现这些因子存在于皮肤，则认为可用本发明抑制性化合物的合适载体局部治疗，防止胶原蛋白交联，并由此改善皮肤弹性，从而缓解其有害效应。
已进行的实验往往证明，人类由经口摄食含糖化赖氨酸残基的蛋白既产生3DG又产生3DF。以下详细描述的这些实验令人信服地证实，人类存在赖氨酸回收途径。这些实验还阐明了一个令人困惑的现象，即某些糖尿病患者产生糖尿病并发症，而另一部分糖尿病患者即使血糖控制很不好，也不会发生这样的并发症。根据本文提供的资料可知道该现象的原因。糖尿病患者的3DG解毒能力各不相同。部分糖尿病人群的醛还原酶活性似乎比大多数糖尿病人群的高。因此，这些个体能够通过有效地使高于正常水平的3DG脱毒，从而增加进入赖氨酸回收途径的量。其它功能受损的患者不大能够使其升高的3DG水平脱毒，因此发生糖尿病并发症的风险较高。
见下文更详细的描述，已经实验证实能够通过应用糖化蛋白膳食刺激赖氨酸回收途径。与上述FL情况相同，在喂饲糖化蛋白膳食的受试动物观测到FL3P、3DG和3DF升高。
本发明酶抑制剂化合物阻断赖氨酸回收途径，防止由FL3P形成毒性3DG。
下述是说明酶抑制剂适用于实施本发明的一套完整标准，以及确定任何推定抑制剂是否符合这些标准的某些实验。适用于本发明的候选激酶抑制剂可以是分离自植物或微生物的天然产物。或者它们可以是根据对酶反应和其机制的正确认识获得的合成分子。也可用联合的方法合成抑制剂。由随机起始点可产生混合文库。而且，可用联合方法制备与以前鉴定的FL3P激酶靶抑制剂有关的各种化合物。
无论推定抑制剂的来源如何，不能认为不符合所有以下列举标准的化合物是能够抑制赖氨酸回收途径，由此预防、降低或延迟发生糖尿病并发症或有关病因学病症的有用治疗药物。
1.所述抑制剂应该是小分子而且易于被细胞摄取。为了满足此标准，所述抑制剂的分子量必须小于2,000道尔顿，约1,000或更小更理想。
2.所述抑制剂必须竞争性、非竞争性、不可逆性或自杀性抑制FL3P激酶。如果所述抑制剂是竞争性或非竞争性抑制剂，则抑制常数Ki必须小于约1mM。理想的是，抑制常数必须小于100μM，更理想的是，约40μm或更低。如果所述抑制剂的抑制作用是自杀式或其它不可逆式的，则此抑制常数要求无实际意义。
3.所述抑制剂必须可溶于水溶液，而且在生理pH的水溶液中是稳定的。只有在所述抑制剂或抑制剂盐可以等于或大于10μM的浓度溶解于生理盐水或血清，才满足溶解度要求。只有在溶解于37℃生理盐水的抑制剂溶液在温育1小时后其活性保持50％以上时，才满足该稳定性要求。理想的是，温育1天或1天以上所述抑制剂活性必须保持50％以上。
4.所述抑制剂必须具有可接受的药代动力学。即，给予所述药物后其治疗有效浓度必须保持至少1小时。理想的是，其有效浓度应该至少保持8小时。更理想的是，每天给药一次就足以维持所述抑制剂的治疗浓度。该要求并不意味着所述抑制剂在第一次给药后就一定能够达到治疗浓度。已有许多成功药物实例，此时只要延长给药就可观测到药物效用。此标准的真正意义在于，一旦达到有效浓度，在最后一次给药后此有效浓度能够维持1小时以上。本文描述了测试治疗效能的实验。
5.所述抑制剂必须是无毒的。此标准要求，给予治疗剂量时该抑制剂对人类没有毒性。理想的是，当抑制剂在血液和/或靶组织的水平两倍于治疗作用水平时其毒性不明显。更理想的是，当抑制剂水平6倍于或更高于治疗范围时，其毒性不明显。长期的抑制剂治疗才能防止糖尿病并发症。所以，无毒性要求必须包括急性毒性和慢性毒性，慢性毒性可能在延长的长期使用时才显现。采用良好建立的动物研究能够容易地评价候选分子的毒性。在I期临床试验中评价人体毒性。
用于实施本发明的化合物包括下式化合物和所述化合物的异构体以及药学上可接受的盐
其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、和直链或支链烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下基团的取代基H、氨基酸残基、聚氨基酸残基、肽链、直链或支链脂肪族基团(C1-C8)(未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代)、直链或支链脂肪族基团(C1-C8)(未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代，而且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分间断)，R”是直链或支链烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X表示-NR’-时，R和R’与其连接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7环原子的杂环，其中氮和氧中的至少一个是所述环中的唯一杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4个线性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羟亚甲基部分 ；Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2以及任选为-OH。
含氮或氧的“R”取代基的实例包括衍生自以下物质的取代基γ-氨基-α-羟基丁酸(-(CH2)2-CHOH-COOH)、1，2，4-三氨基丁烷(-(CH2)2-CHNH2-CH2NH3)、3，6-二氨基-5-羟基庚酸(-CH2-CH(OH)-CH2-CH(NH2)-CH2-COOH)等。
式I结构具有不对称中心，可以以外消旋物、外消旋混合物和各种立体异构体以及它们的混合物存在，所有这样的异构体形式属于本发明范畴。
尽管某些具有上式I结构的化合物是以前已经知道的，但是相信其它化合物是新的，这样的化合物属于本发明范畴，所有式I化合物用于抑制体内酶催化产生3DG的用途也属于本发明范畴。
可使合适的糖例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或其衍生物与氨基酸或其它合适的伯胺或仲胺反应产生具有羰基部分(即Y＝-C(＝O)-)的抑制剂，从而制得以上结构式的抑制剂。或者在选择性使Schiff碱中间体还原为胺的因子例如NaBH3CN存在下，可使糖例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖等与氨基-或羟基-取代的上述类型反应物反应，因此产生具有醇部分(即Y＝-CH(-OH)-)的抑制剂。使用时，氨基酸反应物的活性部分可以是α碳原子上的胺基或氨基酸侧链上的胺基或羟基。合适氨基酸包括必需氨基酸。具体实例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸。其它合适反应物来自更广泛类型的氨基羧酸，例如焦谷氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸等。必要时，也可以使用上述氨基酸的N-酰基衍生物，例如甲酰基赖氨酸。
其它合适反应物包括但不限于未取代或取代芳基(C6-C10)化合物，其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、烷氧基、羧基、硝基或卤基，未取代或取代的链烷，其中所述取代基可至少为一个烷氧基；或者未取代或取代含氮杂环化合物，其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、芳基(C6-C10)、烷氧基、羧基、硝基或卤基。最后一组反应物的实例包括m-甲基、p-甲基-、m-甲氧基、o-甲氧基-和m-硝基-氨基苯，o-和p-氨基苯甲酸；n-丙胺、n-丁胺、3-甲氧基丙胺；吗啉和哌啶。
上式的典型抑制剂化合物见附表A。可用作实施本发明的抑制剂的已知化合物实例包括但不限于葡甲胺(meglumine)、山梨醇赖氨酸和甘露醇赖氨酸。
本文所述抑制剂化合物可以与各种无机或有机酸或碱形成药学上可接受的盐。合适的碱包括例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、取代的铵盐和其它胺盐。合适的酸包括例如盐酸、氢溴酸和甲磺酸。
式I化合物的药学上可接受的盐可以按照本领域技术人员熟知的方法制得。
可用各种激酶活性测定方法检测化合物抑制FL3P激酶的能力。一种有用的测定法包括使潜在抑制剂与果糖-赖氨酸和ATP在存在肾脏组织匀浆或其它酶来源的情况下一起温育。制备检测组分溶液，检测溶液一般包含1mM或更少的本发明抑制剂化合物、1-10mM果糖赖氨酸(FL)、0.1-10mM ATP和足以使FL转化为果糖赖氨酸-3-磷酸的酶源量。在4.5-9.5pH范围、最好是在中性pH或接近中性pH下进行温育。温育温度应该为与酶活性匹配的4-40℃。最好是在生理温度下进行温育。温育后，加入酸沉淀蛋白终止反应，用31P-NMR光谱学检测产生的EL3P。与不含抑制剂的对照样品相比，含有抑制剂化合物的样品减少或消除产生FL3P。
其它测定法适用于快速测定酶抑制作用。一种这样的测定法包括应用果糖-赖氨酸和γ-标记的32P或33P-ATP。因为FL3P不结合Dow-1，但是ATP和大多数其它磷酸盐却结合Dow-1，因此在预定反应时间、通常为10分钟后，使检测溶液通过Dow-1树脂柱可以使产物FL3P与其余反应混合物分开。将产生的溶液加入装有闪烁液如Ecoscint A的容器中，进行计数，以确定所产生的放射性量。
因为难以获得大量人体组织，所以最好使用克隆入表达系统如大肠杆菌的重组型激酶。从组织特异性cDNA文库的“鸟枪法”克隆能够容易地获得克隆激酶。这类文库容易从商业来源获得。例如它们可得自Clontech，Palo Alto，CA。可用购自Stratagen(位于San Diego，California)的λ克隆系统进行所设想的鸟枪法克隆。该克隆试剂盒包括其使用的详细说明。
本发明的药用制剂包括作为活性成分的一种或多种上述化合物和药学上可接受的载体介质或辅助剂。
这些成分可以制备成适用于给药的各种形式，包括液体和固体形式。因此，所述制剂的形式可以是片剂、囊片(caplet)、丸剂或锭剂，或者所述制剂可以填充于合适容器中，例如胶囊，或者如果是悬浮剂，可灌装于瓶中。本文使用的“药学上可接受的载体介质”包括所有溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮辅助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体黏合剂、润滑剂等，只要适用于需要的特定剂型。合适载体介质的典型实例包括明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、植物和动物脂肪和油、树胶、聚二醇等。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(MackPublishing Co.，Easton，PA1975)公开了配制药用组合物使用的各种载体和已知用于其制备的技术。除非某一常规载体介质与本发明酶抑制剂不匹配，例如产生任何不需要的生物效应或与药用制剂的任何其它组分以有害方式相互作用，否则其应用属于本发明范畴。
在本发明药用制剂中，所述活性药物的含量至少为所述制剂总量的5％(重量)，一般不高于98％(重量)，如果有的话，包括载体介质和/或辅助剂。活性药物的比例最好为所述组合物的65％-95％(重量)。
辅助活性药物最好为结合体内3DG的化合物。这类化合物包括但不限于氨基胍、氨基苯甲酸及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、氨基取代的咪唑、1，2-二取代的苯咪唑、取代的1，2，4-三唑、二氨基吡啶及其衍生物、氨基取代的嘧啶、氨基醇类、二胺类等。本发明药用制剂也可以包括作为辅助活性药物的抗高血压药物，特别包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂。
如果必要或需要，所述药用制剂中也可加入辅助物质，例如保护所述活性化合物免被胃酸破坏或有助于所述活性化合物吸收入血液的化合物。这样的辅助物质可以包括例如络合剂，例如部分抵消胃内酸性条件的硼酸盐或其它盐等。以脂肪酸盐传递所述活性化合物可增强吸收(在所述活性化合物含有一个或多个碱性官能团的情况下)。
可以采用有效抑制FL3P赖氨酸回收途径的任何给予量和任何给药途径一起给予本发明化合物和任何辅助活性成分。因此，本文使用的表述“治疗有效量”是指所述酶抑制剂的无毒但是足够的剂量，该足够量足以达到需要治疗以防止糖尿病并发症或抑制其它医学原因所致的代谢性产生3DG，例如减轻衰老效应或AGE-蛋白形成具有致病作用的其它人类疾病状态。需要的精确剂量可以各不相同，取决于患者类型、年龄和一般状况、并发症性质、具体的酶抑制剂和其给药方式等。
本发明化合物最好配制成易于给药和剂量均一的剂型。本文使用的剂量单位形式是指适用于待治疗患者的酶抑制剂的物理独立单位。每个剂量应该包含估计其本身或与选定的药用载体介质一起可产生需要的治疗效应的活性物质的量。通常给予本发明化合物的剂量单位含约1mg-2,500mg所述化合物(以所述制剂重量计)，优选含约5mg-250mg。
根据需要治疗的糖尿病并发症的性质，本发明化合物可以口服或胃肠外给予，胃肠外给予例如为肌内注射、腹膜注射、静脉输注等。为了获得需要的治疗效应，口服或胃肠外给予本发明化合物的剂量水平为每天每公斤患者体重约0.7μg-20mg、优选为约30μg-3.5mg，每天一次或多次。
特别优选口服活性酶抑制剂，前提是口服剂量能够使抑制剂在血液和/或靶组织达到有效治疗水平。本领域技术人员能够容易地测定去蛋白血液、肾脏和其它靶组织样品中的小分子抑制剂水平。可以比较这些样品中的抑制剂浓度与预定抑制常数。组织水平远远低于抑制常数说明缺乏治疗活性。如果是不可逆性抑制剂，可通过测定相应组织的FL3P激酶水平证实或反驳缺乏这样的治疗活性。在所有情况下，可通过使人类或动物受试者摄食富含糖化赖氨酸残基或果糖-赖氨酸的食物，以及在摄食前和摄食后检测其尿液中的3DG和3DF量，评价治疗活性。与相同受试者抑制剂治疗之前分泌水平相比，其系统内具有治疗活性抑制剂的受试者分泌3DG和3DF均降低，而尿液分泌的果糖-赖氨酸增加，详见下文。
根据选定的确切抑制剂，通常给予本发明化合物一天一次或最高可达每天4-5次。尽管优选一天一次的给药方案，但是使糖尿病患者习惯于密切注意其疾病状态，这样如果需要的话容易接受更频繁的给药方案，以便传递上述日剂量。但是，给予本文所述化合物和组合物的准确方案必须取决于所治疗患者个体的需要、所给予治疗的类型和主治医师的判断。本文使用的术语“患者”包括人类和动物。
本文所述抑制剂化合物可用于抵抗糖尿病并发症，尤其是可用于抵抗影响40％以上的糖尿病患者而且是需要透析和肾脏移植的终末期肾病的主要原因的糖尿病肾病。此外，这些抑制剂可用于预防或治疗AGE-蛋白形成引起的其它病症，例如高血压、中风、神经变性性疾病如Alzheimer型老年性痴呆、循环疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎、白内障和老年性全身性衰老作用。
初步的实验表明，长期摄食糖化蛋白刺激赖氨酸回收途径对健康引起严重不利影响。与FL的情况相同，在喂饲糖化蛋白膳食的受试动物观测到FL3P、3DG和3DF升高。见表B。经过8个月这样的膳食后，在糖化蛋白膳食动物观测到类似于在糖尿病肾脏见到的明显肾脏病理学证据，详见下文实施例10。还在摄食少量糖化蛋白的人类自愿者观测到尿液中的3DG和3DF水平瞬时升高。
表B糖化蛋白％FL3P浓度(nM，肾脏)3DG/3DF浓度(μM，血浆)0 97 1.4/0.051 295 -2.5605 -5 937 -10 10663.6/0.1220 12595.2/0.1430 12676.2/0.28因为刺激新发现的赖氨酸回收途径导致系统性3DG水平显著升高，所以进行研究确定糖化膳食是否对妊娠产生明显影响。迄今获得的结果提示，该途径具有非常强的作用，见随后的实施例。
另外，众所周知的是，大鼠和小鼠易感品系早期(断奶后)供给的膳食对1型糖尿病具有显著影响，发病率10-90％。在最近10年，人们对该现象进行了较多的研究。参见例如，Diabetes，46(4)589-98(1997)和Diabetes Metab.Rev.，12(4)341-59(1996)，以及其中引用的参考文献。部分本发明者就两种由两个极端诱导糖尿病的膳食进行了研究。AIN-93(Dyets，Inc.)引起的糖尿病发病率最低，而且尿中3DF/肌苷比值在已进行的观测中最低(1.0)。Purina500引起的糖尿病发病率最高，尿中3DF/肌苷比值升高2.5倍。由于在大鼠胰腺观测到FL3P、3DG和3DF，所以果糖赖氨酸激酶和该代谢途径的代谢物可能参与I型糖尿病的发生。该型糖尿病易感动物(人类胰岛素依赖性糖尿病或I型糖尿病的有用模型)的免疫系统异常，使其对出现于胰腺β-细胞的未知抗原敏感，导致所述动物自身免疫系统对其β-细胞的自身免疫性攻击。随后导致胰腺破坏，因此使动物不能产生胰岛素。3DG与蛋白反应可产生新的抗原位点是众所周知的。因此，看来各种膳食的抗原性质来源是胰腺分解果糖赖氨酸-3-磷酸产生的3DG。
此外，因为已知3DG一般与胺类反应，所以它能够与DNA相互作用，而且具有致突变和致癌潜能以及交联蛋白质。
发现FL3P赖氨酸回收途径使得首次可以有效区分糖尿病人群，而且可以确定什么亚群的糖尿病患者可能发生糖尿病并发症。可以对受试者生物体液如尿液、血液组分(尤其是血浆或血清)、淋巴液、间隙液等方便地进行该检测。
过夜禁食后，人类受试者摄食含较高浓度的糖化赖氨酸残基的食品。例如该食品形式可以是奶酪/糖“糕点”(见下文实施例5所述)或某些其它糖化赖氨酸或合成果糖-赖氨酸的合适来源。当使用含糖化赖氨酸残基的蛋白时，糖化赖氨酸含量优选为总蛋白氨基酸的0.02-10％，或更优选为约0.2-0.4％。口服剂量的糖化赖氨酸残基的总量应该约0.3g。最好在摄食糖化赖氨酸来源之前、之后1、3和5小时、或各个临床情况许可的其它合适时间收集尿液样品。
检测尿液样品的3DG和3DF水平，计算3DG和3DF代谢物的比率。在该检测中使用的具体方法学对实施本发明不是必需的。需要的话，可使用以下实施例5所述的GC方法。或者可以使用比色测定法或免疫测定法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
显然，糖尿病患者面对的主要危险因子是血糖控制，新近的完全的糖尿病控制和并发症试验清楚地证实这一点。但是，仅用血糖水平不能解释糖尿病并发症的发生；比较糖尿病并发症发生率与历史血糖水平可见，是相当分散的。
确定发生糖尿病并发症风险最高的糖尿病亚组人群的方法是本发明特别重要的一个方面。该方法包括摄食糖化赖氨酸源之前以及摄食后最佳时间测量FL、3DG和3DF水平。
例如，正常受试者禁食的尿液3DG/3DF比率约0.025，而糖尿病患者的该比率较高，可最高达5倍甚至更高。图7的数据证实了这一点，图7显示血糖量正常者的3DG/3DF比为0.025(1/39.77)，在该值的周围的散射非常紧密，而糖尿病患者的平均比率(平均值0.069)增高2倍以上，围绕该平均值的散射也大得多。
本发明证实，糖尿病患者产生的3DG增加。所以，拮抗糖尿病并发症需要高度有效地去除这种毒性代谢物。用本文所述方法计算的3DG/3DF比值使得人们可以评价3DG解毒途径的效率。低比值的个体一般不容易发生糖尿病并发症。较高比率个体(包括比率在正常范围内的个体)的风险较高，而比率高于正常范围的个体发生糖尿病并发症的风险特别高。
最近对4种不同大鼠品系的血浆和尿液果糖赖氨酸(FL)的测量结果证实，其相应肾脏处理血液FL的方式变异非常大。实际上，根据FL和其代谢物与肌苷的比值，4个品系中的2个品系(Long Evans，Brown Norway)中，肾脏滤过的所有FL都出现在尿液中。根据与过滤的肌苷比较，其它2个品系(Sprague Dawley，Fischer)中，10-20％血浆FL出现在尿液中。这些测量结果强有力地提示，哺乳动物肾脏处理FL的变异性大。假如已知啮齿动物和人类肾脏功能相同，则有充分理由认为，处理FL的相似变异存在于人类。因为FL主要进入果糖赖氨酸回收途径，所以整个途径可能在由超滤液吸收大量FL的人类个体受到明显刺激，导致在肾脏局部以及整个机体产生高水平的3-脱氧葡糖醛酮(3DG)。该观测结果可用作诊断试验的基础，其中比较同时获得的血浆或血清样品和尿液样品确定FL进入肾脏的量以及进一步出现在尿液中的部分。那么该比率明显低于1的个体具有发生各种肾脏病理的风险，所述肾脏病理包括但不限于糖尿病肾病、老年性肾功能衰竭和肾癌。
利用对赖氨酸回收途径的测试能够简便安全地测定本发明激酶抑制剂的治疗效用。测试方案与以上刚提供的方案相同，例外的是除了检测尿液3DG和3DF水平之外还检测尿液果糖赖氨酸水平。在开始FL3P激酶抑制剂治疗之前和之后进行该试验均是有用的。将每个时间点的尿液3DG和3DF水平相加，并与用相同样品测定的果糖-赖氨酸水平相比较。
赖氨酸回收途径的活动导致摄食富含糖化赖氨酸残基的食物后尿液中的3DG和3DF水平达到峰值。这些代谢物与未反应的果糖-赖氨酸(为人体尿液的正常组分)的浓度比反映该途径的活性。抑制赖氨酸回收途径使排泄3DG和3DF的量减少，而果糖-赖氨酸的排泄水平增加。因此，在开始治疗后，检测(3DG＋3DF)/果糖-赖氨酸比的降低可定量激酶抑制剂的治疗效用。值得注意的是，尿液体积或代谢物浓度不是解释此测定的因素，因为只考虑代谢物比值。
根据以上公开的内容可知，经口摄食含高浓度糖化赖氨酸残基的食物导致产生肾脏和血清3DG。应当告诫肾病风险个体例如糖尿病患者避免这些高浓度食物。可用各种方法检测糖化赖氨酸残基浓度。下文实施例4描述了一种这样的测量方法。然而，精确测定糖化赖氨酸残基水平的任何合适测量方法学均可代替以下例举的测定方法。具体设计的测定方法实例包括但不限于比色法和免疫法。
不管所用的测定方法如何，测定制成食品的糖化赖氨酸残基含量以及将这些测定结果告知发生肾脏功能紊乱的风险个体，使得这类个体避免摄食糖化赖氨酸含量高的食品，均属于本发明范畴。
提供以下实施例以更详细地描述本发明。提供这些实施例仅用于说明本发明的目的，绝不能解释为限制本发明。除非另有说明，否则实施例中的所有温度均为摄氏度。
实施例1FL3P的分离和鉴定糖尿病大鼠肾脏的高氯酸提取物的31P NMR分析表明，新的糖一磷酸盐的共振为6.24ppm，在非肾脏组织未观测到这样的结果，而在非糖尿病肾脏的水平明显较低。用1-丁醇-乙酸-水(5∶2∶3)作洗脱液在微晶纤维素柱上层析所述提取物，分离出与所观测到的共振有关的化合物。用质子2D COSY测定其结构为果糖-赖氨酸3-磷酸。之后通过用如上所述制备的FL注射动物(Finot和Mauson，Helv.Chim.Acta，521488(1969))，而且表明直接磷酸化为FL3P，证实了这一点。用位置-3特异性氘化的FL证实磷酸位置为碳-3。这可通过分析连接和非连接的31P NMR光谱进行。正常的P-O-C-H连接产生J值为10.3Hz的FL3P双峰，而P-O-C-D没有连接，并且产生连接和非连接的单峰，与3-氘化FL3P所见相同。FL3P的独特特性是，当用硼氢化钠处理时，它转化为2个新的共振5.85和5.95ppm，它们相对于甘露醇-和山梨醇-赖氨酸3-磷酸。
实施例2FL3P的合成用50ml MeOH回流1mmol二苄基-葡萄糖3-磷酸和0.25mmol α-苄酯基-赖氨酸3小时。用100ml水稀释溶液，以吡啶鎓形式在Dow-50柱(2.5×20cm)上层析，首先用水(200ml)、然后用600ml缓冲液(0.1M吡啶和0.3M乙酸)洗脱。在水洗涤结束、缓冲液洗涤开始时洗出目标化合物。用5％Pd/C在20psi氢下去除苄酯基和苄基封闭基团，获得6％产率的FL3P。
实施例3由FL和ATP酶性产生FL3P以及筛选抑制剂的测定法开始用31P NMR证实肾脏皮质的激酶活性。用9ml含有150mM氯化钾、5 mM DTT、15mM氯化镁，pH7.5的50mM Tris·HCl匀浆3g新鲜的猪肾脏皮质样品。以10,000g离心30分钟，然后将上清液以100,000g离心60分钟。加入硫酸铵至60％饱和度。于4℃1小时后，离心收集沉淀物，将其溶解于5ml原缓冲液中。将该溶液的2ml等份与10mM ATP和10mM FL(按上述实施例1制备)于37℃温育2小时。用300μl高氯酸猝灭反应，离心去除蛋白，在SephadexG10(5×10cm)柱上脱盐。31P NMR分析反应混合物检测形成的FL3P。
根据由此获得的激酶活性证据，进行放射性检测。利用FL3P不能结合Dow-1阴离子交换树脂设计此测定。试图分离FL3P时发现了其该特性。因为大多数磷酸盐结合该树脂，所以怀疑大量与ATP反应的全部化合物以及任何过量的ATP会发生结合，使FL3P留在溶液中。第一步是确定去除该测定中的ATP需要的树脂量。将所述混合物吸入200mg Dow-1的0.9ml水悬浮物中，涡旋并离心以填充树脂，从而完成该步骤。由此吸取0.8ml上清液加到200mg新鲜干树脂上，涡旋以及离心。吸取0.5ml体积上清液加入10ml Ecoscint A中，并计数。残余物计数为85cpm。该步骤用于所述测定。将用60％硫酸铵沉淀皮质匀浆粗品获得的沉淀物于4℃再溶解于匀浆缓冲液。该测定在0.1ml 50mM Tris·HCl，pH7.5中含有10mM γ33P-ATP(40,000cpm)、10mMFL、150mM KCl、15mM氯化镁、5mM DTT。用1、2和4mg蛋白于37℃一式三份测量30分钟以确定FL3P产生速率和酶浓度之间的关系。减去同时操作的没有FL的空白值，并记录数据。观测到的活性相当于FL3P合成速率为约20nmols/hr./mg.蛋白。
实施例4葡甲胺和不同多元醇赖氨酸对形成3-脱氧葡糖醛酮的抑制作用a.一般的多元醇赖氨酸合成将糖(11mmole)、α-苄酯基-赖氨酸(10mmol)和NaBH3CN(15mmole)溶解于50ml MeOH-H2O(3∶2)中，于25℃搅拌18小时。用过量Dow-50(H)离子交换树脂处理溶液，以分解过量的NaBH3CN。将此混合物(液体和树脂)转移到Dow-50(H)柱(2.5×15cm)上，用水充分洗涤，以去除过量的糖和硼酸。用5％氢氧化铵洗脱苄酯基-多元醇赖氨酸。将蒸发时获得的残余物溶解于水-甲醇(9∶1)中，用10％披钯炭催化剂以氢气(20psi)还原。过滤并蒸发获得多元醇赖氨酸。
b.用山梨醇赖氨酸、甘露醇赖氨酸和半乳糖醇赖氨酸还原尿液和血浆3-脱氧葡糖醛酮的实施方案从6只大鼠收集尿液3小时。还获取血浆样品。然后腹膜注射给予大鼠10μmol山梨醇赖氨酸、甘露醇赖氨酸或半乳糖醇赖氨酸。再收集尿液3小时，在3小时结束时获取血浆样品。
如以下实施例5所述测定这些样品中的3-脱氧葡糖醛酮，并将不同体积对肌苷归一化。山梨醇赖氨酸使尿液3-脱氧葡糖醛酮平均降低50％、甘露醇赖氨酸平均降低35％，而半乳糖醇赖氨酸平均降低35％。山梨醇赖氨酸使血浆3-脱氧葡糖醛酮降低40％、甘露醇赖氨酸降低58％，而半乳糖醇赖氨酸降低50％。
c.应用葡甲胺降低尿中的3-脱氧葡糖醛酮按上述b)处理3只大鼠，例外的是腹膜注射葡甲胺(100μmol)，代替上述的赖氨酸衍生物。注射后3小时，尿中的平均3-脱氧葡糖醛酮浓度降低42％。
实施例5人类摄食糖化蛋白后尿中的FL、3DG和3DF升高a.制备含糖化蛋白的食品将260g酪蛋白、120g葡萄糖和720ml水混合获得均一混合物。将该混合物转移到金属碟并于65℃烹制68小时。然后将获得的糕点磨成粗粉(a course powder)。
Kjeldahl方法测定此粉含有60％的蛋白质。
b.测定糖化赖氨酸含量按以上步骤a制备1g所述糕点粉，以6N HCl回流水解20小时。用氢氧化钠溶液将获得的溶液pH调节为18，并稀释至100ml。以果糖赖氨酸酸水解产生的产物furosine在氨基酸分析仪上测量果糖赖氨酸含量。用这种方法测得所述糕点的果糖赖氨酸含量为5.5％(w/w)。
c.实施方案让志愿者进食不含果糖赖氨酸的膳食2天，然后摄食如本文所述制备的食品22.5g，由此有效接受2g剂量的果糖赖氨酸。以2小时间隔收集尿液，连续收集14小时，24小时时收集最后一次尿液。
d.测量尿中的FL、3DG和3DF用Waters C18 Free Amino Acid柱和乙腈-甲醇-水(45∶15∶40)到乙腈-乙酸钠-水(6∶2∶92)的梯度洗脱系统以Waters 996二极管阵列经HPLC测量FL，洗脱速率为1ml/min。定量使用内标葡甲胺。
使样品去离子后用HPLC测量3DF。应用PA1柱(Dionex)和用32mM氢氧化钠以1ml/min洗脱，在Dionex DX-500HPLC系统上进行分析。由用合成3DF每天获得的标准曲线进行定量。
使样品去离子后通过GC-MS测量3DG。以10倍过量的二氨基萘的PBS衍化3DG。乙酸乙酯提取获得不含盐的组分，用Tri-Sil(Pierce)将其转化为三甲基甲硅烷基醚。在选择离子监测GC-MS系统的Hewlett-Packard5890上进行分析。应用以下温度程序在融合二氧化硅毛细柱(DB-5，25mx.25mm)上进行GC注射端口250℃、起始柱温150℃保持1分钟、然后以16℃/分钟升高至290℃并保持15分钟。定量3DG应用使用内标U-13C-3DG的选定离子监测。
图3为一名志愿者摄食糖化蛋白后尿中产生的FL、3DF和3DG。显然全部3种代谢物均快速出现在尿中。即使24小时后尿中3DF和3DG也都略为升高。
图4为在7个人的受试组的每个成员中的3DF形成。在所有受试例均见到相似图形分布。如图4所示，快速浓注FL后约4小时出现3DF排泄峰，甚至快速浓注后24小时仍可见到3DF略为升高。
实施例6进食实验糖尿病患者排泄到尿中的N-乙酰基-β-葡糖胺酶(NAGase)的浓度升高。人们认为它是肾小管损害的早期标志，但是不完全了解尿中NAGase升高的发病机理。已经提出糖尿病患者尿中NAGase排泄量增高是由于糖尿病引起近端肾小管溶酶体活化使尿中的排泄物增加而不是细胞破坏所致。
该实施例获得的结果表明，在所有比较中，实验组3DF和NAGase水平相对于对照组均升高。因此，喂饲糖化蛋白动物将过量的NAGase排泄到尿中，类似于在糖尿病患者获得的结果。与对照动物相比，实验动物尿中NAGase排泄量增高约50％。与对照相比，这些动物尿中的3DF也增高5倍。由图5和6可见，尿3DF和3DG密切相关。看来两种化合物均以肾小球滤过率从血浆中清除，而没有重吸收。
实施例7肾脏蛋白的SDS凝胶电泳对两只大鼠每日注射5μmol FL或甘露醇(用作对照)，连续5日。处死动物，取出肾脏并解剖肾皮质和髓质。用5体积含150mM氯化钾、15mM氯化镁和5mM DTT，pH7.5的50mM Tris·HCl匀浆组织。以10,000g离心15分钟去除细胞碎片，然后再将上清液以150,000g离心70分钟。在12％聚丙烯酰胺凝胶以及4-15％和10-20％梯度凝胶上经SDS PAGE分析溶解蛋白。在所有情况下，与注射甘露醇的动物相比，注射FL动物的肾脏提取物的低分子量带消失或肉眼检测低分子量带减弱。
实施例83-O-甲基果糖赖氨酸的合成回流19.4g(0.1mol)无水3-O-甲基葡萄糖和1g亚硫酸氢钠在30ml甲醇和15ml甘油中的悬浮液30分钟，然后加入0.035molα-苄酯基-赖氨酸和4ml乙酸。回流该溶液3小时。用1体积水处理该溶液，以吡啶鎓形式在Dowex-50柱(4×50cm)上层析，首先用水洗脱，然后用乙酸吡啶鎓洗脱。合并并蒸发含纯物质的流分。将所获得的物质溶解于50ml水-甲醇(9∶1)，用10％披钯炭催化剂以氢气(20psi)还原。过滤并蒸发获得3-O-甲基-果糖赖氨酸。
例如按照本领域技术人员周知的方法用糖化剂例如果糖糖化选定的含氮或氧的原料(可以是氨基酸、聚氨基酸、肽等)，可制备具有上式(I)结构的其它具体化合物，需要的话，所述糖化剂可以是化学修饰的糖化剂。
实施例9FL3P激酶活性的其它测定方法a.制备母液制备检测缓冲液，它为100mM HEPES pH8.0、10mMATP、2mM氯化镁、5mM DTT、0.5mM PMSF。制备2mM果糖基-精胺盐酸的果糖基-精胺母液。制备2mM精胺盐酸的精胺对照液。
b.合成果糖基-精胺应用已知方法(J.Hodge和B.Fisher，Methods Carbohydr.Chem.，299-107(1963))合成果糖基-精胺。以摩尔比8∶4∶1(精胺∶葡萄糖∶焦亚硫酸盐)制备精胺(500mg)、葡萄糖(500mg)和焦亚硫酸钠(80mg)的50ml甲醇-水(1∶1)混合物，回流12小时。用水将所述产物稀释至200ml，上样于DOW-50柱(5×90cm)。用2柱体积水去除未反应葡萄糖，用0.1M氢氧化铵去除所述产物和未反应精胺。冻干合并的所述产物峰流分，通过测定所述产物的定量13C NMR光谱(以45°脉冲、10秒松弛延迟而且没有NOE去连接收集NMR数据)的C-2果糖基峰的积分，从而确定果糖基-精胺浓度。
c.激酶纯化分析制备温育混合物，它包含10μl所述酶制剂、10μl检测缓冲液、1.0μCi33P ATP、10μl果糖基-精胺母液和70μl水，使其于37℃温育1小时。温育结束时，将90μl(2×45μl)样品点样于2个直径2.5cm的磷酸纤维素圆盘(Whatman P-81)上，让其干燥。用水充分洗涤圆盘。干燥后，将圆盘置于闪烁瓶中并计数。
用合适精胺对照复份测定每个酶流分。
实施例10在糖化蛋白膳食受试动物观测到的肾脏病理学使3只大鼠摄食糖化蛋白膳食(20％总蛋白；3％糖化蛋白)8个月，并与9只相同年龄的摄食对照膳食大鼠进行比较。主要发现糖化膳食动物的肾小球损害明显增加。在这些动物观测到的常见病变是附着于肾小球囊的肾小球丛的节段性硬化、肾小管壁上皮变形和间质纤维化。全部3只糖化蛋白膳食动物以及仅1只对照膳食动物的肾小球损害超过13％。其机会性发生的概率小于2％。除了在肾小球观测到的病理学改变之外，还在肾小管中观测到许多透明(hylinated)管型。尽管没有定量，但是在糖化膳食动物透明管型更多。在糖化膳食动物还观测到NAGase水平升高。
由该实验结果可看出，糖化膳食引起受试动物发生一系列类似于在糖尿病患者肾脏观测到的组织学病变。
实施例11糖化膳食对子代的影响在初步的实验中，使5对小鼠摄食糖化膳食(18％总蛋白；3％糖化蛋白)，并在7个月内对其育种6次。产生的6个子代得到以下数目的活幼鼠17、23、13、0、3和0。鉴于第三次育种后活幼鼠明显减少，所以使两组(每组10对)摄食或糖化膳食(13％总蛋白；3％糖化蛋白)或对照膳食(13％总蛋白；0％糖化蛋白)。迄今，两组幼鼠已经育种4次，在两组获得相似的结果。第一次妊娠产生49/20(糖化膳食/对照膳食)幼鼠；第二次妊娠，18/41；第三次，37/27；第四次，20/33。第五次妊娠目前正在进行中。已经测试了小鼠对的高血糖情况。实验组和对照组的血糖水平分别为120和112mg/dl。
小鼠尿液3DF水平的初步测定结果表明，正如所预料，摄食本文所述糖化膳食时，系统性3DF明显升高(约5-10倍)。
实施例12果糖赖氨酸途径的致癌效应为了研究果糖赖氨酸途径形成的代谢物的致癌潜力，在肾癌高易感性大鼠品系进行了实验。使4只大鼠摄食糖化蛋白膳食，3只大鼠摄食对照膳食。摄食10周后，处死动物，检测其肾脏。发现摄食糖化膳食的全部4只大鼠的肾癌大小超过1mm，而在对照大鼠没有见到这样大的肾癌。其机会性发生的概率小于2％。资料表明，动物膳食中的糖化蛋白产生的过量果糖赖氨酸在肾小管细胞(已知肾小管细胞是大多数肾癌的细胞来源)中引起3DG水平升高，3DG可与细胞DNA相互作用，引起各种突变，最终导致发生癌症。可能该过程在人类肾癌以及其它部位的癌症发生中起作重要作用。
实施例13糖化蛋白膳食对易感大鼠肾细胞癌的膳食效应在评价糖化蛋白膳食和肾细胞癌的关系的其它实验中，将28只具有使其对发生肾癌易感的突变的大鼠分为两组。一组摄食糖化蛋白膳食，另一组摄食对照膳食。糖化蛋白膳食为其中加入3％糖化蛋白的标准营养膳食。糖化蛋白的制备为加入水(2×干燥物质重量)使酪蛋白和葡萄糖(2∶1)混合在一起，于60℃焙烤混合物72小时。以相同方式制备对照，不同的是不用水而且在焙烤前不将酪蛋白和葡萄糖混合在一起。3周龄断奶后立即使大鼠摄食所述膳食，并在以后的16周中保持任意进食所述膳食。然后处死动物，固定肾脏，制作hemotoxylin和曙红切片。受过训练的病理学家检测病变。鉴定了4种类型的病变。包括囊肿、非常小的肿瘤样细胞团块(通常不到10个细胞)、0.5mm或更小的小肿瘤以及大于0.5mm的肿瘤。在摄食糖化膳食的动物观测到的每种类型病变均较摄食对照膳食的动物多，见下表所示。
为了总结所述结果，计算每种膳食的每个肾脏切片的平均病变数。对照膳食和糖化膳食分别为0.82±0.74和2.43±2.33。机会性发生的概率约2/100,000。
这些结果强有力地支持上述假说本发明的发现基础即赖氨酸回收途径的作用还引起突变，也因此产生致癌效应。这些结果为开发抑制该途径的治疗方法和治疗药物以减轻肾癌以及其中该途径可能具有相似作用的其它器官癌症提供了基础。
实施例14尿中排泄3-脱氧-果糖说明I型糖尿病患者发生微量蛋白尿如上所述，糖尿病患者的糖化中间体3脱氧-葡糖醛酮(3DG)及其还原性去毒产物3脱氧-果糖(3DF)的血清水平升高。在Joslin糖尿病中心一组前展性胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和微量蛋白尿(根据开始于1990-1993在两年中对基线水平的多次测定结果)而没有服用ACE抑制剂的患者中的一组39名个体中，鉴定了所述化合物基线水平和随后的微量蛋白尿(MA)进展的关系。
通过HPLC和GC-MS检测随尿滴(random spot urine)的3DF和3DG基线水平。与非进展者(non-progressor)(n＝15)相比，在随后的4年中发展为高水平MA或蛋白尿的个体(n＝24)的log 3DF/尿肌苷比的基线水平明显较高(p＝0.02)。在该研究中测得的进展者(progressor)的肌苷基线水平为约0.24μmole/mg，而非进展者的肌苷基线水平约0.18μmole/mg。各组的基线3DG/尿液肌苷比不同。调整HgAIC(糖基化血红蛋白的主要部分)基线水平不会明显改变这些发现。这些结果为尿3DF和糖尿病肾脏并发症发生有关提供了另外的证据。
A.定量3-脱氧果糖如下处理样品使0.3mL等份受试样品通过含0.15mL AG 1-X8和0.15ml AG 50W-X8树脂的离子交换柱。然后用0.3mL去离子水将柱洗涤2次，吸去多余液体，经0.45mm Millipore滤器过滤。
用Dionex DX500层析系统分析注射(50μL)的处理样品。carbopac PA1阴离子交换柱应用16％氢氧化钠(200mM)和84％去离子水组成的洗脱液。应用脉冲电流检测器通过电化学检测3DF。在每个未知样品前后均进行包括预期3DF浓度的标准3DF溶液。
B.尿液肌苷的测量采用改良用于板读器的终点比色法(Sigma诊断试剂盒555-A)测定尿液肌苷浓度。鉴定肌苷浓度使尿液体积归一化，以测定其中存在的代谢物水平。
C.尿液白蛋白的测量为了测定受试者尿液白蛋白水平，收集尿滴，用N-白蛋白试剂盒(Behring)在BN100装置上进行免疫浊度测定法。可市售获得抗白蛋白抗体。用任何合适的测定法均可测定尿液白蛋白水平，包括但不限于ELISA测定法、放射免疫测定法、蛋白质印迹分析和点印迹分析。
根据在Joslin糖尿病中心的患者获得的研究资料，可知尿液3DF水平升高与发生糖尿病微量蛋白尿有关。该观测结果为评价糖尿病患者发生严重肾脏并发症的可能性提供了新的诊断参数。
尽管以上描述和/或例举了一些本发明实施方案，但是根据以上的公开内容，各种其它实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。所以，本发明不限于所述和/或例举的具体实施方案，而是能够在不偏离所附权利要求书范围下进行各种改变和改进。
权利要求
1.用于降低患者对与该患者摄入糖化蛋白有关的癌症的易感性的化合物，所述化合物为具有下式结构的化合物及其异构体和药学上可接受的盐 其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、和直链或支链烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下基团的取代基H、氨基酸残基、聚氨基酸残基、肽链、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代而且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分间断的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)，R”是直链或支链烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X表示-NR’-时，R和R’与其连接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7环原子的杂环，其中氮和氧中的至少一个是所述环的唯一杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4个线性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羟亚甲基部分 ；Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2，
2.用于降低患者对与该患者摄入糖化蛋白有关的癌症的易感性的方法，该方法包括给予包含活性化合物的药用组合物的步骤，所述活性化合物具有有效抑制果糖-赖氨酸酶性转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸的抑制活性。
3.按照权利要求2的方法，其中所述癌症为肾细胞癌。
4.按照权利要求2的方法，其中所述活性化合物具有竞争性或非竞争性酶抑制作用，而且其抑制常数(Ki)小于约1mM。
5.按照权利要求2的方法，其中所述活性化合物(i)分子量小于约2,000道尔顿；(ii)在生理盐水或血清中的溶解度大于或等于10μM；(iii)在生理盐水或血清中温育至少1小时后其酶抑制活性保留至少50％。
6.按照权利要求2的方法，其中所述化合物为具有以下结构式的化合物及其异构体和药学上可接受的盐 其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、和直链或支链烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下基团的取代基H、氨基酸残基、聚氨基酸残基、肽链、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代而且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分间断的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)，R”是直链或支链烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X表示-NR’-时，R和R’与其连接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7环原子的杂环，其中氮和氧中的至少一个是所述环的唯一杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4个线性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羟亚甲基部分 ；Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2。
7.按照权利要求2的方法，其中所述药用组合物口服给予。
8.预防、减轻或延迟患者因为AGE-蛋白形成导致发生癌症的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的抑制所述患者产生3-脱氧葡糖醛酮的化合物。
9.按照权利要求8的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。
10.按照权利要求8的方法，其中所述化合物为具有以下结构式的化合物及其异构体和药学上可接受的盐 其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、和直链或支链烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下基团的取代基H、氨基酸残基、聚氨基酸残基、肽链、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)、未取代或被含至少一个氮或氧的取代基取代而且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分间断的直链或支链脂肪族基团(C1-C8)，R”是直链或支链烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X表示-NR’-时，R和R’与其连接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7环原子的杂环，其中氮和氧中的至少一个是所述环的唯一杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4个线性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羟亚甲基部分 ；Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2。
11.在易感受试动物诱发癌症的方法，该方法包括喂饲所述受试动物糖化蛋白膳食，所述喂饲糖化蛋白膳食的量和时间足以维持所述受试动物生物体液的3-脱氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂饲基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受试动物生物体液3DG含量的至少三倍。
12.按照权利要求11的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。
13.筛选影响癌症发生的物质的方法，该方法包括以下步骤(i)如下在易感受试动物诱发癌症喂饲所述动物糖化蛋白膳食，所述喂饲糖化蛋白膳食的量和时间足以维持所述动物生物体液的3-脱氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂饲基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受试动物相同生物体液3DG含量的至少三倍；(ii)将受试物质给予一部分所述受试动物，而不给予另一部分受试动物；(iii)处死所述受试动物；以及(iv)比较在各所述部分易感受试动物中发现的核癌(nucleiccarcinomas)。
14.按照权利要求13的方法，其中各所述部分约为所述受试动物的一半。
15.按照权利要求13的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。
16.筛选预防、降低或延迟癌症发生的物质的方法，该方法包括以下步骤喂饲易感受试动物糖化蛋白膳食，所述喂饲糖化蛋白膳食的量和时间足以维持所述动物生物体液的3-脱氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂饲基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受试动物相同生物体液3DG含量的至少三倍；将受试物质给予一部分所述受试动物，而不给予另一部分受试动物；处死所述受试动物；以及比较各所述部分易感受试动物组织切片。
17.按照权利要求16的方法，其中各所述部分约为所述受试动物的一半。
18.按照权利要求16的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。
全文摘要
本发明所公开的一类化合物在新发现的代谢途径的ATP依赖性反应中抑制果糖－赖氨酸酶性转化为果糖－赖氨酸－3－磷酸。按照该途径的正常作用,分解果糖－赖氨酸－3－磷酸(FL3P)形成游离赖氨酸、无机磷酸盐和3－脱氧葡糖醛酮(3DG),后者是活性蛋白修饰剂。3DG还原为3－脱氧果糖(3DF)可去除毒性,或者它可以与内源蛋白反应形成高级糖化终末产物修饰蛋白(AGE－蛋白),人们认为AGE－蛋白引起糖尿病并发症。还公开了应用这类抑制剂减少AGE－蛋白形成,因此缓解、减轻和延迟糖尿病并发症的方法,以及评价糖尿病患者发生糖尿病并发症的风险的方法和通过检测口服含果糖－赖氨酸的食品后生物样品中的3DG与3DF的比率确定所公开抑制剂的治疗效力的方法。
文档编号C07H15/12GK1331599SQ99815023
公开日2002年1月16日 申请日期1999年10月28日 优先权日1998年10月28日
发明者T·R·布朗 申请人:福克斯契思癌症中心