专利名称：pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物及其制备方法
技术领域：
本发明属生物医用高分子材料领域，具体涉及一种生物可降解的pH/温度双重响应性的双亲水性嵌段共聚物及其制备方法。
背景技术：
双亲水性嵌段共聚物(DHBCs)是一类新型的两亲性聚合物，包含两个具有不同化学性质的水溶性链段。在溶液中，DHBCs分别表现为普通的聚合物和聚电解质，根本没有表现出两亲性聚合物的性质。但是，温度、离子强度和pH值的变化以及络合作用可以导致其中一个亲水链段转变为疏水链段，从而转变为两亲性聚合物。这类新型的嵌段聚合物可以根据特定的用途设计合成，使之有可能在众多领域得到应用，例如药物输送、基因治疗、活性酶的包埋、矿化模板和结晶生长调节剂、合成金属溶胶的纳米反应器、脱盐膜以及两种互不相溶的聚合物的水包油乳液聚合，等等。
结构精致的双亲水性嵌段共聚物可以通过各种活性聚合方法合成。其中包括活性阴离子聚合、活性阳离子聚合、基团转移自由基聚合(GTP)、原子转移自由基聚合(ATRP)、氮氧稳定自由基聚合(NMP)、可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)以及氧阴离子引发的聚合。
当DHBCs含有一个具有低临界共溶温度(LCST)的链段时，改变水溶液的温度，共聚物形成可逆胶束。由于临界温度高于室温，这类聚合物在加热时变得不溶解。这些聚合物包括聚甲基乙烯基醚(PMVE)、聚N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二异丙基氨基)乙酯(PDPAEMA)和聚甲基丙烯酸-2-(N-吗啉)乙酯(PMEMA)等等。(Bütün V.；Armes S.P.；Billingham N.C..Synthesis andaqueous solution properties of near-monodisperse tertiary aminemethacrylate homopolymers and diblock copolymers.Polymer，2001，425993-6008.) 由酸性与碱性的链段组成的DHBCs中，改变溶液的pH值，当酸性的链段完全质子化，同时碱性的链段完全脱质子时形成胶束。此时酸性的链段亲水而碱性的链段疏水。这类共聚物由非离子和离子链段、或具有不同pKa的酸性和碱性的链段组成。
现有技术中，关于pH响应性或温度响应性的双亲水性嵌段共聚物主要有 (1)聚环氧乙烷和聚-2-乙烯基吡啶嵌段共聚物(PEO-b-P2VP)(参见Martin T.J.；Procházka K.；Munk P.；Webber S.E..pH-Dependentmicellization of poly(2-vinylpyridine)-block-poly(ethylene oxide).Macromolecules，1996，296071-6073)； (2)PDMAEMA-b-PDEAEMA嵌段共聚物(参见Bütün V.；Bennett C.E.；Vamvakaki M.；Lowe A.B.；Billingham N.C.；Armes S.P..Selectivebetainisation of tertiary amine methacrylate block copolymers.J.Mater.Chem.，1997，71693-1695.；Webber G.B.；Wanless E.J.；Bütün V.；ArmesS.P.；Biggs S..Self-organized monolayer films of stimulus-responsivemicelles.Nano Lett.，2002，21307-1313.)； (3)PEO-b-PDEAEMA嵌段共聚物(参见Lee A.S.；Bütün V.；VamvakakiM.；Armes S.P.；Pople J.A.；Gast A.P..Structure of pH-dependent blockcopolymer micellesCharge and ionic strength dependence.Macromolecules，2002，358540-8551.)； (4)聚-4-乙烯基苯甲酸钠(PNaVBA)和聚甲基丙烯酸低聚环氧乙烷酯(POEGMA)的嵌段共聚物(参见Wang X.S.；Jackson R.A.；Armes S.P..Facile synthesis of acidic copolymers via atom transfer radicalpolymerization in aqueous media at ambient temperature.Macromolecules，2000，33255-257.)； (5)聚环氧乙烷和聚甲基丙烯酸羟基乙酯形成的嵌段共聚物(PEO-b-PHEMA)以及进一步与丁二酸酐的反应产物(PEO-b-PSEMA)，形成pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物(参见Bories-Azeau X.；Mérian T.；Weaver J.V.M.；Armes S.P.；van den Haak H.J.W..Synthesis ofnear-monodisperse acidic homopolymers and block copolymers fromhydroxylated methacrylic copolymers using succinic anhydride under mildconditions.Macromolecules，2004，378903-8910.)； (6)4-乙烯基苯甲酸与DEAEMA形成的嵌段共聚物(PVBA-b-PDEAEMA)(参见Liu S.Y.；Armes S.P..Polymeric surfactants for the new millenniumA pH-responsive，zwitterionic，schizophrenic diblock copolymer.Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41(8)1413-1416.)； (7)甲基丙烯酸(MAA)与DEAEMA 形成的嵌段共聚物(PMAA-b-PDEAEMA)(参见Dai S.；Ravi P.；Tam K.C.；Mao B.W.；GanL.H..Novel pH-responsive amphiphilic diblock copolymers with reversiblemicellization properties.Langmuir，2003，195175-5177.)； (8)2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱(MPC)与DMAEMA、DEAEMA、DPAEMA等单体形成的具有pH响应性的双亲水性嵌段共聚物PMPC-b-PDMAEMA、PMPC-b-PDEAEMA、PMPC-b-PDPAEMA。(参见Ma Y.；Tang Y.Q.；Billingham N.C.；Armes S.P.；Lewis A.L.；Lloyd A.W.Salvage J.P..Well-defined biocompatible block copolymers via atom transferradical polymerization of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine inprotic media.Macromolecules，2003，363475-3484.)； 近年来的研究表明，聚磷酸酯(polyphosphoesters)是一类具有优异生物降解性能的聚合物，由于其主链上含有五价的磷原子，因此，相比于其它常用的生物可降解的聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)等，聚磷酸酯的侧链更容易被功能化，可以修饰上很多功能基团或是药物分子，得到侧链功能化的聚磷酸酯；此外，值得注意的是，聚乳酸、聚己内酯等聚酯降解后有CO2生成，它们溶于水会使生物体内局部的pH值降低，从而会对生物体产生一系列的副作用，而聚磷酸酯的降解产物不会产生这样的副作用。
众多的优点使得聚磷酸酯的研究成为生物降解材料中的一个热点，但直到最近，日本关西大学的Iwasaki教授课题组发表在Macromolecules 40，8136-8138(2007)上的文章才首次报道了聚磷酸酯的温度敏感特性，并通过控制聚磷酸酯的侧链官能团及聚合物组成，可以很容易地调节聚磷酸酯的温度响应性质，即低临界溶解温度(LCST)，且更为关键的是这种温度敏感性质是可逆的。该文的报道表明，聚磷酸酯有望成为丙烯酰胺类聚合物的替代物，在智能型生物医用材料领域将大有作为。
目前，已有少数几篇文献报道了聚磷酸酯嵌段聚合物的合成及应用，例如Iwasaki，Y.；Akiyoshi，K.等人发表在Biomacromolecules 71433-1438(2006)的文章，Wen，J.；Kim，G.J.A.；Leong，K.W.等人发表在Journal ofControlled Release 9239-48(2003)的文章，Chen，D.P.；Wang，J.等人发表在Macromolecules 39473-475(2006)上的文章，Yuan，Y.Y.；Wang，Y.C.；Du，J.Z.；Wang，J.等人发表在Macromolecules 418620-8625(2008)的文章。然而，文献中已报道的嵌段共聚物均是两亲性的(既包含亲水链段，也包含疏水链段)。
王均等人申请的中国发明专利，即申请号为200710198478.X的中国发明专利申请公开文件，公开了一种聚磷酸酯与聚己内酯形成的三嵌段共聚物及其纳米粒子。本发明人之前申请的中国专利也公开了制备温度/pH响应性聚磷酸酯水凝胶的方法，即申请号为200810022216.2的中国发明专利申请公开文件，公开了一种生物可降解的温度/pH双重响应性水凝胶及其制备方法，采用开环聚合制备聚磷酸酯分子链双末端带功能基团C＝C的大分子单体，作为交联剂，与pH响应性单体进一步聚合，形成水凝胶。
据我们的调研所知，至今还没有文献或专利报道基于可生物降解的聚磷酸酯与pH响应性聚合物链接，形成pH/温度响应性聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物。
发明内容
本发明的目的在于公开一种具有良好生物相容性和生物降解性的pH/温度响应性聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物及其制备方法。
本发明的总体构思是首先以开环聚合反应形成末端含功能基团的聚磷酸酯链段，作为原子转移自由基聚合(ATRP)体系的大分子引发剂，然后与水溶性单体发生ATRP聚合，获得含聚磷酸酯链段和pH响应的水溶性链段的嵌段共聚物；也可以利用大分子引发剂与水溶性单体的前体先聚合再进一步水解或修饰，获得含聚磷酸酯链段和pH响应的水溶性链段的嵌段共聚物。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物，所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物的化学结构式如通式(1)或通式(2)所示
式中，w为20～100，y为20～200，z为20～200；X为溴或氯； R1基团选自乙基、异丙基、辛基、十二烷基或者聚环氧乙烷基中的一种；所述聚环氧乙烷基的化学结构式为
其中n为2～10； R2基团选自 氢(H)、
或
中的一种； R3基团选自
或
中的一种； R4基团选自
中的一种。
上述技术方案中，所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物的数均分子量范围是2000～50000g·mol-1。
上述技术方案中，所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物在结构上含聚磷酸酯链段和聚离子电解质链段，因此具有pH和温度双重响应性，可作为基因输送载体或药物缓释载体等生物材料；由聚磷酸酯链段与聚阴离子电解质链段组成的双亲水性嵌段共聚物，可以作为药物输送载体、纳米反应器、乳化剂或生物矿化模板等使用。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的分子链一端含羟基，另一端含溴或氯取代基，所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的化学结构式为
制备上述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的方法包括以下步骤 (1)制备环状含磷单体以R1-OH与
反应合成具有R1侧链取代基团的环状含磷单体
其中，R1基团选自乙基、异丙基、辛基、十二烷基或者聚环氧乙烷基中的一种；所述聚环氧乙烷基的化学结构式为
其中n为2～10； (2)制备聚磷酸酯大分子ATRP引发剂利用带有端羟基功能基团的含溴或氯有机化合物HO-R4-X，在催化剂辛酸亚锡的存在下对环状含磷单体
进行开环聚合，得到分子链末端含溴或氯取代基的聚磷酸酯大分子ATRP引发剂； 其中，HO-R4-X选自
中的一种；其中，X选自溴或氯。
利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂与pH敏感单体进行ATRP反应，或者与pH敏感单体的前体进行ATRP反应后进一步水解或修饰，可以得到相应的pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物。按照单体的不同可以分为以下三种情况 (1)当以pH敏感单体为反应物时，pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，包括以下具体步骤 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与pH敏感的单体进行溶液ATRP反应，获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物。
上述技术方案中，所述pH敏感的单体为具有pH响应性的水溶性单体，选自甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二异丙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯、2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶中的一种。
(2)当以甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯为反应物时，pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，包括以下具体步骤 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯单体进行溶液ATRP反应；聚合以后在二氯甲烷和三氟乙酸存在下水解，分别成为聚甲基丙烯酸、或聚4-乙烯基苯甲酸链段；获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物。
(3)当以甲基丙烯酸-2-羟基乙酯为反应物时，pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，包括以下具体步骤 利用上述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与甲基丙烯酸-2-羟基乙酯单体进行溶液ATRP反应；聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯链段中侧基的羟基再与丁二酸酐反应，生成侧链含羧基的聚合物链段，即可获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物。
上述三种情况中，单体[M]与ATRP引发剂[I]的摩尔比为[M]∶[I]＝10∶1～200∶1；ATRP引发剂[I]与催化剂[Cat]的摩尔比为[I]∶[Cat]＝0.5∶1～1∶2。
上述技术方案中，所述ATRP反应催化剂选自氯化亚铜(CuCl)或溴化亚铜(CuBr)中的一种，用量为所用单体总质量的1.0％～7.5％。
上述技术方案中，ATRP反应的催化剂配体为含氮类有机化合物，例如联吡啶(bpy)、五甲基三亚乙基三胺(PMDETA)、四甲基乙二胺(TMEDA)或六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)中的一种。
上述技术方案中，聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二异丙基氨基)乙酯(PDPAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯(PtBAEMA)属于阳离子型链段；而2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶属阴离子型单体；甲基丙烯酸叔丁酯为甲基丙烯酸的单体前体，4-乙烯基苯甲酸丁酯为4-乙烯基苯甲酸的单体前体，对应的聚合物链段属聚阴离子电解质；并且，上述聚合物链段具有良好生物相容性。
进一步的技术方案中，反应完成后进行提纯处理，所述提纯处理包括以下步骤 (1)反应完成后，加入四氢呋喃将反应产物稀释(四氢呋喃体积为反应体系体积的4～10倍)，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止； (2)待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐； (3)旋转蒸发使溶液浓缩，再将浓缩液滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物； (4)最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即所述pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物。
由于上述技术方案的运用，本发明相对于现有技术具有如下特点 1.本发明采用了生物降解性能良好的温敏性聚磷酸酯作为双亲水性嵌段共聚物的一部分，采用具有生物相容性和pH敏感性的化合物为单体，或采用聚合后经水解反应可形成pH敏感性聚合物链段的单体，通过原子转移自由基聚合(ATRP)，获得双亲水性嵌段共聚物，同时具有pH/温度双重敏感性和生物可降解性。
2.本发明公开的pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物形成胶束的行为和作为基因载体的功能，可以通过控制聚磷酸酯链段与pH响应性聚合物链段的比例来调节。
3.本发明公开的pH/温度响应性聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物，有优异的温度/pH双重响应性、生物相容性、生物可降解性，是一类新型的人工合成的高分子胶束材料，其在生物医学和其它领域具有广泛的用途，例如可以用作药物缓释载体或基因载体等生物医用材料及纳米反应器、乳化剂或生物矿化模板等。
图1为实施例一中开环聚合引发剂溴代异丁酸-2-羟基乙酯(HEBI)的核磁共振氢谱(1H NMR)谱图，溶剂为氘代氯仿(CDCl3)； 图2为实施例一中聚磷酸酯大分子引发剂PEEP25-Br的核磁共振氢谱(1HNMR)谱图，溶剂为CDCl3； 图3为实施例三中含聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的核磁共振表征，其中(A)1H NMR谱图、(B)13C NMR谱图、(C)31P NMR谱图，溶剂均为CDCl3； 图4(A)为实施例一中聚磷酸酯大分子引发剂PEEP25-Br的红外光谱谱图； 图4(B)为实施例三中PEEP21-b-PDMAEMA25嵌段共聚物的红外光谱谱图； 图5为实施例三中双亲水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25在不同pH水溶液中自组装的透射电镜照片； 图6为实施例三中双亲水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25水溶液透光率随温度的可逆变化曲线； 图7为实施例中双亲水性嵌段共聚物用作DNA载体时的凝胶阻滞电泳测试结果(N/P＝6∶1)； 图8(A)为实施例中裸质粒DNA(Plasmid pUC 18 DNA)粒子透射电子显微镜(TEM)照片； 图8(B)为实施例中PEEP-b-PDMAEMA/DNA复合物粒子的TEM照片，pH＝7.4。
具体实施例方式 下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，但实施例不以任何方式限制本发明 具有各种分子量的聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物主要以下列方法合成首先以开环聚合反应形成末端含功能基团的聚磷酸酯链段，以此作为下一步原子转移自由基聚合(ATRP)体系的大分子引发剂，然后与水溶性单体发生ATRP反应，(也可以利用水溶性单体的前体，先聚合再经聚合物水解反应)，获得含聚磷酸酯链段和pH响应的水溶性聚合物链段的双亲水性嵌段共聚物。
实施例一聚磷酸酯大分子引发剂PEEP25-Br的合成方法 (1)环状磷酸酯单体2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)的制备 首先通过三氯化磷(PCl3)与乙二醇反应合成2-氯-2-氧代-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(COP)，然后将COP与乙醇反应，获得2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)，具体的合成方法如下 在装有磁力搅拌子，滴液漏斗，球型冷凝管，干燥管及尾气处理装置的100mL三颈烧瓶中，加入无水二氯甲烷(CH2Cl2，50mL)和新蒸PCl3(22mL，0.25mol)。室温下搅拌，缓缓滴加乙二醇(14mL，0.25mol)，使回流缓和进行。滴加结束后，停止搅拌。旋转蒸发除去大部分CH2Cl2。减压蒸馏，在30℃/4mmHg条件下获得无色液体产物2-氯-1，3，2-二氯磷杂环戊烷(CP，21g)。将产物溶解于苯(200mL)，通入氧气反应48小时，蒸馏出溶剂苯，再于减压下(115℃/5mmHg)蒸馏出产物COP(19.6g)，产率79％。
在干燥的1000mL三口烧瓶中，依次加入乙醇(17.3mL，0.3mol)，三乙胺(31mL，0.3mol)和四氢呋喃(500mL)，将体系冷却到-15℃，搅拌下用恒压滴液漏斗缓慢加入COP(17.2g，0.154mol)的四氢呋喃溶液(将COP溶于100mL四氢呋喃)，反应24小时。将白色三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，用水泵抽除四氢呋喃溶剂，减压蒸馏(130℃/5mmHg)得到产物EEP(15.8g)，产率68％。
(2)溴代异丁酸-2-羟基乙酯(HEBI)的合成。
将5gα-溴代异丁酰溴滴加到31g 乙二醇和2.19g三乙胺的混合液中。冰浴中反应4小时。然后升温到40℃，反应5小时。停止反应后把产物倒入500mL水中，用氯仿抽提3次。然后依次用5％盐酸溶液，饱和NaHCO3溶液洗涤氯仿层。分液漏斗分液后，用MgSO4干燥。最后经减压蒸馏(70℃/4mmHg)得到产物HEBI(3.9g)，产率85％。产物经核磁共振氢谱(1H NMR)验证其结构，1H NMR谱图见图1。
(3)聚磷酸酯大分子引发剂PEEP25-Br的合成。
预先将反应瓶和搅拌子放在120℃烘箱中至少干燥6h。取出后，用翻口橡皮塞塞紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复几次至反应瓶冷却。用干燥的注射器依次往瓶中注入2.98g单体EEP(19.6mmol)、0.14g引发剂HEBI(0.66mmol)和0.27g催化剂Sn(Oct)2(0.66mmol)，然后再抽真空并充放高纯氩气三次。最后将反应瓶置于预先设置好温度的45℃油浴中，反应3h后，打开塞子，停止反应。
将反应粗产物在无水乙醚中沉淀，过滤，重复三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到2.44g无色透明粘稠状产物(PEEP-Br)，产率约82％，其分子链两末端分别带有溴原子(-Br)和羟基(-OH)，产物经核磁共振氢谱(1H NMR)，红外光谱(FT-IR)和凝胶渗透色谱(GPC)验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，聚合物PEEP25-Br的核磁共振谱图见图2，红外光谱谱图见图4(A)。
实施例二聚磷酸酯大分子引发剂PEEP50-Br的合成方法 (1)环状磷酸酯单体2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)的制备同实施例一。
(2)溴代异丁酸-2-羟基乙酯(HEBI)的合成同实施例一。
(3)聚磷酸酯大分子引发剂PEEP50-Br的合成。
预先将反应瓶和搅拌子放在120℃烘箱中至少干燥6h。取出后，用翻口橡皮塞塞紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复几次至反应瓶冷却。用干燥的注射器依次往瓶中注入5.81g单体EEP(38.4mmol)、0.14g引发剂HEBI(0.66mmol)和0.54g催化剂Sn(Oct)2(1.32mmol)，然后再抽真空并充放高纯氩气三次。最后将反应瓶置于预先设置好温度的85℃油浴中，反应10h后，打开塞子，停止反应。
将反应粗产物在无水乙醚中沉淀，过滤，重复三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到5.0g无色透明粘稠状产物(PEEP50-Br)，产率约86％，其分子链两端分别带有溴原子(-Br)和羟基(-OH)，产物经核磁共振氢谱(1H NMR)、红外光谱(FT-IR)和凝胶渗透色谱(GPC)验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，聚合物的核磁共振谱图与图2相似。红外光谱谱图与图4(A)相似。
实施例三含聚磷酸酯的双亲水性嵌段共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的合成方法。
(1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引发剂(PEEP21-Br)的制备与提纯同实施例一。
(2)将预先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反应瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室温。将干燥的0.55g引发剂PEEP21-Br(0.17mmol)和0.05g配体2，2′-联吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，搅拌均匀，接着将0.76g亲水性单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)(0.5mmol)用注射器加入到含有引发剂和配体的混合物中，搅拌溶解，抽真空，然后通入高纯氩气，反复三次。用注射器加入5mL的甲醇，抽真空，再冲入氩气，搅拌溶解至溶液为透明。最后，将经过纯化处理的0.024g溴化亚铜(CuBr)(0.17mmol)加入到上述混合体系中，通入高纯氩气保护。升温至45℃，并保持此温度和搅拌速度，反应2小时。
到达反应时间后，加入50mL四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐。旋转蒸发使溶液浓缩，再将之滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物。最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即聚磷酸酯与亲水性单体形成的双亲水性嵌段共聚物。
将上述中提纯后的嵌段聚合物进行核磁共振(NMR)、红外光谱(FT-IR)、凝胶渗透色谱(GPC)分析，结果表明已成功合成双亲水性共聚物。共聚物PEEP21-b-PDMAEMA25的核磁共振谱图见图3，红外光谱谱图见图4(B)。
共聚物的水溶液性质通过稳态荧光探针法、透射电镜(TEM)及紫外-可见分光光度法进行表征。利用透射电镜(TEM)观察此聚合物在水溶液中的聚集形态。结果表明，该嵌段共聚物在不同pH水溶液中能形成不同的自组装形态，表现出明显的pH响应性。透射电镜照片见图5。利用紫外-可见分光光度法观察此聚合物溶液在不同温度下的透光率。结果表明，该聚合物具有可调节的LCST(低临界共溶温度)，并且其温度响应性具有可逆性。溶液透光率随温度的可逆变化图见图6。
实施例四含聚磷酸酯的双亲水性嵌段共聚物PEEP50-b-PDMAEMA85的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引发剂(PEEP50-Br)的制备与提纯同实施例一。
(2)将预先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反应瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室温。将干燥的1.29g引发剂PEEP50-Br(0.17mmol)和0.1g配体2，2′-联吡啶(0.68mmol)加入支管瓶中，搅拌均匀，接着将2.58g亲水性单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)(16.42mmol)用注射器加入到含有引发剂和配体的混合物中，搅拌溶解，抽真空，然后通入高纯氩气，反复三次。用注射器加入10mL的甲醇，抽真空，再冲入氩气，搅拌溶解至溶液为透明。最后，将经过纯化处理的0.048g溴化亚铜(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合体系中，通入高纯氩气保护。升温至45℃，并保持此温度和搅拌速度，反应2小时。
到达反应时间后，加入50mL四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐。旋转蒸发使溶液浓缩，再将之滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物。最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即聚磷酸酯与亲水性单体形成的双亲水性嵌段共聚物。
聚合物的表征同实施例三。图谱分别与图3、图4(B)、图5、图6相似。
实施例五含聚磷酸酯的双亲水性嵌段共聚物PEEP80-b-PDEAEMA80的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引发剂(PEEP50-Br)的制备与提纯同实施例一。
(2)将预先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反应瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室温。将干燥的2.06g引发剂PEEP80-Br(0.17mmol)和0.1g配体2，2′-联吡啶(0.68mmol)加入支管瓶中，搅拌均匀，接着将3.15g亲水性单体甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(DEAEMA)(17mmol)用注射器加入到含有引发剂和配体的混合物中，搅拌溶解，抽真空，然后通入高纯氩气，反复三次。用注射器加入15mL的甲醇，抽真空，再冲入氩气，搅拌溶解至溶液为透明。最后，将经过纯化处理的0.028g溴化亚铜(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合体系中，通入高纯氩气保护。升温至55℃，并保持此温度和搅拌速度，反应2小时。
到达反应时间后，加入50mL四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐。旋转蒸发使溶液浓缩，再将之滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物。最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即聚磷酸酯与亲水性单体形成的双亲水性嵌段共聚物。聚合物的表征同实施例三。
实施例六含聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物PEEP30-b-PDEAEMA50的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引发剂(PEEP30-Br)的制备与提纯同实施例一。
(2)将预先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反应瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室温。将干燥的0.77g引发剂PEEP30-Br(0.17mmol)和0.05g配体2，2′-联吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，搅拌均匀，接着将1.83g亲水性单体甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(DEAEMA)(9.88mmol)用注射器加入到含有引发剂和配体的混合物中，搅拌溶解，抽真空，然后通入高纯氩气，反复三次。用注射器加入20mL的甲醇，抽真空，再冲入氩气，搅拌溶解直至混合物溶液为透明。最后，将经过纯化处理的0.048g溴化亚铜(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合体系中，通入高纯氩气保护。升温至60℃，并保持在此温度和搅拌速度，反应2小时。
到达反应时间后，加入50mL四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐。旋转蒸发使溶液浓缩，再将之滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物。最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即聚磷酸酯与亲水性单体形成的双亲水性嵌段共聚物。
聚合物的表征同实施例3。
实施例七含聚磷酸酯双亲水性嵌段共聚物PEEP30-b-PMAA30的合成方法 (1)基于聚磷酸酯大分子ATRP引发剂(PEEP30-Br)的制备与提纯同实施例一。
(2)PEEP30-b-PtBMA30的制备与提纯 将预先放入120℃烘箱中干燥6h以上的反应瓶取出后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷至室温。将干燥的0.77g引发剂PEEP30-Br(0.17mmol)和0.05g配体2，2′-联吡啶(0.34mmol)加入支管瓶中，搅拌均匀，接着将0.81g单体甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)(5.67mmol)用注射器加入到含有引发剂和配体的混合物中，搅拌溶解，抽真空，然后通入高纯氩气，反复三次。用注射器加入15mL的无水四氢呋喃，抽真空，再冲入氩气，搅拌溶解直至混合物溶液为透明。最后，将经过纯化处理的0.048g溴化亚铜(CuBr)(0.34mmol)加入到上述混合体系中，通入高纯氩气保护。升温至45℃，并保持在此温度和搅拌速度，反应2小时。
到达反应时间后，加入50mL四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使得反应终止。待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐。旋转蒸发使溶液浓缩，再将之滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物。最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即聚磷酸酯与甲基丙烯酸叔丁酯形成的嵌段共聚物PEEP30-b-PtBMA30。
(3)PEEP30-b-PMAA30的制备与提纯 将2g PEEP30-b-PtBMA30(0.23mmol)溶解在20mL CH2Cl2溶液中，在0℃条件下，向溶液中缓慢滴加3.89g三氟乙酸(CF3COOH)(34mmol)，滴加完毕后，在室温的条件下反应过夜，使聚甲基丙烯酸叔丁酯链段水解为聚甲基丙烯酸链段。
反应完毕后，通过旋转蒸发除去溶剂，粗产品用2mL二氯甲烷溶解，在冰的正己烷中沉淀，过滤，重复三次，用水泵抽干，再置于30℃真空烘箱中干燥24h，得到产物PEEP30-b-PMAA30。
通过上述方法制备的双亲水性嵌段共聚物可以用作基因载体或药物缓释载体等生物医用材料，用作DNA载体时，凝胶阻滞电泳测试结果如图7所示。通过透射电子显微镜分析，可以比较裸质粒DNA(Plasmid pUC 18 DNA)粒子和用双亲水性嵌段共聚物PEEP-b-PDMAEMA复合以后的粒子的形态，如图8所示。
权利要求
1.一种pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物，其特征在于，所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物的化学结构式如通式(1)或通式(2)所示
式中，w为20～100，y为20～200，z为20～200；X为溴或氯；
R1基团选自乙基、异丙基、辛基、十二烷基或者聚环氧乙烷基中的一种；所述聚环氧乙烷基的化学结构式为
其中n为2～10；
R2基团选自
氢(H)、
中的一种；
R3基团选自
中的一种；
R4基团选自
中的一种。
2.据权利要求1所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物，其特征在于，所述pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物的数均分子量范围是2000～50000g·mol-1。
3.一种聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，其特征在于所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的分子链一端含羟基，另一端含溴或氯取代基，所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的化学结构式为
R1基团选自乙基、异丙基、辛基、十二烷基或者聚环氧乙烷基中的一种；所述聚环氧乙烷基的化学结构式为
其中n为2～10；
w为20～100；X为溴或氯。
4.权利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤
(1)制备环状含磷单体以R1-OH与
反应合成具有R1侧链取代基团的环状含磷单体
其中，R1基团选自乙基、异丙基、辛基、十二烷基或者聚环氧乙烷基中的一种；所述聚环氧乙烷基的化学结构式为
其中n为2～10；
(2)制备聚磷酸酯大分子ATRP引发剂利用带有端羟基功能基团的含溴或氯有机化合物HO-R4-X，在催化剂辛酸亚锡的存在下对环状含磷单体
进行开环聚合，得到分子链末端含溴或氯取代基的聚磷酸酯大分子ATRP引发剂；
其中，HO-R4-X选自
中的一种；其中，X选自溴或氯。
5.权利要求1所述pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤
利用权利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与pH敏感的单体进行溶液ATRP反应，获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物；
所述pH敏感的单体为具有pH响应性的水溶性单体，选自甲基丙烯酸-2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N，N-二异丙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(N-叔丁基氨基)乙酯、2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶中的一种。
6.权利要求1所述pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤
利用权利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与甲基丙烯酸叔丁酯或4-乙烯基苯甲酸叔丁酯单体进行溶液ATRP反应；聚合以后在二氯甲烷和三氟乙酸存在下水解，分别成为聚甲基丙烯酸、或聚4-乙烯基苯甲酸链段；获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物。
7.权利要求1所述pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤
利用权利要求3所述聚磷酸酯大分子ATRP引发剂，在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，与甲基丙烯酸-2-羟基乙酯单体进行溶液ATRP反应；再与丁二酸酐反应，获得侧链含羧基的聚合物链段，获得pH/温度响应性的双亲水性嵌段共聚物。
8.根据权利要求6、7或8的制备方法，其特征在于单体[M]与ATRP引发剂[I]的摩尔比为[M]∶[I]＝10∶1～200∶1；ATRP引发剂[I]与催化剂[Cat]的摩尔比为[I]∶[Cat]＝0.5∶1～1∶2；
所述ATRP催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜中的一种，用量为所用单体总质量的1.0％～7.5％。
9根据权利要求6、7或8的制备方法，其特征在于所述催化剂配体选自联吡啶、五甲基三亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。
10.根据权利要求6、7或8的制备方法，其特征在于反应完成后进行提纯处理，所述提纯处理包括以下步骤
(1)反应完成后，加入四氢呋喃将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止；
(2)待溶液变蓝色后，使之通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐；
(3)旋转蒸发使溶液浓缩，再将浓缩液滴入正己烷中，除去未反应的单体和均聚物；
(4)最后将所得白色沉淀物在真空烘箱40～50℃干燥至恒重，得到乳白色的粘性物质，即所述pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物。
全文摘要
本发明属生物医用高分子材料领域，具体公开了一种pH/温度响应的双亲水性嵌段共聚物及其制备方法，本发明通过开环聚合得到可降解的温度响应性聚磷酸酯，然后将聚磷酸酯设计成大分子ATRP引发剂，与pH敏感的水溶性单体或聚合以后可水解的单体前体通过ATRP反应，获得pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物。组成嵌段共聚物的两段均为亲水性聚合物，其中一段含具有生物相容性、生物可降解性及温敏性的聚磷酸酯，另一段为pH响应性的亲水聚合物，因此，本发明提出的pH/温度响应性双亲水性嵌段共聚物具有优异的生物相容性、生物可降解性和pH/温度敏感性，是一类新型的人工合成的高分子材料，在生物医学和其它方面具有广泛的用途。
文档编号C08F293/00GK101649034SQ20091003447
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者倪沛红, 旭 刘, 何金林, 张明祖, 朱秀林 申请人:苏州大学