专利名称：基于壳聚糖或透明质酸-聚(环氧乙烷)和壳聚糖-透明质酸-聚(环氧乙烷)的水凝胶及其 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及壳聚糖-或透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶、使用它们的生物活性物质递送载体和组织工程学支 架、及制备它们的方法。更具体地，本发明涉及通过与具有丙烯酸或甲 基丙烯酸官能团(acrylate or methacrylate functional group)的物质交联的壳 聚糖衍生物和具有硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖-壳聚 糖-聚环氧乙烷水凝胶；通过与具有丙烯酯或甲基丙烯酸官能团的物质交联 的透明质酸衍生物和具有硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶；和通过与(甲基)丙烯酸官能团交联的透 明质酸衍生物以及与(甲基)丙烯酸官能团交联壳聚糖衍生物和具有硫醇官能 团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶。本 发明还涉及包含其上负载的生物活性物质的生物活性物质递送载体，和允 许细胞粘附到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶、所述透明质酸-透明 质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶并允许 所述水凝胶降解的组织工程学支架。本发明还涉及制备所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚 糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶以及所述生物活性物质递送载体的方法。
背景技术：
通常，壳聚糖是分子中具有氨基的天然聚合物，是通过在高温和强碱 条件下处理来自甲壳动物外壳的壳多糖而获得的壳多糖脱乙酰化产物。透 明质酸产生于人体或微生物中，是分子中具有游离羧酸基团的天然聚合 物。壳聚糖和透明质酸两者都已广泛用于各种化学、医疗和食品工程应用 中。对壳聚糖的研究集中于组织工程学支架的制备。例如，已经报道的研 究包括"Biodegradable Polymeric Formulation for Tissue Engineering Surface-
Coated with Chitosan and Preparation Thereof" 、 "Ionic Composite Scaffold Comprising Chitosan-Hyaluronic Acid " 、 " Bioabsorptive Nerve Guidance Channel and Preparation Thereof" 、 "Oligopeptides attached specifically to chondrocytes, Biodegradable Polymeric Substrate Comprising Extracellular Matrix for Manufacturing Artificial Organs and Preparation Thereof"等。此 外，己经报道了对透明质酸的研究，所述研究包括"Temperature-Sensitive Degradable Hyaluronic Acid/Fluronic Acid Composite Hydrogel for Controlled Release Delivery of Growth Factors " 、 " Crosslinked Hyaluronic Acid Hydrogel" 、 "Hyaluronic acid/Type 2 Collagen Hydrogel" 、 "Preparation of Chitosan-Hyaluronic Acid Hybrid Scaffolds for Cartilage Regeneration"等。
尽管己经大量研究了水凝胶在各种工业应用，包括医疗、制药、环境 工程和美容应用中的应用，例如作为药物或细胞递送载体，或作为组织工 程学支架，包括人工皮肤、人工软骨、人工骨等，仍然需要改进水凝胶的 机械性质、制备水凝胶需要的时间、以及固定在水凝胶上的生物活性物质 的收率、活性和功效。
发明内容
在这些情况下，本发明的发明人制备了透明质酸-丙烯酸、与包含丙烯 酸或甲基丙烯酸的物质交联的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶、透明质 酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶、与包含丙烯酸或甲基丙烯酸的物质交联的 壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶、和微球型水凝胶。而且，本发明的发 明人已经发现，所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶、透明质酸-透明质 酸-聚环氧乙垸水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶可以用于在其 上有效地负载生物活性物质如肽、蛋白质或细胞，或用于诱导所述生物活 性物质的有效化学结合，从而改进所述生物活性物质的收率和活性保持。 本发明基于这些发现。
本发明的一个目的是提供通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸的物质交联 的壳聚糖-壳聚糖衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的 壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶。
本发明的另一个目的是提供通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸的物质交
联的透明质酸-透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而 形成的透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶。
本发明的另一个目的是提供通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸的物质交 联的壳聚糖-透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形 成的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶。
本发明的另一个目的是提供微球形式的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝 胶、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸 水凝胶。
本发明的另一个目的是提供组织工程学支架和包含其上负载的生物活 性物质的生物活性物质递送载体，所述组织工程学支架允许细胞粘附或防 止细胞粘附到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶、所述透明质酸-透明 质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶上并允 许所述水凝胶降解，从而促进形成有利于组织再生的条件。
本发明的另一个目的是提供制备壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶的方
法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖与包含丙 烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c)使壳聚糖与包含甲基丙 烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；和(d)在所述壳聚糖衍生物 的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
本发明的另一个目的是提供制备透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶 的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透明质酸 与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使透明质酸 与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；和(d)在所 述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
本发明的另一个目的是提供制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶的 方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液； (b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖 衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以 提供透明质酸衍生物；和(d)在所述壳聚糖衍生物与所述透明质酸衍生物的 混合物和包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
本发明的另一个目的是提供制备壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶微球
的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖与包 含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c)使壳聚糖与包含甲 基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(d)形成包含所述壳聚 糖衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质的混合溶液；(e)将所述混合溶 液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散于 其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物和聚环氧乙烷形成水 凝胶微球并回收所述微球。
本发明的另一个目的是提供制备透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶 微球的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透明 质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使透明 质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(d)形 成包含所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质的混合溶 液；(e)将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将 所述混合溶液分散于其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述透明质酸衍生 物和聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
本发明的另一个目的是提供制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶微 球的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶 液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳 聚糖衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交 联，以提供透明质酸衍生物；(d)形成包含所述壳聚糖衍生物和所述透明质 酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质的混合溶液；(e)将所述混合溶 液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散于 其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物、所述透明质酸衍生 物和聚环氧乙垸形成水凝胶微球并回收所述微球。
本发明的另一个目的是提供制备生物活性物质递送载体或组织工程学 支架的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖 与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c)使壳聚糖与包 含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(d)将生物活性物 质与所述壳聚糖衍生物或包含硫醇官能团的物质混合；和(e)在所述壳聚糖 衍生物与所述包含硫醇官能团的物质之间形成共价键，同时在其上负载所
述生物活性物质。
本发明的另一个目的是提供制备生物活性物质递送载体或组织工程学 支架的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透明 质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使透明 质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(d)将 生物活性物质与所述透明质酸衍生物或包含硫醇官能团的物质混合；和(e) 在所述透明质酸衍生物与所述包含硫醇官能团的物质之间形成共价键，同 时在其上负载所述生物活性物质。
本发明的另一个目的是提供制备生物活性物质递送载体或组织工程学 支架的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水 溶液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供 壳聚糖衍生物；(C)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交 联，以提供透明质酸衍生物；(d)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所 述透明质酸衍生物混合，或与包含硫醇官能团的物质混合；和(e)在所述壳 聚糖衍生物以及所述透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间形成共 价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
本发明的另一个目的是提供制备生物活性物质递送载体或组织工程学 支架的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖 与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c)使壳聚糖与包 含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(d)将生物活性物 质与所述壳聚糖衍生物或包含硫醇官能团的物质混合，以提供混合溶液； (e)将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述 混合溶液分散于其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖和聚环氧乙 烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
本发明的另一个目的是提供制备生物活性物质递送载体或组织工程学 支架的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透明 质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使透明 质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(d)将 生物活性物质与所述透明质酸衍生物或包含硫醇官能团的物质混合，以提 供混合溶液；(e)将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液
中，并将所述混合溶液分散于其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述透明 质酸衍生物和聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
本发明的另一个目的是提供生物活性物质递送载体或组织工程学支 架，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(b)
使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍
生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提 供透明质酸衍生物；(d)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所述透明质 酸衍生物混合，或与包含硫醇官能团的物质混合；(e)进一步将所述壳聚糖 衍生物和所述透明质酸衍生物与包含硫醇官能团的物质混合，以提供混合 溶液，同时在其上负载所述生物活性物质；(f)将所述混合溶液滴加到包含 疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散于其中；和(g)使 分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物、所述透明质酸衍生物和聚环氧乙 烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
为实现上述目的，根据本发明，所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝 胶、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚 环氧乙垸水凝胶及其制备方法的特征如下
根据本发明的第一个方面，提供了通过与包含甲基丙烯酸官能团的物 质交联的壳聚糖衍生物以及与包含丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖衍生 物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧 乙烷水凝胶。
根据本发明的第二个方面，提供了通过与包含丙烯酸官能团的物质交 联的透明质酸衍生物以及与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸 衍生物和具有硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的透明质酸-透明质 酸-聚环氧乙垸水凝胶。
根据本发明的第三个方面，提供了通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官 能团的物质交联的壳聚糖衍生物以及与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的 物质交联的透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形 成的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶。
根据本发明的第四个方面，提供了微球形式的上述壳聚糖-壳聚糖-聚环 氧乙垸水凝胶、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和壳聚糖-透明质酸-
聚环氧乙垸水凝胶。
根据本发明的第五个方面，提供了生物活性物质递送载体，所述生物 活性物质递送载体包括负载在上述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶、透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶上 的生物活性物质。
根据本发明的第六个方面，提供了组织工程学支架，所述组织工程学 支架包括生物活性物质化学地或物理地结合于其上的水凝胶或微球，所述 水凝胶或微球由壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙 烷、壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-肽形成。
根据本发明的第七个方面，提供了制备壳聚糖丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚 环氧乙垸水凝胶、壳聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶 和壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶的方法，所述方法包
括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物 质交联，以提供壳聚糖-丙烯酸衍生物；(c)使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能 团的物质交联，以提供壳聚糖-甲基丙烯酸衍生物；和(d)在所述壳聚糖丙烯 酸衍生物的混合物、所述壳聚糖甲基丙烯酸衍生物的混合物、或所述壳聚 糖丙烯酸衍生物与所述壳聚糖甲基丙烯酸衍生物的混合物与包含硫醇官能 团的物质之间形成共价键。
根据本发明的第八个方面，提供了制备壳聚糖丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚 环氧乙垸微球、壳聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷微球和壳 聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷微球的方法，所述方法包括如下 步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交 联，以提供壳聚糖-丙烯酸衍生物；(C)使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的 物质交联，以提供壳聚糖-甲基丙烯酸衍生物；(d)形成包含所述壳聚糖丙烯 酸或壳聚糖甲基丙烯酸衍生物的混合物和包含硫醇官能团的物质的混合溶 液；(e)将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将 所述混合溶液分散在其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物 和聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
根据本发明的第九个方面，提供了制备包含生物活性物质的壳聚糖-聚 环氧乙垸微球的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液；(b)
使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c)使壳 聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(d)将生 物活性物质掺入所述壳聚糖衍生物的混合物或包含硫醇官能团的物质中， 并将所述壳聚糖衍生物与所述包含硫醇官能团的物质混合，以提供混合溶 液；(e)将包含所述生物活性物质的所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表 面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散在其中；和(f)使分散在所述溶 液中的所述壳聚糖衍生物和聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
根据本发明的第十个方面，提供了制备透明质酸丙烯酸-聚环氧乙垸水 凝胶的方法，所述方法包括如下步骤(a)形成透明质酸水溶液；(b)使水溶 液中的透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以形成透明质酸-丙烯酸 衍生物；和(c)在所述透明质酸-丙烯酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间 形成共价键。
根据本发明的第十一个方面，提供了制备透明质酸-丙烯酸的方法，所 述方法包括如下步骤(a)形成透明质酸水溶液；(b)形成己二酰二胺溶液； (c)使己二酸二酰肼与包含叔丁基的二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyldicarbonate)化学结合；(d)从化学键形成步骤中分离己二酸酰肼碳酸 丁酯；(e)使己二酸酰肼碳酸丁酯(adipic acid hydrazide butyl carbonate)与 透明质酸反应，以提供透明质酸-己二酸酰肼碳酸丁酯；(f)使透明质酸-己二 酸酰肼碳酸丁酯与透明质酸进行化学反应，以提供透明质酸-己二酸-碳酸丁 酯；(g)从透明质酸-己二酸-碳酸丁酯中除去末端丁基，以形成透明质酸-己 二酸，然后分离；(h)使透明质酸-己二酸与丙烯酸化学结合，以提供透明质 酸-己二酸-丙烯酸(透明质酸-丙烯酸)；和(i)除去未反应的丙烯酸，以分离透 明质酸-丙烯酸。
根据本发明的第十二个方面，提供了制备透明质酸-透明质酸-聚环氧乙 垸水凝胶的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使 透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使 透明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物； 和(d)在所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共
根据本发明的第十三个方面，提供了制备透明质酸-透明质酸-聚环氧乙
垸微球的方法，所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透 明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c)使透 明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(d) 将所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质混合，以提供混 合溶液；(e)将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中， 并将所述混合溶液分散于其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述透明质酸 衍生物和聚环氧乙垸形成水凝胶微球并回收所述微球。
根据本发明的第十四个方面，提供了制备包含生物活性物质的透明质 酸丙烯酸-聚环氧乙垸微球或透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷微球的方法， 所述方法包括如下步骤(a)提供透明质酸水溶液；(b)使透明质酸与包含丙 烯酸官能团的物质反应，以提供透明质酸-丙烯酸衍生物；(c)使透明质酸与 包含甲基丙烯酸官能团的物质反应，以提供透明质酸-甲基丙烯酸衍生物； (d)将生物活性剂掺入所述透明质酸-丙烯酸衍生物的混合物、所述透明质
酸-甲基丙烯酸衍生物的混合物、或掺入包含硫醇官能团的聚环氧乙烷溶液 中，并将所述透明质酸衍生物与所述包含硫醇官能团的物质混合，以提供 混合溶液；(e)将包含所述生物活性物质的所述混合溶液滴加到包含疏水溶 剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散在其中；和(f)使分散在 所述溶液中的所述透明质酸衍生物和聚环氧乙垸形成水凝胶微球并回收所 述微球。
根据本发明的第十五个方面，提供了制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸 水凝胶的方法，所述方法包括如下步骤(a)分别提供壳聚糖水溶液和透明 质酸水溶液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，
以提供壳聚糖衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的 物质交联，以提供透明质酸衍生物；和(d)在所述壳聚糖衍生物与所述透明 质酸衍生物的混合物和包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
根据本发明的第十六个目的，提供了制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷 微球的方法，所述方法包括如下步骤(a)分别提供壳聚糖水溶液和透明质 酸水溶液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以 提供壳聚糖衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物 质交联，以提供透明质酸衍生物；(d)形成包含所述壳聚糖衍生物和所述透
明质酸衍生物的混合物和包含硫醇官能团的物质的混合溶液；(e)将所述混 合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分 散于其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物、所述透明质酸 衍生物和聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
根据本发明的第十七个方面，提供了制备生物活性物质递送载体的方 法，所述方法包括如下步骤(a)分别提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶 液；(b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳 聚糖衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交 联，以提供透明质酸衍生物；(d)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所 述透明质酸衍生物混合，或与包含硫醇官能团的物质混合；和(e)在所述壳 聚糖衍生物以及所述透明质酸衍生物和所述包含硫醇官能团的物质之间形 成共价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
根据本发明的第十八个方面，提供了制备包含生物活性物质递送载体 的壳聚糖丙烯酸-透明质酸丙烯酸-聚环氧乙烷微球、壳聚糖丙烯酸-透明质 酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷微球、壳聚糖甲基丙烯酸-透明质酸丙烯酸-聚环 氧乙垸微球、或壳聚糖甲基丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙垸微球的 方法，所述方法包括如下步骤(a)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液； (b)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖-丙烯酸衍生物或壳聚糖-甲基丙烯酸衍生物；(c)使透明质酸与包含丙烯酸或 甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸-丙烯酸衍生物或透明质酸-甲基丙烯酸衍生物；(d)将生物活性物质掺入所述壳聚糖-丙烯酸衍生物溶液 或所述壳聚糖-甲基丙烯酸衍生物溶液、所述透明质酸-丙烯酸衍生物溶液 或所述透明质酸-甲基丙烯酸衍生物溶液中，或掺入包含硫醇官能团的聚环 氧乙垸溶液中，并将所述壳聚糖-丙烯酸衍生物或所述壳聚糖-甲基丙烯酸 衍生物以及所述透明质酸-丙烯酸衍生物或所述透明质酸-甲基丙烯酸衍生物 与所述包含硫醇官能团的聚环氧乙烷溶液混合，同时将所述生物活性物质 负载于其上，以提供混合溶液；(e)将包含所述生物活性物质的所述混合溶 液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散于 其中；和(f)使分散在所述溶液中的所述壳聚糖-丙烯酸衍生物或所述壳聚 糖-甲基丙烯酸衍生物、所述透明质酸-丙烯酸衍生物或所述透明质酸-甲基
丙烯酸衍生物和聚环氧乙垸形成水凝胶微球并回收所述微球。 有益效果
根据本发明，所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶可 以用于在其上有效地负载生理学物质如肽、蛋白质或细胞，或用于诱导所 述生物活性物质的有效化学结合，从而改进所述生物活性物质的收率和活 性保持。
附图简述
当结合附图时，本发明的上述和其它目的、特征和优点将通过以下详 细描述而变得更明显，其中
图l的反应图解表示制备本发明壳聚糖-甲基丙烯酸化合物的优选实施 方案；
图2的反应图解表示制备本发明壳聚糖-丙烯酸化合物的优选实施方
案；
图3的反应图解表示制备本发明透明质酸-甲基丙烯酸化合物的优选实 施方案；
图4的反应图解表示制备透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH-BOC)的优 选实施方案，所述透明质酸-己二酸二酰肼包含用叔丁基保护的透明质酸；
图5的反应图解表示通过(从中除去叔丁基的)透明质酸-己二酸酰肼 (HA-ADH)和丙烯酸之间的反应来制备透明质酸-己二酸-丙烯酸化合物(透 明质酸-丙烯酸HA-Ac)的优选实施方案；
图6的反应图解(A)表示制备本发明壳聚糖(或透明质酸)-聚环氧乙垸水 凝胶的优选实施方案，图6的示意图(8)显示本发明优选实施方案的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶的网络结构；
图7是本发明优选实施方案的壳聚糖衍生物的NMP光谱，其中(A)表示 壳聚糖-丙烯酸，(B)表示壳聚糖-甲基丙烯酸，(C)表示壳聚糖；
图8是本发明优选实施方案的透明质酸衍生物的NMR光谱，其中(A)表 示透明质酸，(B)表示用叔丁基保护的透明质酸-己二酸酰肼叔丁基酰肼化合
物，(C)表示透明质酸-己二酸-丙烯酸化合物(透明质酸-丙烯酸HA-AC);
图9是本发明优选实施方案的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶的流 变图，其中(A)表示使用100。/。壳聚糖-丙烯酸的水凝胶，(B)表示使用75M壳 聚糖-丙烯酸和25M透明质酸-氨基丙基甲基丙烯酸(aminopropyl methacrylate) 的水凝胶，((3)表示使用50%壳聚糖-丙烯酸和50%透明质酸-氨基丙基甲基丙 烯酸的水凝胶，(D)表示使用透明质酸-己二酸-丙烯酸的透明质酸-聚环氧乙 垸水凝胶的流变
图10显示细胞生长的结果，所述结果是在壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶上 将平滑肌细胞培养6小时和3天后通过观察所述细胞获得的；
图ll是通过光学显微镜采集的照片，所述照片显示进行细胞培养6小时 后获得的结果，所述细胞培养在本发明通过使用100%壳聚糖制备的水凝 胶、通过使用75n/。透明质酸(HA)和25。/。壳聚糖制备的透明质酸-壳聚糖水凝 胶、通过使用50。/。透明质酸(HA)和50Q/。壳聚糖制备的壳聚糖-透明质酸水凝 胶上、和通过使用25。/。透明质酸(HA)和75。/。壳聚糖制备的水凝胶上进行；
图12是通过光学显微镜采集的照片，所述照片显示进行细胞培养3天后 获得的结果，所述细胞培养在通过使用100%壳聚糖制备的壳聚糖水凝胶、 通过使用25。/。透明质酸(HA)和75y。壳聚糖制备的壳聚糖-透明质酸水凝胶、 通过使用50。/。透明质酸(HA)和50c/。壳聚糖制备的壳聚糖-透明质酸水凝胶、 和聚苯乙烯细胞培养瓶上进行；和
图13的照片显示通过使用透明质酸-透明质酸-聚环氧乙垸的混合溶液 获得的透明质酸-聚环氧乙垸微球的照片，所述混合溶液通过将50%透明质 酸-丙烯酸溶液与50%透明质酸_甲基丙烯酸溶液混合，再将所得混合物与 聚环氧乙烷溶液混合而制得，其中(A)通过光学显微镜采集，(B)通过电子显 微镜采集。
具体实施例方式
下面，将描述本发明的优选实施方案。为了清晰和简洁的目的，将省 略对本文所含的已知功能和结构的详述，因为它可能使本发明的主旨不清 晰。
本发明提供了通过与包含丙烯酸的物质交联的壳聚糖衍生物以及与
包含甲基丙烯酸的物质交联的壳聚糖衍生物和包含硫醇官能团的物质之间
的共价结合而形成的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球；通过 与包含丙烯酸的物质交联的透明质酸衍生物以及与包含甲基丙烯酸的物质 交联的透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的 透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球；和通过与包含丙烯酸 或甲基丙烯酸的物质交联的透明质酸衍生物以及与包含丙烯酸或甲基丙烯 酸的物质交联的壳聚糖衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而 形成的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和微球。
在用于本文时，术语"水凝胶"指包含足量水的聚合物的三维结构。 从本发明目的的角度，所述水凝胶包括壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶、 透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝 胶。首先，使含水的壳聚糖或透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸基团的 分子化学结合，以形成壳聚糖-丙烯酸或壳聚糖-甲基丙烯酸、或透明质酸-丙烯酸或透明质酸-甲基丙烯酸。然后，使壳聚糖-丙烯酸和壳聚糖-甲基丙 烯酸的混合物的丙烯酰基或甲基丙烯酰基与包含硫醇官能团的聚环氧乙烷 结合，使透明质酸-丙烯酸和透明质酸-甲基丙烯酸的混合物的丙烯酰基或甲 基丙烯酰基与包含硫醇官能团的聚环氧乙垸结合，并使壳聚糖-丙烯酸和透 明质酸-甲基丙烯酸的混合物的丙烯酰基或甲基丙烯酰基与包含硫醇官能团 的聚环氧乙烷结合，以提供水凝胶和水凝胶微球。
在用于本文时，术语"水凝胶微球"指具有上述水凝胶特性并以微米 级小球的形式提供的水凝胶。根据制备小球的具体过程，可以将水凝胶小 球控制成具有微米级或亚微米级的尺寸。
用于本发明的壳聚糖是脱乙酰化的壳聚糖，优选脱乙酰化至60%或更 多的含水壳聚糖，更优选脱乙酰化至约85%的含水壳聚糖。此外，壳聚糖 的大小为1-1,000 KDa，优选为5 KDa~200 KDa。壳聚糖具有优秀的生物亲 和力和低抗原活性，其可以在体内降解并从人体排出，因此是优选的医用 材料。
用于制备本发明水凝胶和微球的壳聚糖是包含丙烯酸或甲基丙烯酸的 壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物通过壳聚糖的胺官能团与丙烯酸或甲基 丙烯酸的羧基官能团之间的交联而形成。根据本发明的优选实施
过如图l和2所示的反应图解获得壳聚糖-甲基丙烯酸和壳聚糖-丙烯酸化合 物。
优选地，用于本发明的透明质酸是含水透明质酸。透明质酸的大小为 1 3,000 KDa，更优选为5 KDa 500 KDa。透明质酸具有优秀的生物亲和 力和低抗原性质，可以在体内降解并从人体排出，因此是优选的医用材 料。
用于制备本发明水凝胶和微球的透明质酸是包含丙烯酸或甲基丙烯酸 的透明质酸衍生物，所述透明质酸衍生物通过透明质酸的羧酸官能团与丙 烯酸或甲基丙烯酸的胺官能团之间的交联而形成。根据本发明的优选实施 方案，通过如图3、 4和5所示的反应图解获得透明质酸-甲基丙烯酸、用叔 丁基保护的透明质酸-己二酸酰肼叔丁基酰肼和透明质酸-丙烯酸化合物。
更具体地，作为用于制备水凝胶的壳聚糖衍生物，通过使甲基丙烯酸 与壳聚糖化学结合来制备壳聚糖-酰氨基丙烯酸，或者通过使2-羧乙基丙烯 酸与壳聚糖化学结合来制备壳聚糖-2-carboethyl丙烯酸。
而且，作为用于制备水凝胶的透明质酸衍生物，通过使氨基丙基甲基 丙烯酸与透明质酸化学结合来制备透明质酸酰胺(hyaluron-amide)丙基甲 基丙烯酸，或通过使单叔丁基酰肼己二酸酰肼丙烯酸与透明质酸化学结合 来制备透明质酸-酰肼己二酸酰肼丙烯酸。
可以与壳聚糖交联的包含丙烯酸或甲基丙烯酸的物质包括但不限于 丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烷基-(甲基)丙烯酰胺、 单叔丁基酰肼己二酸酰肼丙烯酸、N-单-(甲基)丙烯酰胺、N，N-二-C,-C4垸 基-(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸N-丁基酯(N-butyl(meth)acrylate)、(甲 基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基两烯酸异冰片酯、(甲基)丙烯酸 环己酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸 羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、N-(2-羟乙基)丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N-丁氧 基甲基丙烯酰胺、N-甲氧基甲基丙烯酰胺、N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺、 2-丙烯酰氨基乙醇酸、2-羧乙基丙烯酸(2-carboxyethylacrylate)等。
使壳聚糖衍生物和透明质酸衍生物与包含硫醇官能团的物质形成共价 键，以提供本发明的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球。在 这里，丙烯酸和/或甲基丙烯酸官能团与硫醇官能团的使用比例为
8:1 ~ 1:8，可以控制比例以诱导细胞粘附或抗粘附。优选地，丙烯酸和/或 甲基丙烯酸官能团与硫醇官能团的比例为3:1 1:2，更优选为1:1。
可以以各种比例混合壳聚糖衍生物和透明质酸衍生物，以提供壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球。在这里，壳聚糖与透明质酸的 比例可以在99:1 ~ 1:99的广阔范围内选择，以优化壳聚糖或透明质酸的生 物学性质和机械性质，同时优化和控制制备水凝胶所需的时间。而且，与 壳聚糖或透明质酸结合的丙烯酸与甲基丙烯酸的比例可以在100:0 0:100 的广阔范围内选择，以控制制备水凝胶和水凝胶微球所需的时间。
与壳聚糖衍生物或透明质酸衍生物结合的包含硫醇官能团的物质包括 聚环氧乙垸、聚环氧丙垸、烯丙基縮水甘油醚等，但不限于此。更优选 地，包含硫醇官能团的物质为聚环氧乙烷，可以控制壳聚糖衍生物或透明 质酸衍生物与聚环氧乙烷的比例，以获得用于控制细胞抗粘附的水凝胶。
具体地，通过包含硫醇官能团的聚环氧乙烷的硫醇基团与壳聚糖-丙烯 酸、壳聚糖-甲基丙烯酸、透明质酸-丙烯酸、透明质酸-甲基丙烯酸及其混 合物的丙烯酸和/或甲基丙烯酸官能团之间的反应来制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶(图4)和水凝胶微球。
所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、透明质酸-透明 质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水 凝胶和水凝胶微球可以用于各种应用，包括伤口愈合贴剂、整形手术材 料、美容材料或组织工程学支架。而且，所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水 凝胶、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶可以用作生物活性物质递送载体。由于已知聚环氧乙 烷、壳聚糖和透明质酸是具有生物相容性的物质，因此更优选它们在生物 活性物质递送载体中的应用。
本发明还提供了生物活性物质递送载体，所述生物活性物质递送载体 包含负载在所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙 烷和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球上的生物活性物质。
在用于本文时，术语"生物活性物质"指用于治疗、治愈、预防或诊 断疾病的物质，并且不限于具体物质或种类。所述生物活性分子包括有机 化合物、提取物、蛋白质、肽、PNA(肽核酸)、脂质、碳水化合物、甾体、
胞外基质物质、细胞等。而且，可以将目前本领域中使用的各种赋形剂如 稀释剂、控释剂、惰性油或粘合剂与所述生物活性物质混合。
在用于本文时，术语"生物活性物质递送载体"指为了体内递送而在 其上负载生物活性物质的系统。根据本发明，将生物活性物质负载在所述 壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水 凝胶微球、和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-蛋白质或壳聚糖-透明质酸-聚环 氧乙烷-肽水凝胶和水凝胶微球上，从而可以将其递送至体内。按照需要， 还可以使生物活性物质在预定的时间段内在预定的位置持续释放。这种控 释型载体的优点在于它们能够控制具有低生物利用度或高吸收性以至于过 快地从体内排出的药物的释放速率，从而可以长期保持血液内的期望药物 浓度。在所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷 水凝胶和水凝胶微球中，可以根据凝胶的物理强度和化学性质控制凝胶的 降解能力和生物活性物质的释放速率。
可以负载到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧 乙烷水凝胶和水凝胶微球上，从而被递送到体内的有机化合物包括常规 的抗生素、抗癌药、抗炎药，抗病毒剂、抗菌剂等。抗生素的具体实例包 括选自下列的抗生素四环素、二甲胺四环素、多西环素、氧氟沙星、左
氧氟沙星(revofloxacin)、环丙沙星、克拉霉素、红霉素、头孢克洛、头孢噻 肟、亚胺培南、青霉素、庆大霉素、链霉素、庄行霉素(bancomycin)或其衍 生物或混合物。抗癌药的具体实例包括甲氨蝶呤、卡铂、紫杉醇(taxol)、 顺铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷(etpocide)、紫杉醇(paclitaxel)、喜 树碱(camtotecin)、胞嘧啶、阿拉伯糖、及其衍生物和混合物。抗炎药的具 体实例包括选自下列的抗炎药吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、吡罗昔康、 氟比洛芬、双氯芬酸、及其衍生物和混合物。抗病毒剂的具体实例包括选 自下列的抗病毒剂阿昔洛韦、利巴韦林(robavin)、及其衍生物和混合物。 抗菌剂的具体实例包括选自下列的抗菌剂酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、 两性霉素-B、灰黄霉素(griceofUlvin)、及其衍生物和混合物。 可以负载到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧 乙垸水凝胶和水凝胶微球上，从而被递送到体内的蛋白质和肽包括用于治 疗和预防疾病的各种生物活性肽，例如激素、细胞因子、酶、抗体、生长 因子、转录控制因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体、细 胞表面抗原、及其衍生物和类似物。
蛋白质和肽的具体实例包括肝生长激素、生长激素释放激素、生长
激素释放肽、干扰因子和干扰因子受体(例如干扰因子-a、 -p和-y、 I型含水 干扰素受体等)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激 因子(GM-SCF)、胰高血糖素样肽(例如GLP-1)、 G-蛋白偶联受体、白介素 (例如白介素-l、 -2、 -3、 4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9等)、白介素受体(例如IL-1 受体、IL-4受体等)、酶(例如葡糖脑苷酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-半 乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶-a、半乳糖苷酶-P、 a-L-艾杜糖醛酸酶、丁酰胆碱 酯酶(butyrylcholine stearase)、 壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶(glutamate dicarboxylase)、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解 酶、中性肽链内切酶、髓过氧物酶等)、白介素结合蛋白和细胞因子结合蛋 白(例如IL-18bp、 TNF-结合蛋白等)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B-细胞因子、T-细胞因子、A蛋白、变态反应抑制因子、细胞凋亡糖蛋白、免 疫毒素、淋巴毒素(limphotoxin)、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长 因子、a-l抗胰蛋白酶、白蛋白、(x-乳白蛋白、阿朴脂蛋白-E、促红细胞生 成素、高糖链促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶 受体活化肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子
vin、血液因子ix、血液因子xm、纤溶酶原活化因子、纤维蛋白结合肽、
尿激酶(eurokinase)、链激酶、水蛭素、蛋白C、 C-反应蛋白、凝乳酶抑制 剂、胶原酶抑制剂(colagenase inhibitor)、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板源 生长因子、上皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管生成抑制因子 (angiostatin)、血管紧张素、骨形成生长因子、骨形成蛋白、降钙素、胰岛 素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途 径抑制剂、促卵泡激素、黄体激素、黄体激素释放激素、神经生长因子(例 如神经营养蛋白、睫状神经营养因子、轴突生成因子-l(axogenesis factor-
1)、脑利钠肽、神经胶质源神经营养因子、轴突生长导向因子(netrin)、嗜 中性粒细胞抑制因子、神经营养因子、微中子等)、副甲状腺激素、松弛 肽、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血 糖素(glucagone)、縮胆囊素(cholecystokinine)、胰多肽、胃泌素释放肽、促 肾上腺皮质激素释放因子(corticotropine-releasing factor)、促甲状腺激素、自 分泌运动因子(autotoxin)、乳铁蛋白、肌抑素、受体(例如TNFR(P75)、 TNFR(P55)、 IL-1受体、VEGF受体、B-细胞活化因子受体等)、受体拮抗剂 (例如IL1-Ra等)、细胞表面抗原(例如CD 2、 3、 4、 5、 7、 lla、 llb、 18、 19、 20、 23、 25、 33、 38、 40、 45、 69等)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗 体片段(例如scFv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fd等)、病毒源疫苗抗原等。
可以负载到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧 乙烷水凝胶和水凝胶微球上，从而被递送到体内的核酸包括DNA、 RNA、 寡核苷酸等。
可以负载到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球、透明 质酸-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶和水凝胶微球、壳聚糖-透明质酸-聚环氧 乙烷水凝胶和水凝胶微球上，从而被递送到体内的胞外基质物质包括胶 原、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、玻连蛋白等。可以用于本发明的细胞 包括成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、软骨细胞、骨 细胞、真皮细胞、Schwann细胞、干细胞等。
事实上，当在本发明水凝胶的表面上培养平滑肌细胞后，可以看到细 胞计数在3天内上升。而且，当使用所述水凝胶作为细胞递送载体时，观察 到负载到所述水凝胶上的细胞增殖和细胞计数的上升。此外，在约两周到 几个月后，所述水凝胶降解，所述细胞粘附到细胞培养瓶的表面上。这表 明通过将生物活性物质负载到本发明的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶 上，可能获得所述物质的稳定保持和活性。
而且，本发明提供了通过下列方法获得的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙 烷-肽水凝胶和水凝胶微球使所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球 中的壳聚糖衍生物和透明质酸衍生物与包含硫醇官能团的物质结合，所述
包含硫醇官能团的物质除聚环氧乙烷以外还包含含有半胱氨酸氨基酸的肽
(cysteine amino acid-containing peptide)或含有纟千连蛋白的蛋白质。所述壳 聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-肽水凝胶和水凝胶微球可以用作组织工程学支 架。"包含半胱氨酸氨基酸的肽"指具有能够诱导细胞粘附和/或细胞迁移 和增殖的氨基酸序列并具有用于与(甲基)丙烯酸壳聚糖/(甲基)丙烯酸透明质 酸/聚环氧乙烷进行交联的半胱氨酸氨基酸的肽(例如GSRGDSC)、包含具有 由酶如胶原酶或纤溶酶控制的生物降解能力的氨基酸序列(例如YKNR)和半 胱氨酸的肽、或具有不同于上述肽的功能的其它肽。
在用于本文时，术语"组织工程学支架"指包含壳聚糖-壳聚糖-聚环氧 乙烷-肽和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-肽的水凝胶和水凝胶微球，其通过 使具有诱导组织再生功能的肽与壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷、透明质酸-透 明质酸-聚环氧乙烷和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和水凝胶微球化 学结合而获得。所述肽指包含半胱氨酸作为氨基酸的寡肽或蛋白质，半胱 氨酸所含的硫醇官能团与(甲基)丙烯酸官能团反应并化学地交联，以形成壳 聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸-肽水凝胶、透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷-肽水 凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-肽水凝胶和水凝胶微球。所述肽包含 的氨基酸序列用于为细胞粘附、细胞增殖提供位点(例如RGD)，或为支架 发生酶降解以诱导组织再生提供位点(例如YKNR)。所述肽提供允许所述 水凝胶或凝胶中包含的细胞发生局灶接触或细胞粘附的位点。而且，支架 降解的位点诱导水凝胶降解，从而粘附到支架的细胞上随着支架降解而降 解，导致细胞迁移和增殖。最后，所述水凝胶降解并被除去，原来被水凝 胶占据的空间被由所述细胞和所述增殖细胞分泌的胞外基质形成的新的再 生组织取代。
可以用于所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸-肽水凝胶、透明质酸-透明质 酸-聚环氧乙垸-肽水凝胶和壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷-肽水凝胶的肽的具 体实例包括能够粘附细胞的寡肽如RGD、 RGDS、 REDV和YIGSR;包含 半胱氨酸的胞外基质物质如胶原、纤连蛋白、明胶、弹性蛋白、骨钙蛋 白、纤维蛋白原、纤调蛋白、生腱蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、骨粘连 蛋白、基底膜蛋白多糖、多功能蛋白聚糖、von Willebrand因子和玻连蛋 白；由特异性酶降解的有机化合物如YKNR等。在这里，RGE、 REDV、
YKNR等由氨基酸的单字母缩写表示。
此外，本发明提供了制备壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶的方法，所 述方法包括如下步骤(i)提供壳聚糖水溶液；(ii)使壳聚糖与包含丙烯酸官 能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(iii)使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官 能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；和(iv)在所述壳聚糖衍生物的混合 物与包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
此外，本发明提供了制备透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶的方 法，所述方法包括如下步骤(i)提供透明质酸水溶液；(ii)使透明质酸与包 含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(iii)使透明质酸与包 含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；和(iv)在所述透 明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
此外，本发明提供了制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶的方法， 所述方法包括如下步骤(i)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(ii)使壳 聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生 物；(Ui)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供 透明质酸衍生物；和(iv)在所述壳聚糖衍生物以及所述透明质酸衍生物和包 含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
在步骤(i)中，可以将壳聚糖和透明质酸溶于水或酸性溶液。
在步骤(H)和(iii)中，通过使用交联剂，可以使包含丙烯酸或甲基丙烯酸 的物质与壳聚糖或透明质酸交联。可以用于本发明的交联剂的具体实例包 括乙二醇、丙三醇、聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、双丙烯酰 胺、邻苯二甲酸二芳基酯、己二酸二芳基酯、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、聚 乙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、三丙三醇二縮水甘油醚、 三芳基胺、乙二醛、二乙基丙基乙基碳二亚胺盐酸盐、碳二亚胺(CDI)等。
在本发明的优选实施方案中，使用二乙基丙基乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)作为交联剂。可以在广阔的范围内控制壳聚糖:2-丙烯酰氨基乙醇 酸:EDC的摩尔比和透明质酸:己二酸二酰肼:丙烯酸:EDC的摩尔比。事实 上，在制备壳聚糖水凝胶时，可以以各种方式改变上述摩尔比，例如 1:4:4、 1:8:8或1:12:8，以形成水凝胶。
在步骤(iv)中，可以在必要时控制丙烯酸或甲基丙烯酸官能团与硫醇官
能团的比例。丙烯酸或甲基丙烯酸官能团与硫醇官能团的比例可以为4:1至 1:3。优选地，比例为3:1至1:2，更优选为l:l。
生成的水凝胶可以依照不同因素而具有不同水平的物理强度和化学性 质，所述因素包括用于制备水凝胶的壳聚糖和透明质酸的分子量、包含 丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的分子的具体类型、壳聚糖和透明质酸的浓度 和脱乙酰化程度、用于制备水凝胶的交联剂的具体类型和浓度、pH、或反 应混合物中丙烯酸或甲基丙烯酸官能团与硫醇官能团的比例。可以考虑所 有上述因素来制备期望的水凝胶。例如，可以根据壳聚糖:2-丙烯酰氨基乙 醇酸:EDC的摩尔比和与PEO结合的硫醇基团的数目改变凝胶的含水量。在 透明质酸的情况下，可以根据透明质酸:氨基丙基甲基丙烯酸:EDC的摩尔比 和与PEO结合的硫醇基团的数目控制由透明质酸形成的凝胶的性质。
更具体地，用于制备壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶的方法包括如 下步骤提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；使壳聚糖与包含丙烯酸的 物质交联，以提供壳聚糖衍生物；使透明质酸与包含甲基丙烯酸的物质交 联，以提供透明质酸衍生物；从所述壳聚糖衍生物和所述透明质酸衍生物 中除去未反应的包含丙烯酸和甲基丙烯酸的反应物；将所述壳聚糖衍生物 和所述透明质酸衍生物干燥；和在所述壳聚糖衍生物以及所述透明质酸衍 生物和包含硫醇官能团的物质之间形成共价键。
此外，本发明提供了制备生物活性物质递送载体的方法，所述方法包 括如下步骤(i)提供壳聚糖水溶液；(ii)使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物
质交联，以提供壳聚糖衍生物；(m)使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物
质交联，以提供壳聚糖衍生物；(iv)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物或 包含硫醇官能团的物质混合；和(V)在所述壳聚糖衍生物与所述包含硫醇官 能团的物质之间形成共价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
此外，本发明提供了制备生物活性物质递送载体的方法，所述方法包 括如下步骤(i)提供透明质酸水溶液；(ii)使透明质酸与包含丙烯酸官能团 的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(iii)使透明质酸与包含甲基丙烯酸官 能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(iv)将生物活性物质与所述透明 质酸衍生物或包含硫醇官能团的物质混合；和(v)在所述透明质酸衍生物与 所述包含硫醇官能团的物质之间形成共价键，同时在其上负载所述生物活
性物质。
此外，本发明提供了制备生物活性物质递送载体的方法，所述方法包
括如下步骤(i)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(ii)使壳聚糖与包含 丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(iii)使透明 质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生 物；(iv)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所述透明质酸衍生物混合， 或将其与包含硫醇官能团的物质混合；和(v)在所述壳聚糖衍生物以及所述 透明质酸衍生物和所述包含硫醇官能团的物质之间形成共价键，同时在其 上负载所述生物活性物质。
根据本发明，将生物活性物质负载到所述壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水 凝胶、所述透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶和所述壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙垸水凝胶上的步骤可以在制备所述凝胶的过程中进行或在制备所 述凝胶之后进行以供后续应用。然而，优选通过在制备所述凝胶的过程中 通过将生物活性物质负载到凝胶上来进行步骤(iv)，更具体地，通过将生物 活性物质掺入壳聚糖衍生物溶液、透明质酸衍生物溶液、或由步骤(ii)和(iii) 获得的壳聚糖衍生物与透明质酸衍生物的混合溶液中来进行步骤(iv)。将生 物活性物质与壳聚糖衍生物溶液、透明质酸衍生物溶液或包括溶于其中的 包含硫醇官能团的物质的溶液混合，从而所述物质可以与凝胶形成共价 键。
更具体地，制备作为生物活性物质递送载体的水凝胶的方法包括如下 步骤提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；使壳聚糖与包含丙烯酸的物 质交联，以提供壳聚糖衍生物；使透明质酸与包含甲基丙烯酸的物质交 联，以提供透明质酸衍生物；从所述壳聚糖衍生物和所述透明质酸衍生物 中除去未反应的包含丙烯酸和甲基丙烯酸的反应物；将所述壳聚糖衍生物 和所述透明质酸衍生物干燥；将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所述 透明质酸衍生物混合，或将其与包含硫醇官能团的物质混合；和在所述壳 聚糖衍生物以及所述透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间形成共
此外，本发明提供了制备作为生物活性物质递送载体的水凝胶微球的 方法，所述方法包括如下步骤(i)提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；
(ii)使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖 衍生物；(iii)使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以 提供透明质酸衍生物；(iv)将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所述透明 质酸衍生物混合，或将其与包含硫醇官能团的物质混合；(v)将所述壳聚糖 衍生物和所述透明质酸衍生物与包含硫醇官能团的物质混合，以提供混合 溶液，同时在其上负载生物活性物质；(vi)将所述混合溶液滴加到包含疏水 溶剂和表面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散于其中；和(vii)使分散 在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物、所述透明质酸衍生物和聚环氧乙烷形 成水凝胶微球并回收所述微球。
现在将详细参考本发明的优选实施方案。然而，下列实施例和比较例 仅是说明性的，本发明的范围不限于此。
<实施例^包含生物活性元素(bioactive dement)的壳聚糖甲基丙烯酸衍 生物水凝胶的制备
步骤l:将20 mL脱乙酰化程度为约85。/。的含水壳聚糖(5 10 KDa; Chitolife， Korea)与0.3 mL甲基丙烯酸混合，向其中添加5 mL EDC以进行反 应，同时搅拌反应混合物。在完成反应后，通过使用有机溶剂使所得产物 沉淀，冷冻干燥一天，以获得壳聚糖-甲基丙烯酸的第一个产物，其摩尔比 为1 (壳聚糖):4(2-羧乙基丙烯酸):4(EDCX参见图7-B)。
步骤2:将获自步骤l的壳聚糖-甲基丙烯酸溶于三乙醇胺，以提供O.l mL壳聚糖-甲基丙烯酸溶液。在独立的容器中，将具有六个硫醇官能团臂 (arm)的聚环氧乙烷聚合物溶于三乙醇胺，以提供O.l mL聚环氧乙烷溶 液。
步骤3:将上述两种溶液相互混合。此时，用裸眼可以观察到在24 30 小时内形成了壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例2>
除了用2-羧乙基丙烯酸代替甲基丙烯酸以外，按照与实施例l所述方式 相同的方式制备壳聚糖-2-羧乙基丙烯酸，通过NMR评价所得产物(参见图 7-A)。
<实施例3>
除了用2-丙烯酰氨基乙醇酸一水合物代替甲基丙烯酸以外，按照与实 施例l所述方式相同的方式制备壳聚糖-2-丙烯酰氨基乙醇酸。按照与实施例 1所述方式相同的方式，使壳聚糖-2-丙烯酰氨基乙醇酸与聚环氧乙烷反应。 在反应后，在2分钟内获得了壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
<实施例4>
除了用透明质酸(MW 10k 100k)代替含水壳聚糖并使用N-(3-氨基丙基) 甲基丙烯酰胺(APM)代替甲基丙烯酸以外，按照与实施例l所述方式相同的 方式制备透明质酸-N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺。使所得产物透明质酸-N-3-氨基丙基甲基丙烯酰胺与聚环氧乙烷反应，以在24小时内获得透明质酸 甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例5>
将获自实施例1的壳聚糖-甲基丙烯酸与获自实施例2的壳聚糖-2-羧乙基 丙烯酸以25%:75%的比例混合，按照与实施例l所述方式相同的方式使所得 混合溶液与聚环氧乙烷反应，以在2小时内获得壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基 丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例6>
将获自实施例l的壳聚糖-甲基丙烯酸与获自实施例2的壳聚糖-2-羧乙基 丙烯酸以50%:50%的比例混合，按照与实施例l所述方式相同的方式使所得 混合溶液与聚环氧乙垸反应，以在4小时内获得壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基 丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
<实施例7>
将获自实施例1的壳聚糖-甲基丙烯酸与获自实施例2的壳聚糖-2-羧乙基 丙烯酸以75%:25%的比例混合，按照与实施例l所述方式相同的方式使所得 混合溶液与聚环氧乙烷反应，以在5小时内获得壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基
丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例8>
将获自实施例3的壳聚糖-2-羧乙基丙烯酸与获自实施例4的透明质酸-:^-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺以75%:25%的比例混合，按照与实施例l所述方 式相同的方式使所得混合溶液与聚环氧乙烷反应，以在2小时内获得壳聚糖 丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例9>
将获自实施例3的壳聚糖-2-羧乙基丙烯酸与获自实施例4的透明质酸-N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺以50%:50%的比例混合，按照与实施例l所述方 式相同的方式使所得混合溶液与聚环氧乙垸反应，以在4小时内获得壳聚糖 丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例10>
将获自实施例3的壳聚糖-2-羧乙基丙烯酸与获自实施例4的透明质酸-N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺以25%:75%的比例混合，按照与实施例l所述方 式相同的方式使所得混合溶液与聚环氧乙烷反应，以在5小时内获得壳聚糖 丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
<实施例11>
将获自实施例l的壳聚糖-甲基丙烯酸与获自实施例2的壳聚糖-丙烯酸混 合。在混合上述壳聚糖衍生物时，还向其中添加包含溶于乙酸的胶原的溶 液(所述壳聚糖-(甲基)丙烯酸的重量的0.1重量％或0.3重量％)，从而获得包 含添加至其中的0.1%或0.3%胶原的壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环 氧乙烷水凝胶。
<实施例12>
在制备实施例1的水凝胶的步骤2中，将包含溶于乙酸的胶原的溶液(所 述壳聚糖-(甲基)丙烯酸的重量的0.1重量％或0.3重量％)进一步与所述溶液混
合，从而获得包含添加至其中的O. 1%或0.3%胶原的壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙 垸水凝胶或壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例13>
在制备实施例1的水凝胶的步骤2中，将包含溶于超纯水的纤连蛋白的 溶液(所述壳聚糖-(甲基)丙烯酸的重量的0.1重量％或0.3重量％)进一步与所 述溶液混合，从而获得包含添加至其中的0.1%或0.3%纤连蛋白的壳聚糖丙 烯酸-聚环氧乙烷水凝胶或壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例14>
在将获自实施例l的壳聚糖-甲基丙烯酸与获自实施例3的壳聚糖-丙烯酸 混合时，将包含溶于超纯水的纤连蛋白的溶液(所述壳聚糖-(甲基)丙烯酸的 重量的0.1重量％或0.3重量％)进一步与所述溶液混合，从而获得包含添加至 其中的O. 1%或0.3%纤连蛋白的壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶或壳聚糖甲 基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例15>
在制备实施例9的水凝胶时，将包含溶于超纯水的纤连蛋白的壳聚糖溶 液(所述壳聚糖-(甲基)丙烯酸的重量的0.3重量％)与所述透明质酸-甲基丙烯 酸溶液混合，从而获得包含添加至其中的0.3%纤连蛋白的壳聚糖丙烯酸-透 明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
<实施例16>
在制备水凝胶时，分别在1.5 mL微型锥形试管中提供5 mL或15 pL包含 溶于无菌蒸馏水的胶原的溶液(其量为获自实施例1和3的步骤2中获得的壳 聚糖-甲基丙烯酸和壳聚糖-丙烯酸的合并重量的0.1%或0.3%)以及包含5,000 个平滑肌细胞的IO piL细胞悬浮液。在独立的1.5 mL微型锥形试管中分别提 供300 ML包含硫醇基团的聚环氧乙烷-三乙醇胺溶液和300 nL混合壳聚糖-丙 烯酸和壳聚糖-甲基丙烯酸-三乙醇胺溶液。向胶原溶液中掺入平滑肌细胞悬 浮液，以提供细胞-胶原溶液，然后将其与聚环氧乙烷溶液混合。将所得细
胞-胶原-聚环氧乙垸溶液与壳聚糖-丙烯酸和壳聚糖-甲基丙烯酸溶液混合，
以提供包含细胞的壳聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷-胶原水凝胶。
<实施例17>
除了用纤连蛋白代替胶原以外，重复实施例16，以提供包含细胞的壳 聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷-纤连蛋白水凝胶。
<实施例18>
除了用透明质酸-甲基丙烯酸代替壳聚糖-甲基丙烯酸以外，重复实施例 16，以提供包含细胞的壳聚糖丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙垸-胶 原水凝胶。
<实施例19>
在制备实施例18的水凝胶的步骤中，将包含溶于三乙醇胺的纤连蛋白 而不是胶原的溶液(壳聚糖-丙烯酸和透明质酸-甲基丙烯酸的重量的0.3重量 %)与所述溶液混合，以提供包含添加至其中的纤连蛋白的壳聚糖丙烯酸-透 明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷-纤连蛋白水凝胶。
<实施例20>
在制备实施例18的水凝胶的步骤2中，将包含溶于三乙醇胺的 GG,GG肽而不是胶原的溶液(壳聚糖丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸的重量 的0.3重量％)与所述溶液混合，以提供包含半胱氨酸作为氨基酸的肽-壳聚糖 丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实施例21>
首先，用叔丁基保护己二酸二酰肼的一端，以形成叔丁基己二酸酰 肼，使所得产物与透明质酸化学结合，以提供透明质酸-己二酸酰肼。然 后，从透明质酸-己二酸酰肼中除去叔丁基，使所得产物与丙烯酸结合以提 供透明质酸-丙烯酸。然后，使透明质酸-丙烯酸与聚环氧乙垸反应，以提供 透明质酸丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。下面详细描述该过程。
歩骤l-保护己二酸二酰肼的一端:("将3.5 g己二酸二酰肼(MW 174 g/mol)溶于30 mL四氢呋喃/水(THF/H20)混合溶液中，以提供己二酸酰肼溶 液。(2)将2.4 g二碳酸二叔丁酯(BOC20)溶于四氢呋喃/水(THF/H20)混合溶 液。(3)将相当于二碳酸二叔丁酯的量的2.5倍的2.3 gNaHC03添加到二碳酸 二叔丁酯的溶液中。(4)将二碳酸二叔丁酯溶液和NaHC03溶液逐渐添加到己 二酸二酰肼溶液中以进行反应，将所得产物冷冻干燥。(5)将50mL纯水添 加到产物中以将其溶解，获得一端用叔丁基保护的己二酸酰肼叔丁基酰 肼。(6)除去两端均用叔丁基保护的己二酸酰肼，以获得纯的己二酸酰肼叔 丁基酰肼，然后将其冷冻干燥以获得粉末。
步骤2-制备一端受保护的透明质酸-己二酸酰肼化合物:(1)将0.68g(1.7 mmol)透明质酸和通过使用碳酸叔丁酯保护的己二酸叔丁基酰肼(MW-274， 6.8 mmol)溶于40 mL纯水中。(2)将0.9 g (6.8 mmol) 1-羟基苯并三唑水 合物(MW-135)和1.1 g EDC (MW=155， 6.8 mmol)溶于10 mL二甲亚砜和纯 水的混合溶液(l:l)中，将所得溶液添加到透明质酸溶液中以进行反应。(3) 将透明质酸溶液添加到500 mL乙醇中，以形成沉淀物，并分离沉淀物。(4) 将所得产物冷冻干燥2天，以获得叔丁基己二酸酰肼-透明质酸(参见图S-b)。
步骤3:胺保护基团的去保护:(1)将0.6 g (MW= 632 g/mo1， 0.95 mmol) 叔丁基己二酸酰肼-透明质酸溶于6 mL (10%)蒸馏水。(2)将盐酸/甲醇的混 合溶液(1:1)逐渐添加到叔丁基己二酸酰肼-透明质酸溶液中，在室温下反应 1 2小时。(3)用100mL乙醇洗涤所得产物并冷冻干燥以获得样品。
步骤4-制备透明质酸-己二酸-丙烯酸:(1)将0.6 g (MW-532 g/mol)透明 质酸-己二酸和0.3 g (MW=72 g/mol， 4 mmol)丙烯酸溶于40 mL蒸馏水。(2) 向其中添加0.7 g (MW=155) EDC以进行反应。(3)使所得产物沉淀并冷冻干 燥，以获得透明质酸-丙烯酸样品(参见图8-c)。
步骤5-制备透明质酸丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶:(l)将透明质酸-己二 酸-丙烯酸(下面也被称为透明质酸丙烯酸)溶于三乙醇胺缓冲液中，以提供 10% (w/v)透明质酸-丙烯酸溶液。(2)将具有六个硫醇官能团臂的聚环氧乙 烷溶于三乙醇胺缓冲液中，以提供20% (w/v)聚环氧乙烷溶液。(3)在混合上
述两种溶液后，在2 3分钟内开始形成水凝胶，从而获得透明的透明质酸 丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
<实施例22>
除了用获自实施例21的透明质酸-丙烯酸代替壳聚糖-2-羧乙基丙烯酸以 50:50的比例与实施例9的透明质酸-N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺混合以外， 重复实施例9，以提供混合溶液。然后，将混合溶液进一步与聚环氧乙烷溶 液混合，以在一小时内提供透明质酸丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙 烷水凝胶。
<实施例23>
将获自实施例21的透明质酸-丙烯酸与实施例l的壳聚糖-甲基丙烯酸以 50:50的比例混合，以提供混合溶液。然后将混合溶液进一步与聚环氧乙烷 溶液混合。结果可以看到在一小时内形成了透明质酸丙烯酸-壳聚糖甲基丙 烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
<实验例1>
通过NMR评价实施例l和3的壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶和壳 聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶以及壳聚糖样品。在评价后可以看到丙烯酸 和甲基丙烯酸与壳聚糖化学结合(参见图7)。
<实验例2>
将实验例1的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液与聚环氧乙烷溶液混合，通过使 用流变计评价所得混合物。在评价后，通过观察粘度和弹性变化可以看到 在1分钟内开始形成壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶(参见图9-a)。
<实验例3>
随着时间流逝，通过使用流变计评价实施例8的通过将包含75%壳聚糖-丙烯酸和25%透明质酸-氨基丙基甲基丙烯酸的混合溶液与聚环氧乙烷溶液 混合而形成的溶液。在评价后，可以看到在l分钟内开始形成壳聚糖丙烯
酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶(参见图9-b)。 <实验例4>
随着时间流逝，通过使用流变计评价实施例9的通过将包含50%壳聚糖-丙烯酸和50%透明质酸-氨基丙基甲基丙烯酸的混合溶液与聚环氧乙烷溶液 混合而形成的溶液。在评价后，可以看到在5分钟内开始形成壳聚糖丙烯 酸-聚环氧乙烷甲基丙烯酸水凝胶(参见图9-c)。
<实验例5>
随着时间流逝，通过使用流变计评价在实施例21中通过将100%透明质 酸丙烯酸与聚环氧乙烷溶液混合而形成的溶液。在评价后，可以看到在l分 钟内开始形成透明质酸丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶(参见图9-d)。
<实验例6>
以2,000和10,000细胞/cn^的浓度，将平滑肌细胞在获自实施例1步骤2的 壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶的表面上体外培养6小时和3天，通过 使用光学显微镜观察细胞粘附特性。然后，向其中添加细胞计数试剂盒-8 进行荧光检测，通过使用微板读数器评价细胞增殖特性。在评价后，观察 到光密度(OD)上升。这表明活细胞在水凝胶表面上增殖。
<实验例7>
在37'C、 5%(302的条件下，在细胞培养系统中，使用实施例4和实施例 8 10的100%透明质酸-甲基丙烯酸水凝胶、75%透明质酸-甲基丙烯酸/25% 壳聚糖丙烯酸的混合水凝胶、50%透明质酸-甲基丙烯酸/50%壳聚糖-丙烯酸 的混合水凝胶、和25%透明质酸-甲基丙烯酸/75%壳聚糖-丙烯酸的混合水凝 胶将平滑肌细胞培养6小时。观察每种水凝胶的细胞增殖和粘附特性。在观 察后，可以看到每种水凝胶显示出不同的细胞粘附特性(参见图ll)。
<实验例8>
在37。C、 5。/。C02的条件下，在具有聚苯乙烯细胞培养瓶的细胞培养系统中，使用实施例9的50%透明质酸-甲基丙烯酸/50%壳聚糖-丙烯酸的混合 水凝胶、实施例10的25%透明质酸-甲基丙烯酸/75%壳聚糖-丙烯酸的混合水 凝胶、和实施例3的100%壳聚糖-丙烯酸水凝胶将平滑肌细胞培养6小时。观 察每种水凝胶的细胞增殖和粘附特性。在观察后，可以看到每种水凝胶显 示出不同的细胞粘附特性(参见图ll)。
<实验例9> &
将实施例9的包含透明质酸甲基丙烯酸(50%)和壳聚糖丙烯酸(50%)的混 合溶液进一步与包含0.2重量％纤连蛋白的聚环氧乙烷溶液混合，以形成包 含纤连蛋白的透明质酸甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。在 37°C、 5。/。C02的条件下，在细胞培养系统中进行体外细胞培养，持续多至 一周的时间。然后，观察细胞增殖和粘附特性。在观察后，可以看到包含 纤连蛋白的水凝胶显示出改善的细胞粘附特性(图12-E)。
<实验例10>
将实施例9的包含透明质酸甲基丙烯酸(50%)和壳聚糖丙烯酸(50%)的混 合溶液进一步与包含0.2重量。/CG,GG肽的聚环氧乙烷溶液混合，以形 成包含GGEQDGG肽的透明质酸甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙垸水凝 胶。在37'C、 5%(:02的条件下，在细胞培养系统中进行体外细胞培养，持 续多至一周的时间。然后，观察细胞增殖和粘附特性。在观察后，可以看 到包含GGEQDGG肽的水凝胶显示出改善的细胞粘附特性(图12-F)。
<实验例11>
按照与实施例16所述方式相同的方式将细胞掺入壳聚糖甲基丙烯酸-壳 聚糖丙烯酸-聚环氧乙烷-胶原水凝胶中。在37。C、 5%(302的条件下，在细胞 培养系统中进行体外细胞培养，持续多至一周的时间。然后，观察细胞增 殖和粘附特性。在观察后，可以看到水凝胶显示出改善的细胞相容性。
<实验例12>
除了使用透明质酸甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶代替壳
聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶以外，按照与实验例6所述方式相同的 方式评价细胞粘附和增殖特性。
<实验例13>
通过NMR分析获自实施例21的透明质酸-己二酸酰肼叔丁基酰肼和透明 质酸-己二酸丙烯酸化合物。通过使用透明质酸作为参比化合物，通过每种 化合物的特征峰识别产物(参见图8-a、 8-b和8-c)。
<实验例14>
将通过将实施例21的透明质酸-丙烯酸(50%)与实施例4的透明质酸-甲基 丙烯酸(50%)混合而形成的混合物以1:1的比例进一步与聚环氧乙垸溶液混 合，以提供混合溶液。然后，将lmL混合溶液引入20mL注射器，通过使用 注射器泵逐渐滴加到80mL二氯甲烷溶剂中。同时，通过使用磁力搅拌器以 3,500 rpm搅拌透明质酸-聚环氧乙烷溶液。然后，向其中逐渐添加表面活性 剂以进行反应，通过使用漏斗滤除所得产物，然后冷冻干燥。将经干燥的 样品在水溶液中水合，然后通过使用光学显微镜(图13-A)和电子显微镜(图 13-B)观察。在观察后，可以看到形成了尺寸为150 200拜的微球。
工业应用性
从前面可以看到，本发明提供了具有不同的壳聚糖/透明质酸比例的包 含药物/细胞的水凝胶。所述水凝胶可以用于再生组织工程学的人工器官、 制备用于治疗烧伤的包扎材料(dressing material)或美容包扎材料、或用于提 供药物递送载体。在这些应用中，所述水凝胶可以随着水凝胶的生物降解 而实现有效的药物递送并刺激组织再生。例如，当将包含壳聚糖-丙烯酸和 透明质酸-甲基丙烯酸的混合溶液与包含硫醇基团的聚环氧乙烷溶液一起喷 洒到烧伤或伤口位置上时，可以立即或在受控时间内形成水凝胶，从而可 以治疗烧伤或伤口位置。在变体中，将细胞掺入聚环氧乙烷溶液中，将所 述溶液与壳聚糖-丙烯酸、壳聚糖-甲基丙烯酸或其混合物、或透明质酸-丙 烯酸、透明质酸-甲基丙烯酸或其混合物混合。然后，通过使用注射器喷洒 所得溶液。本发明的水凝胶可以使壳聚糖和透明质酸的独有特性最大化。
同时，通过控制甲基丙烯酸/丙烯酸的比例，还可以在期望的时间内获得具 有多种物理性质的水凝胶。所述水凝胶可以用于组织工程学支架，所述支 架可以覆盖具有复杂形状的伤口位置的组织。而且，可以将生物活性物质 而不是细胞掺入所述水凝胶，从而可以将水凝胶用作能够进行组织再生或 伤口愈合的药物的载体。由于可以简单地通过混合两种溶液而在预定时间 内形成水凝胶，因此可以以分别包含一种溶液的两个独立喷雾容器的形式 提供所述水凝胶。在同时喷洒溶液时将溶液混合以形成水凝胶。通过这种 方式，可以实现对伤口位置的治疗。由于水凝胶具有优秀的生物相容性， 它还可以用作整形手术的填料。在另一个变体中，通过在制备壳聚糖-透明 质酸-聚环氧乙烷水凝胶时提高聚环氧乙烷的比例，所述水凝胶可以用作细 胞/组织粘附屏障，以防止细胞在手术操作后粘附到组织上。
尽管为了说明的目的已经描述了本发明的几个优选实施方案，但本领 域技术人员将理解，在不背离由所附权利要求所公开的本发明范围和精神 的情况下可能进行各种修改、添加和替代。
权利要求
1.基于壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷的水凝胶，其特征在于其是通过包含与包含丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖丙烯酸衍生物以及与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖甲基丙烯酸衍生物的混合物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖丙烯酸-壳聚糖甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
2. 基于透明质酸丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷的水凝胶，其 特征在于其是通过包含与包含丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸丙烯酸 衍生物以及与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸甲基丙烯酸衍 生物的混合物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的透明质酸 丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
3. 基于壳聚糖丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷的水凝胶，其特 征在于其是通过包含与包含丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖丙烯酸衍生 物以及与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸甲基丙烯酸衍生物 的混合物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷水凝胶。
4. 基于壳聚糖甲基丙烯酸-透明质酸丙烯酸-聚环氧乙垸的水凝胶，其特 征在于其是通过包含与包含丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸丙烯酸衍 生物以及与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖甲基丙烯酸衍生物 的混合物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖甲基丙 烯酸-透明质酸丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶。
5. 如权利要求l至4之一所述的基于壳聚糖-聚环氧乙垸、基于透明质酸-聚环氧乙烷、或基于壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷的水凝胶，所述水凝胶作 为微球提供。
6. 如权利要求l至5之一所述的基于壳聚糖(甲基)丙烯酸-聚环氧乙垸、 基于透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙烷、或基于壳聚糖(甲基)丙烯酸-透明 质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙烷的水凝胶，其中所述包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质选自丙烯酸、甲基丙烯酸、己二酸酰肼二酰胺丙烯酸、 丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烷基-(甲基)丙烯酰胺、N-单-(甲基)丙烯酰胺、 N,N-二-C广C4垸基-(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸N-丁基酯、(甲基)丙烯酸 甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯、(甲基)丙烯酸环己酯、 丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、 丙烯酸羟丁酯、N-(2-羟乙基)丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N-丁氧基甲基丙 烯酰胺、N-甲氧基甲基丙烯酰胺、N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰 氨基乙醇酸和2-羧乙基丙烯酸。
7. 如权利要求6所述的基于透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙垸的水凝 胶，其中所述包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质选自丙烯酰胺、甲 基丙烯酰胺、烯丙基胺、己二酸酰肼酰肼酰胺丙烯酸(adipic acid hydrazide hydrazide amide acrylate)、禾卩氨基丙基甲基丙烯酸。
8. 如权利要求l至7中之一所述的基于壳聚糖(甲基)丙烯酸-聚环氧乙 烷、基于壳聚糖(甲基)丙烯酸-透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙垸、或基于 透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙烷的水凝胶，其中所述包含硫醇官能团的 物质除聚环氧乙垸以外还是包含半胱氨酸的肽或蛋白质。
9. 如权利要求l至6之一所述的基于壳聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚 环氧乙烷、基于透明质酸甲基丙烯酸-透明质酸丙烯酸-聚环氧乙烷、或基于 壳聚糖(甲基)丙烯酸-透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙垸的水凝胶，其用于 诱导组织再生。
10. 生物活性物质递送载体，其包含负载在如权利要求9定义的水凝胶 上的生物活性物质。
11. 如权利要求10所述的生物活性物质递送载体，其中所述生物活性物 质选自有机化合物、提取物、蛋白质、肽、核酸、胞外基质物质、细胞 和无机化合物。
12. 如权利要求ll所述的生物活性物质递送载体，其中所述有机化合物 选自抗生素、抗癌药、抗炎药，抗病毒剂、抗菌剂和激素。
13. 如权利要求ll所述的生物活性物质递送载体，其中所述蛋白质选 自激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录控制因子、血液因子、 疫苗、结构蛋白、配体蛋白、受体、细胞表面抗原和受体拮抗剂。
14. 如权利要求ll所述的生物活性物质递送载体，其中所述胞外基质物质选自胶原、纤连蛋白、明胶、弹性蛋白、骨钙蛋白、纤维蛋白原、纤 调蛋白、生腱蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、基底膜蛋白多糖、多功能蛋白聚糖、vonWillebrand因子、纤维蛋白和玻连蛋白。
15. 如权利要求ll所述的生物活性物质递送载体，其中所述细胞选自 成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、骨细胞、真皮细 胞、软骨细胞、Schwann细胞和干细胞。
16. 如权利要求ll所述的生物活性物质递送载体，其中所述无机化合物 选自羟基磷灰石颗粒、磷酸三钙和羟基磷灰石-磷酸三钙的混合物，以及 包覆有蛋白质的上述无机化合物。
17. 制备如权利要求l所定义的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙垸水凝胶的方 法，所述方法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液；(b) 使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖-丙烯酸衍 生物；(c) 使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖-甲基 丙烯酸衍生物；和(d) 在所述壳聚糖衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共
18. 制备如权利要求2所定义的透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶的 方法，所述方法包括如下步骤(a) 提供透明质酸水溶液；(b) 使透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸-丙烯 酸衍生物；(c) 使透明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸- 甲基丙烯酸衍生物；和(d)在所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成 共价键。
19. 制备如权利要求3或4所定义的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶 的方法，所述方法包括如下步骤.-(a) 提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(b) 使壳聚糖与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍 生物；(c) 使透明质酸与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质 酸衍生物；和(d) 在所述壳聚糖衍生物与所述透明质酸衍生物的混合物和包含硫醇官 能团的物质之间形成共价键。
20. 制备如权利要求10所定义的生物活性物质递送载体的方法，所述方 法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液；(b) 使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖-丙烯酸衍 生物；(c) 使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖-甲基 丙烯酸衍生物；(d) 将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物或包含硫醇官能团的物质混 合；和(e) 在所述壳聚糖衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成共 价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
21. 制备如权利要求10所定义的生物活性物质递送载体的方法，所述方 法包括如下步骤(a) 提供透明质酸水溶液；(b) 使透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸-丙烯 酸衍生物；(c) 使透明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸- 甲基丙烯酸衍生物；(d) 将生物活性物质与所述透明质酸衍生物或包含硫醇官能团的物质混 合；和(e) 在所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质之间形成 共价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
22. 制备如权利要求10所定义的生物活性物质递送载体的方法，所述方 法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(b) 使壳聚糖与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍 生物；(c) 使透明质酸与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质 酸衍生物；(d) 将生物活性物质与所述壳聚糖衍生物和所述透明质酸衍生物混合， 或将其与包含硫醇官能团的物质混合；和(e) 在所述壳聚糖衍生物以及所述透明质酸衍生物与包含硫醇官能团的 物质之间形成共价键，同时在其上负载所述生物活性物质。
23. 制备壳聚糖甲基丙烯酸-壳聚糖丙烯酸-聚环氧乙垸微球的方法，所 述方法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液；(b) 使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(c) 使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖衍生物；(d) 将所述壳聚糖衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质混合以提供 混合溶液；(e) 将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将 所述混合溶液分散于其中；和(f) 使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物和聚环氧乙烷形成水凝胶 微球并回收所述微球。
24. 制备透明质酸丙烯酸-透明质酸甲基丙烯酸-聚环氧乙烷微球的方 法，所述方法包括如下步骤(a) 提供透明质酸水溶液；(b) 使透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(c) 使透明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供透明质酸衍生物；(d) 将所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官能团的物质混合以提 供混合溶液；(e) 将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将 所述混合溶液分散于其中；和(f) 使分散在所述溶液中的所述透明质酸衍生物和聚环氧乙烷形成水凝 胶微球并回收所述微球。
25. 制备壳聚銜甲基)丙烯酸-透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙烷微球的 方法，所述方法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液；(b) 使壳聚糖与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳 聚糖衍生物；(c) 使透明质酸与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供 透明质酸衍生物；(d) 将所述壳聚糖衍生物和所述透明质酸衍生物的混合物与包含硫醇官 能团的物质混合以提供混合溶液；(e) 将所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表面活性剂的溶液中，并将 所述混合溶液分散于其中；和(f) 使分散在所述溶液中的所述壳聚糖衍生物、所述透明质酸衍生物和 聚环氧乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
26. 制备包含生物活性物质的壳聚糖(甲基)丙烯酸-聚环氧乙烷微球的方 法，所述方法包括如下步骤(a) 提供壳聚糖水溶液；(b) 使壳聚糖与包含丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖丙烯酸衍生物；(c) 使壳聚糖与包含甲基丙烯酸官能团的物质交联，以提供壳聚糖甲基 丙烯酸衍生物；(d) 将生物活性物质掺入所述壳聚糖(甲基)丙烯酸衍生物的混合物或包 含硫醇官能团的物质中，并将所述壳聚糖(甲基)丙烯酸衍生物与所述包含 硫醇官能团的物质混合，以提供包含所述生物活性物质的混合溶液；(e) 将包含所述生物活性物质的所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表 面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散在其中；和(f) 使分散在所述溶液中的所述壳聚糖(甲基)丙烯酸衍生物和聚环氧乙 烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
27. 制备包含生物活性物质的透明质酸(甲基)丙烯酸-聚环氧乙垸微球的 方法，所述方法包括如下步骤(a) 提供透明质酸水溶液；(b) 使透明质酸与包含丙烯酸官能团的物质反应，以提供透明质酸丙烯酸衍生物；(c) 使透明质酸与包含甲基丙烯酸官能团的物质反应，以提供透明质酸 甲基丙烯酸衍生物；(d) 将生物活性物质掺入所述透明质酸(甲基)丙烯酸衍生物的混合物或 包含硫醇官能团的物质中，并将所述透明质酸衍生物与所述包含硫醇官能 团的物质混合，以提供包含所述生物活性物质的混合溶液；(e) 将包含所述生物活性物质的所述混合溶液滴加到包含疏水溶剂和表 面活性剂的溶液中，并将所述混合溶液分散在其中；和(f) 使分散在所述溶液中的所述透明质酸(甲基)丙烯酸衍生物和聚环氧 乙烷形成水凝胶微球并回收所述微球。
28. 制备透明质酸丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶的方法，所述方法包括如 下步骤-(a) 保护二酰肼的一端；(b) 形成一端受保护的透明质酸-酰肼叔丁基酰肼化合物；(c) 从所述透明质酸-酰肼叔丁基酰肼中除去保护胺的叔丁基，以提供透明质酸酰肼；(d) 由透明质酸-酰肼形成透明质酸-丙烯酸；禾PI(e) 使透明质酸-丙烯酸与聚环氧乙垸反应以提供透明质酸丙烯酸-聚环 氧乙烷水凝胶。
29. 如权利要求28所述的制备透明质酸丙烯酸-聚环氧乙垸水凝胶的方 法，其中通过使二碳酸二叔丁酯与选自下列的化合物化学结合来进行保护 二酰肼一端的步骤己二酸二酰肼、草酸二酰肼、草酰二酰肼、琥珀酸二 酰肼、戊二酸二酰肼和乙基丙二酸二酰肼。
30. 透明质酸(甲基)丙烯酸化合物，所述化合物通过如下方法获得使 如权利要求28所定义的胺被保护的化合物与透明质酸反应，并将从中除去 叔丁基的透明质酸酰肼与(甲基)丙烯酸化合物结合。
全文摘要
本发明公开了通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖-壳聚糖-聚环氧乙烷水凝胶及其水凝胶微球；通过与包含丙烯酸或甲基丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的透明质酸-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶及其水凝胶微球；和通过与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联的壳聚糖衍生物以及与包含(甲基)丙烯酸官能团的物质交联的透明质酸衍生物和包含硫醇官能团的物质之间的共价结合而形成的壳聚糖-透明质酸-聚环氧乙烷水凝胶及其水凝胶微球。
文档编号C08G65/26GK101351490SQ200680050339
公开日2009年1月21日 申请日期2006年8月28日 优先权日2006年1月19日
发明者卢仁燮, 卿 宣, 朴勇渡, 李揆伯, 金建佑, 黄淳正 申请人:首尔产业大学校算学协力团