立足点引物双链体的组合物及其使用方法与流程

立足点引物双链体的组合物及其使用方法相关申请本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2010年10月27日提交的美国临时申请序列号61/407,291的优先权，该案的完整内容通过引用结合在此。发明领域在此描述的实施例涉及部分双链的核酸引物以及它们在例如核酸合成方法中的用途。发明背景核酸是生物学中的重要信息载体，并且核酸的检测、扩增和鉴别已经形成了一个庞大的生物技术产业的基础。具体地说，全世界已经使用如聚合酶链反应（PCR）（佐伯（Saiki）等人.科学（Science）239,487-491（1988））等方法作为扩增DNA的一种可靠手段，同时反转录酶法已经被用于探测转录组。DNA聚合酶、RNA聚合酶和反转录酶的操作典型地使用一个称为引物的短寡核苷酸片段来引导一个长标靶的部分被复制或转录。尽管核酸杂交的特异性常常足以引导针对大多数标靶序列的酶促活性，但是具有重复序列、二级结构以及高G/C含量的标靶很难以高产率进行扩增。另外，其他核酸的高背景常常会导致不正确的扩增，如在单拷贝人类基因组扩增的情况下。最后，由于必须同时发生的大量正交扩增反应，多重化扩增（如由一个DNA芯片池）可能很难实现。转录和反转录存在类似的问题。技术实现要素：核酸的杂交在单个核苷酸水平上是具特异性的。举例来说，胞嘧啶优先地结合于鸟嘌呤，并且腺嘌呤优先地结合于胸腺嘧啶或尿嘧啶。然而，对于由许多核苷酸构成的核酸分子来说，杂交的特异性降低，并且具有接近互补的序列的核酸将几乎与完美互补的序列一样强地结合。鉴于感兴趣的标靶核酸（“标靶”）和具有与该标靶有例如一个核苷酸不同的序列的核酸（“假标靶”）的异质混合物，与该标靶互补的相当大部分的引物将改与假标靶杂交。由于正确的标靶以略微更高的亲和力结合于一种具有互补序列的引物，故在足够的时间下，正确的标靶最终将在结合于一种互补引物方面替代假标靶。不过，这一过程非常缓慢，并且在许多实验系统典型的纳摩尔浓度下将要用去数个月。为了减小互补引物结合于假标靶的倾向，通常有必要在接近引物/标靶复合物的熔融温度下运行基于核酸引物的实验系统。由于这一熔融温度一般比大多数生物系统自然地运作时所处的温度要高得多，故此高温要求阻碍了该实验系统在正常生物条件下操作。另外，由于该熔融温度将随不同的标靶而变化，故这类实验系统必需的窄温度范围限制了同时使用多种引物来检测多种标靶。在此提供了引物（例如，引物双链体和发夹引物双链体），这些引物在多个实施例中能够在一个较宽的温度范围内以高特异性迅速地结合于核酸标靶。这些引物可以用于例如核酸合成反应（例如PCR）、微阵列分析、成像法以及单核苷酸多态性（SNP）分析中。这些引物还可以用于核酸检测检验中，其中它们主要用作“探针”。因此，不管应用如何，本发明的引物在此可以与“探针”互换地提到。不管应用（或使用方法）如何，本发明的引物克服了在假标靶的存在下需要特异性杂交时，并且更具体地说在这些假标靶过量存在时通常遇到的问题。在此提供的引物具有若干独特的特性，这些特性有助于它们与对核酸起作用的酶组合使用。第一，这些引物以热力学方式设计成以高特异性仅仅结合于它们所希望的标靶，并且它们针对甚至单个核苷酸变化也显示出高辨别力。第二，这些引物的特异性使得传统上困难的标靶（如具有显著序列重复、二级结构和/或高G/C含量的那些）能够进行PCR、转录和反转录。用这些引物可以达到的高特异性程度进一步使得甚至在高核酸背景（如单拷贝人类基因组扩增）下也能够进行精确的加工。第三，这些引物的部分双链的性质意味着它们不太可能彼此相互作用，并且因此它们能够进行高度多重化的复制、转录和/或反转录反应。最后，这些引物与标靶的杂交对于温度和盐度相对稳固，并且因此，这些引物可以具有比标准引物显著更长的长度，而这种长度又提供进一步增强的特异性和引物设计灵活性。在一些实施例中，在此论述的核酸引物经过合理地设计，以使得特定的标靶核酸分子与该引物之间的杂交的标准自由能（例如，理论的标准自由能）接近于零，而一种假标靶（即使是与特定的（实际的）标靶具有少至单个核苷酸不同的假标靶）与该引物之间的杂交的标准自由能足够高到以使得其结合相比之下不利。诸位发明人通过设计出一种引物来实现这一目的，该引物具有(a)一个“立足点（toehold）”单链的标靶特异性区、(b)一个“分支移位”双链的标靶特异性区以及(c)一个“平衡”双链的标靶非特异性区。在一些实施例中，该引物可以包含一个单链，该单链自身杂交形成双链区。在一些实施例中，该引物可以包含两条链。作为后一实施例的一个实例，这些引物包含一个第一或补体链及一个第二或保护子链。该补体链正如其名称所暗示的，与感兴趣的标靶部分互补并且将与该标靶杂交。另一方面，该保护子链被设计成不与该标靶杂交，而是与该标靶（或假标靶）竞争着结合该补体。该“立足点”区存在于该补体链中，与标靶序列互补并且不与保护子区互补。该补体链中的“平衡区”（即，补体平衡区）与该保护子的一部分（即，与保护子平衡区）互补并且不与标靶序列互补。立足点跟标靶的杂交能与补体平衡区跟保护子平衡区的杂交能相配或几乎相配（针对不同的其他热力学考虑因素进行调整）。该平衡区的序列被合理地设计成在所希望的温度和引物浓度条件下达到这一相配。因此，实际标靶与引物的平衡迅速地接近50%的标靶:引物::保护子:引物（或任何所希望的比率），而假标靶与引物的平衡非常有利于保护子:引物。在特定标靶存在下，丰富的游离引物有助于其高敏感性和特异性的检测。在一些实施例中，在此论述的核酸引物经过设计，以使得特定标靶核酸分子与该引物之间的杂交的经浓度调整的自由能接近于零，而一种假标靶与该引物之间的杂交的经浓度调整的标准自由能足够高以使得其结合相比之下不利。如在此所使用，“经浓度调整的自由能”是指ΔG°+(Δn)RTln(c)，其中R是普适气体常数，T是以开尔文为单位的温度，c是该引物的浓度，并且Δn是在该反应过程中分子数量的变化（对于标准杂交来说，Δn=-1；对于两条链的引物杂交来说，Δn=0）。因此，本发明的多个方面提供了包含这些引物的引物组合物、包含该补体和保护子链的组合物（例如在试剂盒中）、制备这些引物的方法，以及在包括（不限于）核酸合成和/或检测检验或反应在内的检验或反应中使用这些引物的方法。因此，在一个方面，本发明提供一种部分双链的引物，它包含(a)第一核酸链（在此也称为补体链）和第二核酸链（在此也称为保护子链），其中该第一和该第二链当彼此杂交时被安排成(1)一个双链的标靶非特异性（平衡）区；(2)一个双链的标靶特异性（分支移位）区；以及(3)由该第一核酸链贡献的一个单链的标靶特异性（立足点）区，其中该双链的标靶非特异性区具有的标准自由能大致地等于与一种标靶核酸结合的单链的标靶特异性区的标准自由能。该部分双链的引物可以包含一个或多个双链的标靶非特异性区、一个或多个双链的标靶特异性区和/或一个或多个单链的标靶特异性区。在一些实施例中，该部分双链的引物可以包含一个或两个双链的标靶非特异性（平衡）区、一个或多个双链的标靶特异性（分支移位）区和/或一个或多个单链的标靶特异性（立足点）区。在一些实施例中，该第二核酸链在其3’端处包含一个不可延伸的核苷酸，和/或该第一核酸链在其标靶非特异性区的3’端处或3’端附近包含一个非天然核苷酸。在一些实施例中，该不可延伸的核苷酸是一个非天然核苷酸或一个双脱氧核苷酸。在一些实施例中，该非天然核苷酸是异-C、异-G或脱氧尿苷。这些实例意图为非限制性的。在一些实施例中，该双链的标靶非特异性区为约4-20个核苷酸的长度。该双链的标靶非特异性区可以长于20个核苷酸，如（例如）4-21个核苷酸的长度。在一些实施例中，它可以为约12-192个核苷酸的长度。在一些实施例中，该单链的标靶特异性区为约4-20个核苷酸的长度。该单链的标靶特异性区可以长于20个核苷酸，如（例如）4-21个核苷酸的长度。在一些实施例中，它可以为约12-192个核苷酸的长度。在一些实施例中，该双链的标靶非特异性区和该单链的标靶特异性区具有类似或相同的A/T核苷酸比例（以及典型地类似或相同的G/C核苷酸比例）。在一些实施例中，该第一和第二核酸链包含DNA或RNA，或其组合。在另一方面，本发明提供一种单链引物，该引物部分地自身杂交形成(1)一个双链的标靶非特异性区、(2)一个双链的标靶特异性区、(3)单链的标靶特异性区及(4)一个发夹环区，其中这一个或多个双链的标靶非特异性区的经浓度调整的标准自由能大致地等于与一种标靶核酸结合的一个或多个单链的标靶特异性区的经浓度调整的标准自由能。在另一方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含前文提到的任何引物。该组合物可以进一步包含一种载体，如一种缓冲液，任选地包含一种防腐剂、一种或多种盐等。该组合物还可以包含过量的多个单链的保护子链，其中每个保护子链包含一个保护子平衡区和一个保护子分支移位区。这些单链的保护子链各自可以优选地在其3’端处包含一个不可延伸和/或非天然存在的核苷酸。在另一方面，本发明提供一种系统，该系统包含一种核酸标靶、一种聚合酶及任何前述引物。在一些实施例中，该引物是一种部分双链的引物，它包含一个第一和一个第二核酸链，这些核酸链被安排成(1)一个双链的标靶非特异性区、(2)一个双链的标靶特异性区以及(3)由该第一核酸链贡献的一个单链的标靶特异性区。在一些实施例中，该核酸标靶是单链的。在一些实施例中，该核酸标靶是DNA或RNA。在一些实施例中，该核酸标靶包含重复序列、二级结构和/或高GC含量。在一些实施例中，该核酸标靶存在于多种不同的核酸中。在一些实施例中，该核酸标靶是作为一个单拷贝或以低拷贝（例如，低于0.001%、低于0.01%、低于0.1%或低于1%）存在于多种不同的核酸中。在一些实施例中，该系统包含多种任何前述引物，如多种不同的部分双链的引物。在一些实施例中，该系统包含至少两种前述引物，如至少两种部分双链的引物，这些引物一起可以用于扩增该核酸标靶的一个区域。在另一方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含前文提到的任何系统。该组合物可以进一步包含一种载体，如一种缓冲液，任选地包含一种防腐剂、一种或多种盐、一种或多种酶（如聚合酶）、适于核酸合成的多种核苷酸等。该组合物还可以包含过量的多个单链的保护子链，其中每个保护子链包含一个保护子平衡区和一个保护子分支移位区。这些单链的保护子链各自可以优选地在其3’端处包含一个不可延伸和/或非天然存在的核苷酸。在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括使任何前述引物（包括任何前述的部分双链的引物）与一个样品接触，并且检测该引物与该样品中的一种标靶的杂交。在一些实施例中，该引物（如部分双链的引物）标记有一个可检测部分。在一些实施例中，该可检测部分包含一种荧光团或一种放射性同位素。该标靶将典型地为一种核酸。在一些实施例中，该标靶是一种单链核酸。在一些实施例中，该标靶是DNA或RNA。在一些实施例中，该标靶是一种包含重复序列、二级结构和/或高GC含量的核酸。在一些实施例中，该标靶存在于多种不同的核酸中。在一些实施例中，该标靶是作为一个单拷贝或以低拷贝（例如，低于0.001%、低于0.01%、低于0.1%或低于1%）存在于多种不同的核酸中。在一些实施例中，在此描述的这一和其他方法是在低于补体链-标靶复合物的熔融温度的温度下进行。在一些实施例中，在此描述的这一和其他方法是在介于（并且包括）室温直到（并且包括）50°C，或直到（并且包括）40°C，或直到（并且包括）30°C之间的温度下进行。在一些实施例中，在此描述的这一和其他方法是在约37°C下进行的。在一些实施例中，在此描述的这一和其他方法是以过量的保护子链进行，该保护子链包含一个保护子平衡区和一个保护子分支移位区，并且与该部分双链的引物中的保护子链相同。在此描述的这一和其他方法中，该引物可以是任何前述引物，包括部分双链的引物。在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括使任何前述的部分双链的引物的一个第一（补体）链的一个单链的标靶特异性（立足点）区与一种核酸标靶杂交，从而使该引物的第一链与该引物的第二（保护子）链解离，并且在一种聚合酶的存在下，以一种标靶互补的方式使该第一链在其3’端处延伸。在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括在一种核酸标靶、一种聚合酶以及一种或多种前述的部分双链的引物的存在下进行一种核酸合成反应。在一些实施例中，该核酸合成反应是一种核酸扩增反应。在一些实施例中，该核酸扩增反应是聚合酶链反应（PCR）。在一些实施例中，该核酸合成反应是一种转录反应。在一些实施例中，该转录反应是一种反转录反应。在一些实施例中，使用了两种部分双链的引物。在另一方面，本发明提供了一种进行多重化核酸扩增反应的方法，该方法包括使用任何前述引物（包括该部分双链的引物）对多个独特的核酸分子进行扩增。在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，它包含一种或多种（包括多种）任何前述的部分双链的引物，和一种或多种核酸合成试剂，如酶、核苷酸、盐、EDTA、缓冲液等。在一些实施例中，这一种或多种核酸合成试剂是选自下组，该组由一种缓冲液、多种核苷酸以及一种聚合酶组成。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含过量的保护子链，该保护子链与该引物中所包含的保护子链相同。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含使用说明书。在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，它包含在一个第一容器中的一种第一单链（补体）核酸，和在一个第二容器中的与该第一单链核酸的一个区域互补的一种第二单链（保护子）核酸，其中，当该第一与第二单链核酸彼此杂交时，形成一种部分双链的核酸，该核酸包含(1)一个双链的标靶非特异性区、(2)一个双链的标靶特异性区以及(3)由该第一核酸贡献的一个单链的标靶特异性区，其中该第一单链核酸包含一个非天然核苷酸和/或该第二单链核酸在其3’端处包含一个不可延伸的核苷酸。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含使用说明书。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含一种或多种核酸合成试剂，如上文列举的那些。在一些实施例中，这一种或多种核酸合成试剂是选自下组，该组由一种缓冲液、多种核苷酸以及一种聚合酶组成。在一些实施例中，该保护子链是以一定量（例如摩尔量）提供于该试剂盒中，该量大于该试剂盒中补体链的量（例如摩尔量）。在前述方面和发明的一些实施例，特别是涉及两条链的引物的那些实施例中，该引物的核苷酸序列经过选择，这样使得：其中：是保护子平衡区与补体平衡区的杂交的标准自由能；是保护子平衡区与在第一方向上紧邻标靶核酸序列的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是立足点区与第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。在一个方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含一个补体链和一个保护子链，其中该保护子链包含一种核酸，该核酸具有：一个保护子分支移位区，它具有一个第一端、一个第二端以及对应于具有一个第一端和一个第二端的一个第一标靶核酸序列的一个序列，其中该保护子分支移位区的第一端和该第一标靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；和紧邻该保护子分支移位区的第一端的一个保护子平衡区，它具有不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的第一端的序列（如果有的话）的一个序列；并且该补体引物包含一种核酸，该核酸具有：一个补体分支移位区，它具有一个第一端和一个第二端，以及与该保护子分支移位区互补的一个序列，其中该补体分支移位区的第一端和该第一标靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；一个立足点区，它：紧邻该补体分支移位区的第一端；并且与紧邻该第一标靶核酸序列的第二端的一个第二标靶核酸序列互补；以及一个补体平衡区，它：紧邻该补体分支移位区的第二端；与该保护子平衡区互补；并且具有这样一种序列，该序列使得：其中：是该保护子平衡区与该补体平衡区的杂交的标准自由能；是该保护子平衡区与在第一方向上紧邻该标靶核酸序列的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。在另一方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含一种核酸，该核酸具有一个保护子链、一个发夹区及一个补体链，其中：该保护子链包含一个保护子分支移位区和一个保护子平衡区，其中：该保护子分支移位区具有：一个第一端；一个第二端；以及对应于具有一个第一端和一个第二端的一个第一标靶核酸序列的一个序列，其中该保护子分支移位区的第一端和该第一标靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；并且该保护子平衡区具有：一个第一端；紧邻该保护子分支移位区的第一端的一个第二端；以及不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的第一端的序列（如果有的话）的一个序列；该发夹区包含：一个第一端；和紧邻该保护子平衡区的第一端的一个第二端；并且该补体链包含一个补体平衡区、一个补体分支移位区及一个立足点区，其中：该补体平衡区具有：一个第一端；紧邻该发夹区的第一端的一个第二端；以及与该保护子平衡区互补的一个序列；该补体分支移位区具有：一个第一端；紧邻该补体平衡区的第一端的一个第二端；以及与该保护子分支移位区互补的一个序列，其中该补体分支移位区的第一端和该第一标靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；该立足点区：紧邻该补体分支移位区的第一端；并与紧邻该第一标靶核酸序列的第二端的一个第二标靶核酸序列互补；并且该补体平衡区具有这样一种序列，该序列使得：其中：是该保护子平衡区与该补体平衡区的杂交的标准自由能；是该保护子平衡区与在第一方向上紧邻该标靶核酸序列的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；并且是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物双链体系统的温度；c是拟使用该引物双链体系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。在又一方面，在此提供了一种系统，该系统具有（按3′到5′的顺序）一个第一保护子链、一个第一发夹区、一个补体链、一个第二发夹区及一个第二保护子链，其中：该第一保护子链包含：一个第一保护子分支移位区，它具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列；和一个第一保护子平衡区，它：紧邻该第一保护子分支移位区的5′；并且具有不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列；该第一发夹区紧邻该第一保护子平衡区的5′；该补体链包含：一个第一补体平衡区，它：紧邻该第一发夹区的5′；并且具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列；一个第一补体分支移位区，它：紧邻该第一补体平衡区的5′；并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的序列；一个立足点区，它：紧邻该第一补体分支移位区的5′；并且具有与紧邻该第一标靶核酸序列的3′的一个第二标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体分支移位区，它：紧邻该立足点区的5′；并且具有与紧邻该第二标靶核酸序列的3′的一个第三标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体平衡区，它：紧邻该第二补体分支移位区的5′；具有不与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列；该第二发夹区紧邻该第二补体平衡区的5′；并且该第二保护子链包含：一个第二保护子平衡区，它：紧邻该第二发夹区的5′；并且具有与该第二补体平衡区互补的一个序列；以及一个第二保护子分支移位区，它：紧邻该第二保护子平衡区的5′；并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列；其中该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该第一发夹区的限制的标准自由能；是该第二发夹区的限制的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物双链体系统的温度；c是拟使用该引物双链体系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。在又另一方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含一个发夹引物和一个保护子链，其中：该发夹引物包含一种核酸，该核酸具有：一个第一保护子链，该链具有：一个第一保护子分支移位区，它具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列；和一个第一保护子平衡区，它：紧邻该第一保护子分支移位区的5′；并且具有不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列；一个紧邻该第一保护子平衡区的5′的发夹区；一个补体链，该链具有：一个第一补体平衡区，它：紧邻该第一发夹区的5′；并且具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列；一个第一补体分支移位区，它：紧邻该第一补体平衡区的5′；并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列；一个立足点区，它：紧邻该第一补体分支移位区的5′；并且具有与紧邻该第一标靶核酸序列的3′的一个第二标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体分支移位区，它：紧邻该立足点区的5′；并且具有与紧邻该第二标靶核酸序列的3′的一个第三标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体平衡区，它：紧邻该第二补体分支移位区的5′；具有不与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列；并且该保护子包含一种核酸，该核酸具有：一个第二保护子链，该链具有：一个第二保护子平衡区，它具有与该第二补体平衡区互补的一个序列；和一个第二保护子分支移位区，它：紧邻该第二保护子平衡区的5′；并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列；其中该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。在又一方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含一个保护子链和一个发夹引物，其中：该保护子链包含一种核酸，该核酸具有：一个第一保护子链，该链具有：一个第一保护子分支移位区，它具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列；和一个第一保护子平衡区，它：紧邻该第一保护子分支移位区的5′；并且具有不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列；该发夹引物包含一种核酸，该核酸具有：一个补体链，该链具有：一个第一补体平衡区，它具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列；一个第一补体分支移位区，它：紧邻该第一补体平衡区的5′；并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列；一个立足点区，它：紧邻该第一补体分支移位区的5′；并且具有与紧邻该第一标靶核酸序列的3′的一个第二标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体分支移位区，它：紧邻该立足点区的5′；并且具有与紧邻该第二标靶核酸序列的3′的一个第三标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体平衡区，它：紧邻该第二补体分支移位区的5′；具有不与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列；一个紧邻该第二补体平衡区的5′的发夹区；以及一个第二保护子链，该链具有：一个第二保护子平衡区，它：紧邻该第二发夹区的5′；并且具有与该第二补体平衡区互补的一个序列；和一个第二保护子分支移位区，它：紧邻该第二保护子平衡区的5′；并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列；其中该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。在另一方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含一个第一保护子链、一个补体链及一个第二保护子链，其中：该第一保护子链包含一种核酸，该核酸具有：一个第一保护子分支移位区，它具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列；和一个第一保护子平衡区，它：紧邻该第一保护子分支移位区的5′；并且具有不对应于紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列；该补体链包含一种核酸，该核酸具有：一个第一补体平衡区，它：紧邻该第一发夹区的5′；并且具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列；一个第一补体分支移位区，它：紧邻该第一补体平衡区的5′；并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列；一个立足点区，它：紧邻该第一补体分支移位区的5′；并且具有与紧邻该第一标靶核酸序列的3′的一个第二标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体分支移位区，它：紧邻该立足点区的5′；并且具有与紧邻该第二标靶核酸序列的3′的一个第三标靶核酸序列互补的一个序列；一个第二补体平衡区，它：紧邻该第二补体分支移位区的5′；具有不与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列；并且该第二保护子链包含：一个第二保护子平衡区，它具有与该第二补体平衡区互补的一个序列；和一个第二保护子分支移位区，它：紧邻该第二保护子平衡区的5′；并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列；其中该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3′的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；并且是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物双链体系统的温度；c是拟使用该引物双链体系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。在又另一方面，在此提供了一种引物双链体系统，该系统包含（按3′到5′的顺序）一个第一保护子链、一个第一发夹区、一个补体链、一个第二发夹区及一个第二保护子链，其中：该第一保护子链具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列；该第一发夹区紧邻该第一保护子链的5′；该补体链包含：一个第一补体分支移位区，它：紧邻该第一发夹区的5′；并且具有与该第一保护子链的序列互补的一个序列；一个立足点区，它：紧邻该第一补体分支移位区的5′；并且具有与紧邻该第一标靶核酸序列的3′的一个第二标靶核酸序列互补的一个序列；以及一个第二补体分支移位区，它：紧邻该立足点区的5′；并且具有与紧邻该第二核酸序列的3′的一个第三标靶核酸序列互补的一个序列；该第二发夹区紧邻该第二补体分支移位区的5′；并且该第二保护子链具有与该第二补体分支移位区的序列互补的一个序列。在前述方面的任一项中，可以为2.0kcal/mol、1.0kcal/mol或0.5kcal/mol；和/或可以为约10nM；和/或T可以为约293K或约338K；和/或该立足点区可以为介于4个与20个核苷酸之间的长度、介于约4个与15个核苷酸之间的长度，或介于约4个与10个核苷酸之间的长度；和/或该保护子分支移位区的第一端可以为5′或3′；和/或该引物双链体系统可以进一步包含一种官能化的荧光基团或染料；和/或该引物双链体系统可以被固定在一个固体支撑物上；和/或该发夹区可以为不超过20个核苷酸的长度或不超过10个核苷酸的长度；和/或该发夹区的序列可以选自下组，该组由以下各项组成：聚腺苷序列、聚脱氧腺苷序列、聚5′-甲基尿苷序列、聚胸苷序列、聚鸟苷序列、聚脱氧鸟苷序列、聚胞苷序列、聚脱氧胞苷序列、聚尿苷序列及聚脱氧尿苷序列；和/或该第一标靶核酸序列和/或该第二标靶核酸序列可以是在一种生物体或一种病毒中天然存在的序列；和/或该第一标靶核酸序列和/或该第二标靶核酸序列可以是在一种微RNA中天然存在的序列。在一个方面，在此提供了一种检测样品中的标靶核酸的方法，该方法包括：使一种标靶核酸与在此描述的任一实施例的引物双链体系统接触；并且检测该标靶核酸与该引物双链体系统的至少一部分之间的复合物的形成。在一些实施例中，该引物双链体系统进一步包含一种官能化的荧光基团或染料。在一些实施例中，该引物双链体系统被固定在一个固体支撑物上。在一些实施例中，该接触在一个细胞中发生。在一些实施例中，该标靶核酸是在一种生物体或一种病毒中天然存在的一种核酸。在一些实施例中，该标靶核酸是一种微RNA。在另一方面，在此提供了一种扩增标靶核酸内所含的序列的方法，该方法包括：形成一种溶液，该溶液包含：一种标靶核酸；在此描述的任一实施例的一种引物双链体系统；以及用于进行一种扩增反应的多种试剂；并且在使得该标靶核酸内所含的一个序列被扩增的条件下孵育该溶液。在一些实施例中，该标靶核酸是在一种生物体或一种病毒中天然存在的一种核酸。本发明的这些和其他方面和实施例将在此更详细地解释。附图简要说明图1A、1B、2A、2B、3A、3B、4-8、9A及9B描绘了示例性的核酸探针系统。图10、11、12A、12B、13及14描绘了使用核酸探针系统的示例性方法。图15A和15B描绘了使用在此提供的引物双链体进行的高特异性聚合酶链反应（PCR）。图16A-16D示出了具有单个核苷酸辨别力的引物杂交的实验论证。图17A-17D示出了有关引物双链体的单碱基辨别能力的另外的实验结果和统计学。图18A-18B示出了使用双链体引物改良一种准重复标靶的PCR产率的实验结果。发明的详细说明基于探针的核酸检验中的一个重大挑战是序列类似于标靶序列的核酸将以较强的热力学和快速的动力学与该标靶的补体杂交。然而，如在此所描述，链置换反应的动力学和热力学可以部分地解耦，使得在热力学方面只是略微有利或甚至不利的反应仍然可以具有与两个互补链的杂交一样快的动力学。在此描述的组合物和方法利用了这一解耦机制来提供特异性和动力学改良的核酸探针系统。在此提供了高特异性核酸探针系统和使用这些探针系统的方法。在某些实施例中，在此描述的这些核酸探针系统包含多个补体探针，这些探针具有与标靶序列互补的区域，这些区域被与这些补体探针的一部分互补的保护子区保护从而不与假标靶杂交。该标靶与受保护的探针之间的结合反应的自由能是通过一个或多个平衡区的经合理地设计的碱基进行精细控制，这一个或多个平衡区的序列不对应于该标靶核酸序列或其补体。在某些实施例中，一个保护子和一个补体探针在单个核酸分子上形成多个区域，并且通过一个或多个核酸发夹彼此分开。在此描述的方法和组合物具有若干独特的特性，这些特性有助于它们用于杂交检验中。第一，在此描述的核酸探针系统可靠地将标靶与假标靶之间的较小序列差异转变成该标靶对比假标靶与探针的杂交之间的结合亲和力和反应速率的较大差异。第二，在此描述的核酸探针系统可以设计成在较宽温度和盐浓度范围内的任一种下操作，并且因此可以在许多不同的实验条件下可靠地起作用。第三，使用在此描述的核酸探针系统可以使得杂交反应即使在室温下也为动力学上快速的，这有助于进行快速并且高通量的核酸分析。第四，在此描述的核酸探针系统经过了合理地设计，并且因此不太可能不利地或以出于意料的方式与其他生物分子相互作用。因此，在此提供了引物组合物、制备这些组合物的方法及其使用方法。在此描述的实施例部分地以下述发现为前提：呈部分双链并且部分单链的引物（例如，一对部分杂交的引物或单个自身杂交的引物）当例如用于一种核酸合成反应中时，能够辨别完全互补的标靶与具有一个或多个错配的那些（即，假标靶）。如在此所论证，在此描述的引物双链体在例如使用假标靶（如具有准重复序列的那些）的PCR反应中优于标准引物。在此的引物双链体包含一个在此称为“立足点”的单链区，该引物双链体从该单链区起始与一种标靶的结合；一个双链的“平衡区”，它自发地解离，使得单个引物链无法竞争与该标靶的杂交（沿该引物的全长）；以及在该立足点区与平衡区中间的一个双链的分支移位区，它与标靶核酸序列完全互补。机械地，认为与一种标靶的杂交在该立足点开始，并且沿该补体链的长度继续，直到该引物不再是“双链的”。这也假定了该标靶与分支区之间的互补性。如在此所使用，核酸“区”或“结构域”是任何长度的核苷酸的连续伸长。当在“标靶”与补体链之间存在核苷酸错配时，第二链（即，保护子链）的置换在热力学上是不利的，并且该补体链与该“标靶”之间的缔合被逆转。应了解的是，在这后一描述中，该“标靶”实际上是一个假标靶，因为它包含与该补体链的核苷酸差异或错配。由于标准自由能有利于该核酸的标靶序列与该引物的分支移位区加立足点区之间的完整匹配（完全互补）而非错配（例如，单个核苷酸变化），故该引物的第一（补体）链在错配不存在的情况下而不是在错配的存在下将稳定地结合于标靶。如果在该引物的第一（补体）链与该标靶之间存在一个错配，那么该引物双链体倾向于通过新暴露出来的单链平衡区重新形成。以此方式，在一个标靶中（或在一个样品中，就那点来说）的一个不正确位置处开始核酸合成反应的频率降低。这一辨别类型使用现有技术的标准单链引物典型地是不可能的，因为在那些反应中，不存在将倾向于结合于一个错配的引物链的竞争性核酸链（如保护子链）。在一些实施例中，在此描述的这些引物可以比常规引物（例如，用于聚合酶链反应（PCR）扩增的那些）显著更长，因为本发明的引物依赖于一个竞争性保护子链的存在（对于特异性来说）而非依赖于熔融温度来辨别互补序列与错配序列。因此，本发明的引物可以按不依赖于温度的方式进行选择并且使用。因此，在此描述的引物双链体改良了例如核酸合成反应的特异性，并且在一些实施例中，允许更高程度的引物多重化。初步实验（其结果在此提供）显示，如与标准引物相比较，准重复标靶的PCR产率可以使用在此提供的引物双链体显著地改良（例如75%对比30%）。在此描述的引物双链体还提供了一个异质核酸群中特定核酸的检测和扩增，如（例如）对包含人类DNA的一个样品中的细菌DNA进行检测并扩增，此法在如生物战用剂等罕见生物体的检测中具有广泛的适用性。引物双链体如在此所使用，本发明的引物可以称为“引物双链体”，表示它们可以呈它们包含双链区的一种构象提供和/或存在。因此，术语“引物”和“引物双链体”可以互换地使用。这些引物双链体提供了相对于现有引物改良的特异性和动力学。在此的“引物双链体”是指这样一种引物，它包含一个第一链（在此称为“补体链”）及与该第一链部分互补的一个第二链（在此称为“保护子链”）。在一些实施例中，该补体链和该保护子链是分开的单链核酸分子（图1A和1B）。在其他实施例中，该补体链和该保护子链彼此连接，并且通过一个发夹区分开以形成单个核酸分子的多个邻接的区域（图2A和2B）。如在此所使用，“发夹区”是连接一个核酸的两个双链区的由多个核苷酸构成的一个单链环。示例性引物双链体的总体结构于图式中图示并描述于此。应了解的是，在大多数情况下，当提到补体区或保护子区（或反之亦然）时，每个区域典型地在单个“引物双链体”（或单个引物系统）内。举例来说，本发明的引物中的补体平衡区与同一引物中的保护子平衡区互补，这样使得本发明的一个引物的补体平衡区不会与物理上分开的不同引物的保护子平衡区杂交。在本发明的引物只由单个链组成的实施例中，补体“链”可以称为补体区，并且保护子“链”可以称为保护子区。在某些实施例中，该补体链（或区）包含一个立足点区、一个补体分支移位区及一个补体平衡区，而该保护子链（或区）包含一个保护子分支移位区和一个保护子平衡区。如在此所使用，核酸“区”是任何长度的核苷酸的连续伸长段。立足点区和分支移位区各自被设计成与标靶核酸中的相邻区域互补，并且因此与标靶核酸中的相邻区域“碱基配对”（例如杂交）。补体链中与标靶核酸中的一个区域碱基配对的一个区域称为“标靶特异性”区。平衡区被设计成不与标靶核酸互补并且因此不与标靶核酸碱基配对。因此，平衡区称为“标靶非特异性”区。在某些方面，当该补体链（或区）与该保护子链（或区）彼此杂交（为双链的）时，形成一个引物双链体。因此，在一些方面，一个引物双链体包含一个标靶特异性的单链立足点区、一个标靶特异性的双链分支移位区及一个标靶非特异性的双链平衡区（图1A和1B）。在一些情况下，该引物双链体还可以包含一个发夹环，如下文更详细地描述。在此描述的这些引物双链体可以被设计成特异性地与标靶核酸杂交。引物（例如）在一种核酸扩增反应中的功效取决于该引物的特异性、效率以及保真度。典型的核酸引物通常以与同一引物结合于其期望的特定标靶核酸相当的热力学和动力学特征结合于假标靶，差异在于错配的双链体与完美杂交的双链体的熔融温度。因此，错配的双链体和完美的双链体可以通过其熔融温度来区别。相比之下，本发明的引物以一种相对不依赖于温度的方式来区别假标靶与真标靶。在此“假标靶”是指在与补体链杂交的区域内有至少一个核苷酸与标靶核酸分子不同的一种核酸分子。举例来说，如果标靶是TCGAAGGG，那么TCGACGGGG是假标靶。在某些实施例中，假标靶包含相对于该标靶至少2个、至少3个、至少4个或更多个核苷酸变化。结合于假标靶的引物降低了例如核酸扩增的保真度（精确度）。在此呈现的引物双链体被设计成改变了用假标靶进行链置换的标准自由能，从而容许对正确的标靶与假标靶（包括只有一个核苷酸不同于正确的标靶的假标靶）进行辨别。如在此所描述，保护子链负责改变标准自由能，以允许补体链对正确的标靶与假标靶进行辨别。在此描述的引物被合理地设计成有助于以精细调谐的动力学和热力学进行链置换反应，这样使得链置换反应的动力学和热力学部分地解耦。作为此解耦的结果，在热力学方面只是略微有利或甚至不利的反应仍然可以具有与两个互补链的杂交一样快的动力学。举例来说，在37°C和1MNa+下，一个引物与一个完美互补（正确或特定）的标靶（即，100%的核苷酸匹配）的杂交的经浓度调整的标准自由能比同一引物与一个假标靶的杂交的经浓度调整的标准自由能更有利，对于该假标靶与该期望标靶不同的每个核苷酸而言该有利的差别介于1.9kcal/mol与6.6kcal/mol之间。在某些实施例中，本发明的引物双链体使用了立足点交换链置换反应来将经浓度调整的标准自由能的这个1.9到6.6kcal/mol的差异转换成对该标靶与假标靶之间的最佳辨别。引物双链体结合于标靶核酸的热力学/动力学的一个实例如下参照图3A和3B所描述。出于此实例的目的，该标靶核酸具有至少两个区，(1)和(2)。在某些实施例中，区域(1)可以为约10到约200个（包括14-200个或20-200个）核苷酸的长度，而区域2可以更小，例如为约4到约20个核苷酸的长度。如在此所使用，术语“核苷酸”与“碱基”可互换地使用。保护子链包括邻近一个保护子平衡区(3)的一个保护子分支移位区。该保护子分支移位区对应于标靶区1，而该保护子平衡区(3)不对应于区域(1)或区域(2)，或者紧邻这些标靶区的5’的任何区域。如果一个核酸序列、结构域或区域与另一序列是同一核酸分子的部分并且如果没有碱基分开这两个序列，那么这两个序列“紧邻”、“紧邻5′”或“紧邻3′”。补体链包括一个补体平衡区(3)、一个补体分支移位区(1)以及一个立足点区(2)。该补体平衡区(3)与该保护子平衡区(3)互补，该补体分支移位区(1)与该保护子分支移位区和标靶区(1)互补（即，该保护子分支移位区与该标靶区(1)的序列是相同的并且这两者都结合于该补体分支移位区(1)，并且该立足点区(2)与标靶区(2)互补。在某些实施例中，该平衡区被设计成使得其经浓度调整的标准自由能与结合于标靶区(2)的该立足点区的经浓度调整的标准自由能相同或大致相同。在一些情况下，对于在37°C下进行的反应中所使用的10纳摩尔浓度（nM）的引物来说，和（竖线表示绝对值）应当各自小于约11.3kcal/mol以确保完整保护子链与该标靶解离。在一些实施例中，当引物双链体与一个特定（正确）的标靶核酸分子相互作用（图3A）时，(3):(3)的解离与(2):(2)的缔合彼此平衡，并且(1):(1)杂交的热力学对于该标靶核酸和对于与补体链相互作用的保护子链是相同的。两种状态之间总自由能的变化相对较小（例如为约1kcal/mol），并且反应迅速地（例如不到一分钟）达到约50:50的平衡。在某些实施例中，该平衡区可以被设计成具有与结合于标靶区2的立足点区的标准自由能非常接近的标准自由能，以使得该平衡在例如60:40或70:30下达到平衡。在一些实施例中，该平衡区的设计还可以考虑该反应期间自由能变化的其他诱因，如保护子平衡区与上游标靶序列之间的杂交（这在一些情况下是可忽略的）、发夹（如果存在的话）的限制、期望的使用温度及期望的引物浓度。在一些实施例中，当引物双链体改为与一个假标靶核酸分子相互作用（图3B）时，由于假标靶区(2m)与立足点区不完全互补，故(3):(3)的解离和(2m):(2)的缔合不平衡。该平衡因此移到该引物双链体不结合该假标靶的状态。换种方式来说，在一些情况下，结合于该保护子链的该补体链的自由能是（忽略由任选的发夹区和其他考虑因素造成的影响），这平衡了结合于特定标靶的补体链的自由能，在此实例中，这是因为引物双链体的平衡区(3)已经被设计成具有等于（或大致等于）标靶区(2)的经浓度调整的标准自由能。当该引物双链体与在标靶区(2m)中具有单个核苷酸（碱基）变化的假标靶相互作用时，该系统的自由能的负值小于该引物双链体的负值，并且因此不利于平衡。如在此所使用，在提到标准自由能时的术语“大致等于”意思是指，第一个提到的自由能在第二个提到的自由能的加减10%范围内。在一些实施例中，大致等于第二自由能的第一自由能是在该第二自由能的约+3kcal/mol到约-3kcal/mol的范围内。应了解的是，在一些实施例中，该第一与该第二真能量之间的差异可以小于或为约1kcal/mol、小于或为约2kcal/mol、小于或为约3kcal/mol、小于或为约3.5kcal/mol，或者更高。尽管图3B图示了对应于一个标靶核酸分子的区域(2)/(2m)的单个核苷酸变化，但本发明的引物双链体也可以对特定标靶与在区域(1)中具有一个核苷酸变化的假标靶进行辨别。当该假标靶在标靶区1中具有单碱基变化时，那么该引物双链体的标准自由能在结合后变为其中是结合于该引物双链体的补体区(1)的错配标靶区(1)的标准自由能。由于这单碱基变化，该引物双链体的自由能的负值小于（结合于保护子的补体引物的自由能），因此平衡移到该引物双链体不结合该假标靶区的状态。标准自由能可以基于本领域中的知识和在此提供的传授内容在理论上进行计算。补体和保护子链、区域或结构域在此描述的核酸探针系统的补体结构域各自包括多个区域，这些区域包括一个立足点区和一个或多个补体标靶区。该立足点区和该一个或多个补体标靶区都具有与标靶核酸的核酸序列互补的核酸序列。当使核酸探针系统与标靶核酸在适当的杂交条件下接触时，该立足点区和该补体标靶区因此能够与标靶核酸的序列进行碱基配对并且因此与它形成一种复合物。补体结构域还可以包括一个或多个补体平衡区。这一个或多个补体平衡区经合理地设计。因此，这一个或多个补体平衡区的序列不被设计成与一个标靶核酸序列互补。立足点区与该标靶核酸分子中的一个序列互补（并因此杂交）；然而，立足点区不与保护子链杂交。因此，当该补体链与该标靶核酸分子杂交时，该立足点区也与该标靶核酸分子杂交，但当该补体链与该保护子链杂交时，该立足点区保持单链的。立足点区可以定位于该补体链的3’端或5’端处（例如，作为该补体链的3’端或5’端的延伸）。在某些实施例中，立足点区为约4个核苷酸到约20个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约15个核苷酸的长度或约4个核苷酸到约10个核苷酸的长度。在一些实施例中，立足点区为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度。在一些实施例中，该立足点区大于20个核苷酸的长度，包括例如小于或为约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸。补体分支移位区与该标靶核酸分子中的一个序列并且与保护子分支移位区互补。因此，当该补体链与一个标靶核酸分子杂交时，该补体分支移位区与该标靶核酸杂交。当该补体链与其保护子链杂交时，该补体分支移位区与该保护子分支移位区杂交。在某些实施例中，分支移位区是不超过200、100、75、50、40、30、25或20个核苷酸的长度。在一些实施例中，分支移位区为约10个核苷酸到约200个核苷酸的长度。在某些实施例中，分支移位区为约10个核苷酸到约150个核苷酸的长度、约10个核苷酸到约100个核苷酸的长度或约10个核苷酸到约50个核苷酸的长度。在多个特定的实施例中，分支移位区为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个核苷酸的长度。在多个特定的实施例中，取决于感兴趣的标靶核酸分子，分支移位区可以超过200个核苷酸的长度。一个补体链与一个保护子链的平衡区彼此互补（即，形成双链核酸），但与感兴趣的标靶不互补（即，不与该标靶形成双链核酸）。因此，当一个补体链与一个标靶核酸分子杂交时，该补体平衡区不与该标靶核酸分子杂交。当该补体链与其保护子链杂交时，该补体平衡区与该保护子平衡区杂交。该平衡区的设计是取决于该立足点区的设计。在一些实施例中，该平衡区被设计成使得该平衡区的热力学特征与该立足点区的热力学特征相当。在一些实施例中，该热力学特征是基于使用例如在RPI生物信息网站得到的Mfold软件的一个理论模型。一个平衡区内核苷酸的数量和/或性质与该立足点区的核苷酸数量和/或性质相当。举例来说，如果一个立足点区包含40%的A和T核苷酸以及60%的G和C核苷酸，那么该平衡区也应当包含40%的A和T核苷酸以及60%的G和C核苷酸。在多个实施例中，该平衡区被设计成使得不超过三个连续的核苷酸与该标靶核酸上的一个序列互补，以避免该平衡区结合于该标靶核酸。在一些实施例中，平衡区的长度足够短以使得该补体与该保护子彼此自发地解离。在一些实施例中，平衡区为约4个核苷酸到约20个核苷酸的长度、约4个核苷酸到约15个核苷酸的长度或约4个核苷酸到约10个核苷酸的长度。在一些实施例中，平衡区为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度。在一些实施例中，平衡区大于20个核苷酸的长度，包括例如小于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸。在一些实施例中，与该标靶核酸内的一个核苷酸序列互补的连续核苷酸的数量可以大于三个，其条件是该平衡区不结合于该标靶核酸。在一些实施例，例如该引物双链体含有两个分开的核酸链的那些实施例中，平衡区的设计不取决于该引物双链体的浓度或形成/使用该引物双链体时的温度。在一些实施例中，平衡区被设计成使得保护子链被该标靶核酸分子从补体链中置换的反应的标准自由能接近零千卡/摩尔。如在此所使用，“接近零”意思是指该反应的标准自由能是在0kcal/mol加减3.5kcal/mol的范围内。在某些实施例中，此置换反应的标准自由能在零千卡/摩尔加减3.5、3.0、2.5、2.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1kcal/mol的范围内。在其他实施例，例如该引物双链体是由单个核酸分子（例如，发夹区分开补体链（或区或结构域）与保护子链（或区或结构域））形成的那些实施例中，平衡区的设计将取决于该引物双链体的浓度以及反应温度。在这些实施例中，平衡区被设计成使得保护子链被该标靶核酸从补体链中置换的反应的标准自由能加上RTln(c)接近零千卡/摩尔，其中R是普适气体常数（0.0019858775(34)kcal/mol·K），T是使用该引物双链体时的温度，并且c是使用引物双链体的浓度。在一些实施例中，使用这些引物双链体时的温度为约273K（0°C）、277K、283K、288K、293K、298K、303K、308K、313K、318K、323K、328K、333K、338K、343K、348K、353K、358K或363K（90°C）。在一些实施例中，使用这些引物双链体的浓度（c）为约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、125nM、150nM、175nM、200nM、225nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1μM。在某些实施例中，此置换反应的标准自由能加上RTln(c)在零千卡/摩尔加减3.5、3.0、2.5、2.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1kcal/mol的范围内。在一些实施例中，引物双链体可以包括一个或多个发夹区，这些区域将补体链连接到保护子链。在某些实施例中，一个引物双链体的发夹区可以为任何长度。在一些实施例中，该发夹区是超过30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核苷酸的长度。在一些实施例中，该发夹的序列不与该标靶核酸分子的一个序列互补。在某些实施例中，该发夹区具有聚单核苷酸序列，如聚腺苷序列、聚脱氧腺苷序列、聚5′-甲基尿苷序列、聚胸苷序列、聚鸟苷序列、聚脱氧鸟苷序列、聚胞苷序列、聚脱氧胞苷序列、聚尿苷序列及聚脱氧尿苷序列。在此描述的引物双链体可以是至少两种定向中的一种。举例来说，在一种定向中，立足点区位于5’端处，紧邻补体分支移位区（即，在两个区域之间没有插入的核苷酸），并且补体平衡区位于3’端处，紧邻该补体分支移位区。在这一定向中，保护子平衡区在保护子链的5’端处，紧邻保护子分支移位区（图1A）。在另一种定向中，该立足点区位于3’端处，紧邻该补体分支移位区，并且该补体平衡区位于5’端处，紧邻该补体分支移位区。在这一定向中，该保护子平衡区在该保护子链的3’端处，紧邻该保护子分支移位区（图1B）。不管定向如何，该补体平衡区的序列使得：其中：是该保护子平衡区与该补体平衡区的杂交的标准自由能；是该保护子平衡区与在第一方向上紧邻该标靶核酸序列的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。在一些实施例中，引物双链体包含一个比保护子更长的补体链，长度的差异取决于该补体链的立足点区的长度。这些引物的长度被设计成使得该补体与感兴趣的标靶的杂交具有接近零的标准自由能（ΔG°）。保护子链（从该引物双链体）的释放确保了此杂交反应关于熵是中性的并且对浓度是稳固的。因此，在一些实施例中，对于许多条件，在室温（例如约25°C或约298K）下进行的此反应比得上在接近熔融温度下达到的杂交的特异性。如在此所期望的，ΔG°（标准自由能的变化）“接近零”是指绝对值（量）小于或为约1kcal/mol、小于或为约2kcal/mol、小于或为约3kcal/mol，或者小于或为约3.5kcal/mol。在一些实施例中，平衡区或立足点区的标准自由能>-1kcal/mol到<1kcal/mol、>-3kcal/mol到<3kcal/mol或>-3.5kcal/mol到<3.5kcal/mol。引物双链体可以按约2:1到约5:1的保护子链与补体链的比率制备。在一些实施例中，保护子链与补体链的比率为约2:1、约3:1、约4:1或为约5:1。在一些实施例中，保护子链与补体链的比率为2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。这些引物双链体也可以与过量的保护子链一起用于在此描述的任何检验或反应中。该保护子链可以相对于该引物大致等于或超过2、5、10、20、50、100或500倍摩尔过量。发夹引物双链体系统（例如单链系统）在某些实施例中，一个引物双链体包括一个单个核酸，该核酸包含一个补体区或结构域、一个发夹区以及一个保护子区或结构域。在一些实施例中，该补体结构域与该保护子结构域杂交，形成了一个具有插入的发夹环区的引物双链体。与在此披露的其他引物系统相同，这些发夹引物系统被设计成与一个标靶核酸分子特异性杂交。在此，一个“发夹引物双链体系统”或一个“发夹系统”包括一个补体平衡区、一个补体分支移位区、一个立足点区、一个保护子平衡区及一个保护子分支移位区。如以上所描述，补体平衡区与保护子平衡区互补；补体分支移位区与保护子分支移位区和标靶核酸区互补；并且立足点区与标靶核酸区互补。保护子分支移位区对应于标靶核酸区并且与补体分支移位区互补。由于在此描述的发夹引物双链体系统是由单个核酸分子形成的，故补体平衡区的设计将取决于拟使用该引物系统的温度和浓度，如在此所描述。应了解的是，尽管可以使用该标靶核酸分子的序列来描述这些引物系统的特征，但在一些实施例中，该标靶核酸本身可以是或不是该引物系统（例如，两条链或单链的系统）的一种组分。对于具有一个发夹区的引物双链体来说，当对保护子链被该标靶核酸从补体链中置换的反应的标准自由能进行测定时，可以考虑该发夹区的限制的标准自由能。针对不同大小的发夹的发夹限制的标准自由能的近似值提供于表1中（来自圣塔卢西亚（SantaLucia）和希克斯（Hicks），生物物理学与生物分子结构年评（Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.）,33:414-440,（2004））。发夹大小发夹限制的ΔG°3nt3.5kcal/mol4nt3.5kcal/mol5nt3.3kcal/mol6nt4.0kcal/mol7nt4.2kcal/mol8nt4.3kcal/mol9nt4.5kcal/mol10nt4.6kcal/mol12nt5.0kcal/mol14nt5.1kcal/mol16nt5.3kcal/mol18nt5.5kcal/mol20nt5.7kcal/mol25nt6.1kcal/mol30nt6.3kcal/mol具有未提供于表1中的长度（例如，长度n）的发夹区的限制的标准自由能可以使用以下方程式估算：ΔGo(环-n)=ΔGo(环-x)+2.44RTln(n/x)其中ΔGo(环-n)是n个核苷酸长度的一个发夹区的限制的未知的标准自由能，ΔGo(环-x)是n个核苷酸长度的一个发夹区的限制的已知的标准自由能（例如，如表1所提供），R是理想气体常数，并且T是拟使用该引物双链体的温度。有关发夹区限制的标准自由能的计算的另外的信息提供于圣塔卢西亚和希克斯（同上）中，其全文以引用结合于此。在此描述的发夹引物双链体系统可以是至少两种定向中的一种。举例来说，在图2A中所示的一种定向中，立足点区位于核酸分子的5’端处。补体分支移位区的5’端紧邻该立足点区的3’端；补体平衡区的5’端紧邻该补体分支移位区的3’端；发夹区的5’端紧邻该补体平衡区的3’端；保护子平衡区的5’端紧邻该发夹区的3’端；并且保护子分支移位区的5’端紧邻该保护子平衡区的3’端。在这一定向中，当核酸分子经历容许退火的条件时，该发夹区形成一个环，该环从该补体平衡区和该保护子平衡区延伸。在图2B中所示的另一种定向中，该立足点区位于核酸分子的3’端处。补体分支移位区的3’端紧邻该立足点区的5’端；补体平衡区的3’端紧邻该补体分支移位区的5’端；发夹区的3’端紧邻该补体平衡区的5’端；保护子平衡区的3’端紧邻该发夹区的5’端；并且保护子分支移位区的3’端紧邻该保护子平衡区的5’端。不管定向如何，该发夹引物双链体系统的补体平衡区具有这样一种序列，该序列使得：其中：是该保护子平衡区与该补体平衡区的杂交的标准自由能；是该保护子平衡区与在第一方向上紧邻该标靶核酸序列的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；并且是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物系统的温度；c是拟使用该引物系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。其他引物系统另外的引物系统描绘于图4-7中。这些引物系统各自包括一个补体结构域和两个保护子结构域。该补体结构域具有一个单个立足点区，该区域侧接两个补体分支移位区和两个补体平衡区。这些保护子结构域各自包括一个保护子分支移位区，它具有与一个补体分支移位区的序列互补的一个序列；和一个保护子平衡区，它具有与一个补体平衡区的序列互补的一个序列。图4-7的引物系统之间的差异在于发夹区的数量和位置，而这又影响了补体平衡区的设计。与在此披露的其他引物系统相同，这些引物系统被设计成与一种标靶核酸特异性杂交。尽管使用了该标靶核酸的序列来描述引物系统的特征，但在一些实施例中，该标靶核酸并非引物系统的一种组分。如图4中所描绘，一个引物系统可以具有（按3′到5′的顺序）一个第一保护子结构域、一个第一发夹区、一个补体结构域、一个第二发夹区及一个第二保护子结构域。在这些实施例中，该第一保护子结构域包括一个第一保护子分支移位区和一个第一保护子平衡区。该第一保护子分支移位区具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列。该第一保护子平衡区紧邻该第一保护子分支移位区的5′，并且具有不对应于紧邻该标靶核酸序列上该第一标靶序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列。在这一实施例中，该第一发夹区紧邻该第一保护子平衡区的5′。这些标靶核酸的补体结构域包含一个第一补体平衡区、一个第一补体分支移位区、一个立足点区、一个第二补体分支移位区及一个第二补体平衡区。该第一补体平衡区紧邻该第一发夹区的5′，并且具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列。该第一补体分支移位区紧邻该第一补体平衡区的5′，并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列。该立足点区紧邻该第一补体分支移位区的5′，并且具有与一个第二标靶核酸序列互补的一个序列，该第二标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第一标靶核酸序列的3′。该第二补体分支移位区紧邻该立足点区的5′，并且具有与一个第三标靶核酸序列互补的一个序列，该第三标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第二标靶核酸序列的3′。该第二补体平衡区紧邻该第二补体分支移位区的5′，并且具有不与紧邻该标靶核酸序列上该第三标靶序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列。在这些实施例中，该第二发夹区紧邻该第二补体平衡区的5′。在这一实施例中，该第二保护子结构域包括一个第二保护子平衡区和一个第二保护子分支移位区。该第二保护子平衡区紧邻该第二发夹区的5′，并且具有与该第二补体平衡区互补的一个序列。该第二保护子分支移位区紧邻该第二保护子平衡区的5′，并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列。根据这一实施例，该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该第一发夹区的限制的标准自由能；是该第二发夹区的限制的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物系统的温度；并且c是拟使用该引物系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。如图5中所描绘，在某些实施例中，一种引物系统可以具有一种发夹引物和一种保护子，其中该发夹引物是一种核酸，该核酸包括一个第一保护子结构域、一个第一发夹区、一个补体结构域，并且该保护子是包括一个第二保护子结构域的一种核酸。在这些实施例中，该第一保护子结构域包括一个第一保护子分支移位区和一个第一保护子平衡区。该第一保护子分支移位区具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列。该第一保护子平衡区紧邻该第一保护子分支移位区的5′，并且具有不对应于紧邻该标靶核酸序列上该第一标靶序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列。在这一实施例中，该发夹区紧邻该第一保护子平衡区的5′。这些标靶核酸的补体结构域包含一个第一补体平衡区、一个第一补体分支移位区、一个立足点区、一个第二补体分支移位区及一个第二补体平衡区。该第一补体平衡区紧邻该发夹区的5′，并且具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列。该第一补体分支移位区紧邻该第一补体平衡区的5′，并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列。该立足点区紧邻该第一补体分支移位区的5′，并且具有与一个第二标靶核酸序列互补的一个序列，该第二标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第一标靶核酸序列的3′。该第二补体分支移位区紧邻该立足点区的5′，并且具有与一个第三标靶核酸序列互补的一个序列，该第三标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第二标靶核酸序列的3′。该第二补体平衡区紧邻该第二补体分支移位区的5′，并且具有不与紧邻该标靶核酸序列上该第三标靶序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列。在这一实施例中，该第二保护子结构域包括一个第二保护子平衡区和一个第二保护子分支移位区。该第二保护子平衡区具有与该第二补体平衡区互补的一个序列。该第二保护子分支移位区紧邻该第二保护子平衡区的5′，并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列。根据这一实施例，该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。如图6中所描绘，在某些实施例中，一种引物系统可以具有一种保护子和一种发夹引物，其中该发夹引物是包括一个第一保护子结构域的一种核酸，并且该发夹引物是一种核酸，该核酸包括一个补体结构域、发夹区及一个第二保护子结构域。在这些实施例中，该第一保护子结构域包括一个第一保护子分支移位区和一个第一保护子平衡区。该第一保护子分支移位区具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列。该第一保护子平衡区紧邻该第一保护子分支移位区的5′，并且具有不对应于紧邻该标靶核酸序列上该第一标靶序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列。这些标靶核酸的补体结构域包含一个第一补体平衡区、一个第一补体分支移位区、一个立足点区、一个第二补体分支移位区及一个第二补体平衡区。该第一补体平衡区具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列。该第一补体分支移位区紧邻该第一补体平衡区的5′，并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列。该立足点区紧邻该第一补体分支移位区的5′，并且具有与一个第二标靶核酸序列互补的一个序列，该第二标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第一标靶核酸序列的3′。该第二补体分支移位区紧邻该立足点区的5′，并且具有与一个第三标靶核酸序列互补的一个序列，该第三标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第二标靶核酸序列的3′。该第二补体平衡区紧邻该第二补体分支移位区的5′，并且具有不与紧邻该标靶核酸序列上该第三标靶序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列。根据这些实施例，该发夹区紧邻该第二补体平衡区的5′。在这一实施例中，该第二保护子结构域包括一个第二保护子平衡区和一个第二保护子分支移位区。该第二保护子平衡区紧邻该发夹区的5′，并且具有与该第二补体平衡区互补的一个序列。该第二保护子分支移位区紧邻该第二保护子平衡区的5′，并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列。根据这一实施例，该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；并且是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；是该发夹区的限制的标准自由能；并且是3.5kcal/mol。如图7中所描绘，在某些实施例中，一种引物系统可以具有一种第一保护子、一种补体引物及一种第二保护子，其中该第一保护子是包括一个第一保护子结构域的一种核酸，该补体引物是包括一个补体结构域的一种核酸，并且该第二保护子是包括一个第二保护子结构域的一种核酸。在这些实施例中，该第一保护子结构域包括一个第一保护子分支移位区和一个第一保护子平衡区。该第一保护子分支移位区具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列。该第一保护子平衡区紧邻该第一保护子分支移位区的5′，并且具有不对应于紧邻该标靶核酸序列上该第一标靶序列的5′的序列（如果有的话）的一个序列。这些标靶核酸的补体结构域包含一个第一补体平衡区、一个第一补体分支移位区、一个立足点区、一个第二补体分支移位区及一个第二补体平衡区。该第一补体平衡区具有与该第一保护子平衡区的序列互补的一个序列。该第一补体分支移位区紧邻该第一补体平衡区的5′，并且具有与一个第一保护子分支移位区互补的一个序列。该立足点区紧邻该第一补体分支移位区的5′，并且具有与一个第二标靶核酸序列互补的一个序列，该第二标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第一标靶核酸序列的3′。该第二补体分支移位区紧邻该立足点区的5′，并且具有与一个第三标靶核酸序列互补的一个序列，该第三标靶核酸序列紧邻该标靶核酸上该第二标靶核酸序列的3′。该第二补体平衡区紧邻该第二补体分支移位区的5′，并且具有不与紧邻该标靶核酸序列上该第三标靶序列的3′的序列（如果有的话）互补的一个序列。在这一实施例中，该第二保护子结构域包括一个第二保护子平衡区和一个第二保护子分支移位区。该第二保护子平衡区具有与该第二补体平衡区互补的一个序列。该第二保护子分支移位区紧邻该第二保护子平衡区的5′，并且具有与该第二补体分支移位区互补的一个序列。根据这一实施例，该第一补体平衡区和该第二补体平衡区具有这样的序列，这些序列使得：其中：是该第一保护子平衡区与该第一补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第一补体平衡区与紧邻该第一标靶核酸序列的5’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；是该第二保护子平衡区与该第二补体平衡区的杂交的标准自由能；是该第二补体平衡区与紧邻该第三标靶核酸序列的3’的序列（如果有的话）的杂交的标准自由能；并且是该立足点区与该第二标靶核酸序列的杂交的标准自由能；R是理想气体常数；T是拟使用该引物系统的温度；c是拟使用该引物系统的浓度；并且是3.5kcal/mol。缺少平衡结构域的引物双链体系统在一些实施例中，引物系统可以缺少平衡结构域。这些核酸在标靶核酸具有与该引物系统的立足点区的序列互补的一个序列时将以较快的动力学、但在该标靶核酸突变使得它不含与该引物系统的立足点区互补的一个序列时以较慢的动力学与该标靶核酸杂交。因此，这些引物系统可用于例如使用动力学差别对核酸标靶中的差异和/或突变进行定位。如图8中所描绘，在某些实施例中，一种引物系统可以包括一种核酸，该核酸具有（按3′到5′的顺序）一个第一保护子结构域、一个第一发夹区、一个补体结构域、一个第二发夹区以及一个第二保护子结构域。这些引物系统的第一保护子结构域具有对应于一个第一标靶核酸序列的一个序列。该第一发夹区紧邻该第一保护子结构域的5′。该补体结构域具有一个第一补体分支移位区、一个立足点区及一个第二补体分支移位区。该第一补体平衡区紧邻该第一发夹区的5′，并且具有与该第一保护子结构域的分支移位序列互补的一个序列。该立足点区紧邻该第一补体分支移位区的5′，并且具有与一个第二标靶核酸序列互补的一个序列，该第二标靶核酸序列紧邻该标靶核酸分子上该第一标靶核酸序列的3′。该第二补体分支移位区紧邻该立足点区的5′，并且具有与一个第三标靶核酸序列互补的一个序列，该第三标靶核酸序列紧邻该第二标靶核酸序列的3′。该第二发夹区紧邻该第二补体分支移位区的5′。该第二保护子结构域具有与该第二补体分支移位区的序列互补的一个序列。总体的引物修饰在此描述的每一引物都可以包含DNA、RNA或其类似物，和/或其组合。在某些实施例中，一种引物包含一个或多个非天然核苷酸。这些引物中非天然核苷酸的并入可以进一步增大引物双链体的性能。具体地说，保护子链尽管不打算用来起始转录，但可以恰巧与标靶的其他区域或者其他背景分子互补，并且可以假性地起始复制/转录。为了防止这一情况，在第二保护子链的3′端处使用一个非天然核苷酸或一个双脱氧核苷酸可以用来防止由该链引起的不期望的引发。非天然核苷酸的实例包括但不限于，异-C、异-G、脱氧尿苷（也参看克鲁格（Krueger）等人，化学与生物学（ChemBiol.）16:242-48（2009），其中有关非天然核苷酸的传授内容以引用结合于此）。在一些实施例中，例如，在使用了反复引发的酶促功能的聚合酶链反应（PCR）中，延伸的补体链可以变为随后的引物杂交的标靶。为了对于随后数轮扩增保持引物杂交的特异性，引物的平衡区不可以被复制。在补体链的分支移位区与平衡区之间的界面处引入一个非天然核苷酸例如可以防止该平衡区被复制。在某些实施例中，在此描述的引物用作聚合酶延伸的起点。为了便于对扩增的（核酸）片段进行分析，也可以在PCR反应中使用标记过的引物。标记过的引物是联接（或结合）到一个可检测部分的那些。实例包括荧光染料、放射性标记以及可鉴别的金属、核酸序列及蛋白质。当用经荧光标记的引物进行反应时，可以产生带有一个荧光标记的扩增子（核酸产物）。在此描述的引物可以通过本领域中已知的任何方法合成（参看例如，奥格威（Ogilvie）等人，美国化学协会杂志（J.Amer.Chem.Soc.）99(23):7741–7743；瑞兹C.B.（Reese,C.B.）四面体（Tetrahedron）34(21):3143（1978）；艾弗莫夫（Efimov）等人，核酸研究（NucleicAcidsRes.）11(23):8369–8387（1983）；盖雷格（Garegg）等人，四面体通讯（TetrahedronLett.）27(34):4051（1986）；比尤凯格（Beaucage）等人，四面体，48(12):2223（1992）；艾弗莫夫等人，核苷、核苷酸以及核酸（Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids）26(8–9):1087–93（2007），以引用结合于此）。标靶核酸分子“标靶”可以是一种单链（ss）或双链（ss）核酸。标靶核酸可以为例如DNA、RNA或者经历反转录的RNA的DNA产物。在一些实施例中，标靶可以为DNA与RNA的混合物（嵌合体）。在其他实施例中，标靶包含人工核酸类似物，例如肽核酸（尼尔森（Nielsen）等人，科学（Science）254(5037):1497-500（1991））或锁核酸（阿列克塞（Alexei）等人，四面体54(14):3607-30（1998））。在一些实施例中，标靶可以是天然存在的（例如基因组DNA）或者它可以为合成的（例如来自基因组库）。如在此所使用，“天然存在的”核酸序列是在无人类干预的情况下存在于自然界中的生物体或病毒的核酸分子中所存在的一种序列。在一些实施例中，标靶是基因组DNA、信使RNA、核糖体RNA、微RNA、前体微RNA、原微RNA、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在某些实施例中，标靶核酸是在一种生物体或病毒中天然存在的一种核酸。在一些实施例中，标靶核酸是一种致病性生物体或病毒的核酸。在某些实施例中，一个受试者体内标靶核酸的存在或不存在是该受试者患有一种疾病或病症或者易患一种疾病或病症的指示。在某些实施例中，一个受试者体内标靶核酸的存在或不存在是该受试者将对用以治疗一种疾病或病症的治疗（如一种药物）良好或较差地作出反应的指示。术语“聚核苷酸”、“核酸”与“核酸分子”可互换地使用。它们是指任何长度的核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物）的一种聚合形式。聚核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下为聚核苷酸的非限制性实例：一个基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析界定的基因座（loci/locus）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组聚核苷酸、分支的聚核苷酸、质粒、载体、分离的具有任何序列的DNA、分离的具有任何序列的RNA、核酸探针以及引物。聚核苷酸可以包含经过修饰的核苷酸（如甲基化核苷酸）和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在该聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。聚核苷酸可以进一步如通过与一个标记性组分结合来进行修饰。术语“重组”聚核苷酸意思是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的一种聚核苷酸，它不出现在自然界中或以一种非天然的安排与另一种聚核苷酸连接。术语“分离的核酸”是指天然或合成来源的一种聚核苷酸，或其某种组合，该聚核苷酸(1)不与在自然界中发现该“分离的核酸”的细胞关联，和/或(2)可操作地连接到它在自然界中所不连接的一种聚核苷酸。核酸还可以涵盖单链或双链DNA和RNA，以及含有经过修饰的碱基、糖以及主链的替代性核酸的任何和所有形式。因此，术语“核酸”将被理解为包括但不限于，单链或双链DNA或RNA（以及其可以呈部分单链或部分双链的形式）、cDNA、适体、肽核酸（“PNA”）、2'-5'DNA（具有一个缩短的主链的一种合成物质，它具有一个匹配DNA的A构象的碱基间距；2'-5'DNA正常地将不与呈B形式的DNA杂交，但它将易于与RNA杂交）及锁核酸（“LNA”）。核酸类似物包括天然核苷酸的已知类似物，这些类似物具有类似或改良的具有碱基配对特性的结合、杂交。嘌呤和嘧啶的“类似”形式在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷（queosine）、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸及2,6-二氨基嘌呤。在此提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3'-N-氨基甲酸酯、吗啉基氨基甲酸酯，以及肽核酸（PNA）、甲基膦酸酯键或交替的甲基膦酸酯与磷酸二酯键（斯特奥斯-索卡普（Strauss-Soukup），1997，生物化学（Biochemistry）36:8692-8698），以及苯甲基膦酸酯键，如美国专利号6,664,057中所论述的；还参看，寡核苷酸与类似物、实践方法（OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES,APRACTICALAPPROACH），F.艾克斯坦（F.Eckstein）编辑，牛津大学出版社的IRL出版社（IRLPressatOxfordUniversityPress）（1991）；反义策略（AntisenseStrategies），纽约科学院年报（AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences），第600卷，贝赛加（Baserga）和登哈特（Denhardt）编辑（NYAS1992）；米利根（Milligan），1993，药物化学杂志（J.Med.Chem.）36:1923-1937；反义研究与应用（AntisenseResearchandApplications）（1993，CRC出版社）。在此的这些核酸可以从细胞中提取，或根据本领域的技术人员已知的任何手段以合成方式制备；举例来说，这些核酸可以按化学方式合成，或由cDNA或mRNA转录或反转录，以及其他来源。如在此所使用，如果两个核酸或核酸区都与同一核酸序列互补，那么它们彼此“对应”。如果两个核酸或核酸区彼此碱基配对，形成一个双链核酸分子，那么它们彼此“互补”。在此利用的标靶核酸可以是任何核酸，例如人类核酸、细菌核酸或病毒核酸。标靶核酸样品可以为例如来自一种或多种细胞、组织或体液的一种核酸样品。标靶样品可以源自于任何来源，包括但不限于，真核细胞、植物、动物、脊椎动物、鱼、哺乳动物、人类、非人类、细菌、微生物、病毒、生物来源、血清、血浆、血液、尿液、精液、淋巴液、脑脊髓液、羊水、活组织检查、针吸活组织检查、癌症、肿瘤、组织、细胞、细胞溶解产物、粗细胞溶解产物、组织溶解产物、组织培养细胞、口腔拭子、漱口水、粪便、干化组织、法医来源、尸体剖检、考古来源、感染、医院感染、生产来源、药物制剂、生物分子生产、蛋白质制剂、脂质制剂、碳水化合物制剂、无生物、空气、土壤、树液、金属、化石、挖掘物和/或其他地球或地球外的物质和来源。该样品还可以含有来自一种来源或多种不同来源的物质的混合物。举例来说，当使用所披露的方法来扩增来自这些受感染的细胞或组织的核酸时，感染性细菌或病毒的核酸可以与人类核酸一起扩增。有用的标靶样品的类型包括真核样品、植物样品、动物样品、脊椎动物样品、鱼样品、哺乳动物样品、人类样品、非人类样品、细菌样品、微生物样品、病毒样品、生物样品、血清样品、血浆样品、血液样品、尿液样品、精液样品、淋巴液样品、脑脊髓液样品、羊水样品、活组织检查样品、针吸活组织检查样品、癌症样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞溶解产物样品、粗细胞溶解产物样品、组织溶解产物样品、组织培养细胞样品、口腔拭子样品、漱口水样品、粪便样品、干化组织样品、尸体剖检样品、考古样品、感染样品、医院感染样品、生产样品、药物制剂样品、生物分子生产样品、蛋白质制剂样品、脂质制剂样品、碳水化合物制剂样品、无生物样品、空气样品、土壤样品、树液样品、金属样品、化石样品、挖掘物样品和/或其他地球或地球外的样品。在一些实施例中，在此利用的标靶核酸包含重复序列、二级结构和/或高G/C含量。在某些实施例中，感兴趣的标靶核酸分子为约100到约1,000,000个核苷酸（nt）的长度。在一些实施例中，该标靶为约100到约1000、约1000到约10,000、约10,000到约100,000，或约100,000到约1,000,000个核苷酸的长度。在一些实施例中，该标靶为约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9000、约10,000、约20,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000、约100,000、约200,000、约300,000、约400,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约1,000,000个核苷酸的长度。应了解的是，该标靶核酸可以提供于一个更长的核酸的环境中（例如，如在一个染色体或一个染色体片段内的一个编码序列或基因）。在某些实施例中，感兴趣的标靶是线性的，而在其他实施例中，标靶是环状的（例如质粒DNA、线粒体DNA或质体DNA）。组合的引物-标靶系统在一些实施例中，在此提供了引物-标靶系统。一种引物-标靶系统包含一种或多种核酸标靶、一种聚合酶及一种或多种引物（例如引物双链体和/或发夹引物双链体）。术语“引物”涵盖在此描述的引物或引物系统中的任一种（例如，单链引物、双链引物双链体以及发夹引物双链体）。在某些实施例中，在此描述的引物-标靶系统包含多种不同的引物。在一些实施例中，一种引物-标靶系统可以包含至少两种引物，这些引物可以用于鉴别并且例如扩增标靶核酸分子。标靶核酸分子可以例如作为单拷贝或以低拷贝数存在于多种非标靶核酸分子之中。在此描述的任一个引物-标靶系统都可以包含与核酸扩增或测序反应中所用的那些类似的条件（例如，类似的试剂、反应温度等）。使用方法在此描述的引物系统能够通过一种热力学机制或通过一种动力学机制辨别特定标靶与假标靶。在使用一种热力学机制（描述于下）对标靶与假标靶进行区别时，将链置换反应进行到完成并且基于平衡结合亲和力的差异对该标靶与假标靶进行区别。为了使用一种动力学机制（描述于下）对标靶与假标靶进行区别，在达到平衡之前停止链置换反应，并且使用反应完成的速率差异来对这些标靶与假标靶进行区别。热力学分离热力学与动力学机制两者的总体策略是使用立足点交换链置换反应。总体说来，立足点交换涉及用一个不与标靶互补的另外的区域对标靶的补体进行延伸，并且使一个保护子链与这个延伸的补体链以及邻近该延伸的区域的大量碱基进行预杂交，但不与单链立足点区进行预杂交。图9描绘了立足点交换的一个实施方案。在这一实施方案中，使用了一种两条链的引物双链体系统（如以上所描述并且描绘于图1A中）来对标靶核酸与假标靶进行区别。该补体链的补体分支移位区和立足点区具有对应地对应于一个第一标靶序列和一个第二标靶序列的序列。补体平衡区被设计成与该立足点区呈相同的长度和核苷酸碱基分布。以此方式，图9A中所示的在正确的标靶与受保护的补体之间的链置换反应的标准自由能大约为ΔG°=0kcal/mol。该链置换反应可以写为：标靶+补体/保护子标靶/补体+保护子ΔG°通过以下关系式而与平衡常数Keq有关：ΔG°=RTln（Keq）。对于ΔG°=0的反应来说，平衡常数（Keq）为1。该平衡常数也与该平衡有关；对于这一反应来说，Keq=[TC][P]/[T][PC]=1。对于[PC]和[P]超过[T]的检验来说，[TC]/[T]=1，意味着所有标靶分子中有正好一半在平衡时杂交。在图9A中所示的实例中，ΔG°=+0.1kcal/mol，对应于Keq=0.85，这意味着46%的标靶分子在平衡时杂交。该保护子链相应地改变了用假标靶进行的链置换反应的标准自由能。在图9B中所示的实例中，该假标靶与正确的标靶有单个碱基不同，这使得用同一个两条链的核酸引物系统进行的链置换反应的ΔG°为+3.7kcal/mol，此对应于Keq=1.9*10-3。平衡时，只有0.19%的假标靶将与补体杂交。因此，图8中描绘的示例性核酸引物系统优先地结合于其标靶，对比只具有单个核苷酸错配的假标靶超过200倍。图10是平衡结合亲和力作为该反应的标准自由能的函数的曲线。当该反应的标准自由能的负值极小（如在纯杂交反应的情况下），标靶和假标靶都非常强地结合，并且很难对这两者进行区别，从而导致假阳性。另一方面，当该反应的标准自由能的正值很大时，该引物与该标靶非常弱地结合，从而导致假阴性。将一种引物双链体系统设计成具有接近零的标准自由能使得对标靶与假标靶进行最佳的辨别，藉此使假阳性和假阴性最少。动力学分离动力学分离依赖于立足点交换的动力学差异。立足点交换反应的动力学取决于这些立足点区的结合强度。立足点结合能的每一kcal/mol差异会影响动力学达5.4倍（图11），因此图9B中所示的+3.6kcal/mol的错配将产生434的动力学减速。与热力学辨别中不同，动力学辨别只在错配处于该立足点区中时才发生。在与补体分支移位区互补的位置处与正确的标靶不同的假标靶不太可能产生显著不同的反应动力学。因此，使用动力学机制来对标靶与假标靶进行区别的方法可作为精确定位标靶/引物错配的位置的一种手段与热力学分离一起使用。值得注意的是，缺少补体平衡区的引物双链体系统，如图8中所描绘的引物系统，可以用于采用动力学机制来精确定位标靶/引物错配的位置的方法中。微阵列核酸微阵列通常被用于高通量核酸检测，但通常不能对密切相关的核酸序列进行区别。在一些实施例中，在此描述的引物双链体系统可以用于核酸微阵列中，以便例如改良微阵列分析的特异性。在一些情况下，微阵列检验可以使用本领域中众所周知的方法进行，其中例外为，可以使用在此描述的引物双链体系统代替常规的核酸引物。举例来说，如图12A中所描绘，在某些实施例中，发夹引物双链体系统可以使用标准技术直接合成或固定在微阵列芯片上。在其他实施例中，一种两条链的引物双链体系统可以于核酸微阵列中使用。在一些实施例中，在预定的位置处包括两个可光裂解的碱基的发夹结构可以如图12A中一般合成。随后曝光使该发夹裂解，产生官能化到阵列表面的两条链的复合物（图12B）。也可以使用其他方法，如使用切刻或限制酶，来制备两条链的复合物。核酸合成反应，包括扩增反应在一些实施例中，可以使用在此披露的引物双链体和系统，通过用在此描述的引物双链体系统取代在本领域中已知的基于引物的扩增反应中的核酸引物来改良基于引物的扩增反应（包括聚合酶链反应（PCR）、链置换扩增或转录介导的扩增）的特异性。举例来说，如图13中所描绘，通过使用图4中所描绘的类型的发夹引物双链体系统作为PCR引物，有可能改良PCR的特异性用于多种（例如生物技术）应用。在此实例中，标靶核酸序列是通过以下方式扩增：形成一种溶液，该溶液包含具有该标靶核酸的一种引物双链体系统和用于进行扩增反应的多种标准试剂；并且在使得扩增反应发生的条件下孵育该溶液。在某些实施例中，将非天然碱基并入发夹引物双链体引物系统中，以便防止该发夹本身复制。在一些实施例中，在此描述的引物双链体可以适用于扩增标靶核酸，这些标靶核酸典型地需要通过以下PCR方法中的任一种或多种进行扩增：等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、解螺旋酶依赖性扩增、中间序列特异性PCR（ISSR）、反向PCR、连接介导的PCR、甲基化特异性PCR（MSP）、微小引物PCR、多重PCR、嵌套式PCR、重叠延伸PCR、定量PCR（Q-PCR）、反转录PCR（RT-PCR）、固相PCR、热不对称交错PCR（TAIL-PCR）或降落PCR。在一些情况下，在此描述的引物双链体和方法可以用于或适用于任一前述的PCR方法中，或者可以取代（用于替代）任一前述的PCR方法。有关前述每一PCR方法的简短说明提供于下。等位基因特异性PCR是一种基于单核苷酸多态性（SNP）（DNA中的单个碱基差异）的诊断或克隆技术。它典型地需要预先知晓DNA序列，包括等位基因之间的差异。组装PCR或聚合酶循环组装（PCA）是通过对具有较短重叠区段的一个长寡核苷酸池进行PCR的一种人工合成长DNA序列的方法。这些寡核苷酸在有义与反义方向之间交替，并且这些重叠区段决定了PCR片段的顺序，藉此选择性地产生最终的长DNA产物（斯特姆（Stemmer）等人，基因（Gene）164(1):49-53（1995））。不对称PCR优先地扩增双链DNA标靶中的一条DNA链。它可以用于测序和杂交探测中，其中两条互补链中只有一条需要扩增（伊尼斯（Innis）等人，美国国家科学院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）85(24):9436-40（1988））。解螺旋酶依赖性扩增类似于传统的PCR，但典型地使用一个恒定的温度而非通过变性和退火/延伸循环来进行循环。使用DNA解螺旋酶（一种使DNA展开的酶）代替热变性（文森特（Vincent）等人，欧洲分子生物学会报告（EMBOReports）5(8):795-800（2004））。中间序列特异性PCR（ISSR）是一种用于DNA指纹图谱分析的PCR方法，该方法对简单的序列重复之间的区域进行扩增，产生了扩增的片段长度的一个独特的指纹图谱（泽特凯维兹（Zietkiewicz）等人，基因组学（Genomics）20(2):176–83（1994））。反向PCR常被用于鉴别基因组插入片段周围的侧接序列。它涉及了一系列的DNA消化和自连接，从而在未知序列的任一端产生已知的序列（奥科曼（Ochman）等人，遗传学（Genetics）120(3):621–623（1988））。连接介导的PCR使用连接到感兴趣的DNA的小DNA连接子以及退火到这些DNA连接子的多种引物；它已被用于DNA测序、基因组步移及DNA足迹法（穆勒（Mueller）等人，科学（Science）246(4931):780–786（1988））。甲基化特异性PCR（MSP）被用于检测基因组DNA中CpG岛的甲基化。DNA首先用亚硫酸氢钠处理，该亚硫酸氢钠将未甲基化的胞嘧啶碱基转变成尿嘧啶，尿嘧啶被引物识别为胸腺嘧啶。微小引物PCR使用了一种热稳定性聚合酶（S-Tbr），并且被用于扩增保守的DNA序列，如16S（或真核18S）rRNA基因（艾森伯格（Isenbarger）等人，应用与环境微生物学（AppliedandEnvironmentalMicrobiology）74(3):840–9.（2008））。多重PCR一次性靶向多个基因，从单一测试运行得到另外的信息，否则将需要若干倍的试剂和更多的时间来进行。嵌套式PCR通过降低因DNA的非特异性扩增引起的背景来增加DNA扩增的特异性。在两个连续的PCR中使用两组引物。在第一个反应中，使用一个引物对来产生DNA产物，除期望的标靶外，这些产物可以仍然由非特异性扩增的DNA片段组成。然后，将这一种或多种产物用于一个用一组引物进行的第二PCR中，该组引物的结合位点完全或部分地不同于第一个反应中所使用的每一引物并位于所述每一引物的3'。重叠延伸PCR或重叠延伸剪接（SOE）是一种遗传工程技术，该技术被用于将含有互补序列的两个或两个以上DNA片段剪接在一起。它被用于对含有基因、调控序列或突变的DNA段进行连接；该技术能够产生特异性并且较长的DNA构建体。定量PCR（Q-PCR）被用于测量一种PCR产物的量（常为实时的）。它定量地测量DNA、cDNA或RNA的起始量。Q-PCR常用于确定一个DNA序列是否存在于一个样品中以及该样品中它的拷贝数。反转录PCR（RT-PCR）被用于从RNA扩增DNA。反转录酶将RNA反转录成cDNA，然后通过PCR进行扩增。RT-PCR被广泛用于表达谱分析中，用以测定一个基因的表达或鉴别一种RNA转录物的序列，包括转录起始和终止位点。如果一个基因的基因组DNA序列是已知的，那么可以使用RT-PCR来定位该基因中外显子和内含子的位置。一个基因的5'端（对应于转录起始位点）典型地通过RACE-PCR（cDNA末端快速扩增）来鉴别。固相PCR涵盖多种含义，包括聚合酶克隆扩增（其中PCR克隆是例如源于凝胶基质中）、桥式PCR（引物共价连接到一个固体支撑物的表面）、常规的固相PCR（其中在带有引物的固体支撑物的存在下应用不对称PCR，该引物的序列匹配一种水性引物）及增强的固相PCR（其中常规的固相PCR可以通过采用高熔融温度（Tm）和嵌套式固体支撑物引物并且任选地应用一个热‘步骤’来促成固体支撑物引发来进行改良）。热不对称交错PCR（TAIL-PCR）被用于对侧接一个已知序列的一个未知序列进行分离。在该已知的序列内，TAIL-PCR使用一个退火温度不同的嵌套的引物对；使用一种简并引物在该未知序列的另一个方向上进行扩增（刘（Liu）等人，基因组学（Genomics）25(3):674–81.（1995））。降落PCR（逐步减低的PCR）是PCR的一种变型，它旨在通过随着PCR循环进程，逐渐地降低退火温度来减小非特异性背景。在初始循环时的退火温度经常比所用引物的Tm高几度（3°C-5°C），而在后续循环时，它比该引物Tm低几度（3°C-5°C）。对于引物结合来说，更高的温度得到更强的特异性，并且更低的温度容许从初始循环期间所形成的特定产物进行更高效的扩增。反应溶液的温度可以在变性状态、退火状态以及延伸状态之间循序地循环预定数目的循环。实际时间和温度可以取决于酶、引物以及标靶。对于任何给定的反应，变性状态在某些实施例中可以在从约75°C到约100°C的范围内。退火温度和时间会影响引物结合于一种标靶核酸内的一个特定基因座的特异性和效率，并且对于特定PCR反应可能很重要。对于任何给定的反应，退火状态在某些实施例中可以在从约20°C到约75°C的范围内。在一些实施例中，该退火状态可以在约20°C到约25°C、约25°C到约30°C、约30°C到约35°C，或约35°C到约40°C、约40°C到约45°C、约45°C到约50°C下进行。在某些实施例中，该退火状态可以在室温（例如20°C或25°C）下进行。在一些实施例中，该退火状态可以在20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C或50°C的温度下进行。延伸温度和时间可以影响等位基因产物的产率并且被理解为是所研究的酶的固有特性。对于一种给定的酶，延伸状态在某些实施例中可以在从约60°C到约75°C的范围内。在任何前述实施例中，可以利用任何DNA或RNA聚合酶（催化核苷酸聚合成为一条核酸链的酶），包括热稳定性聚合酶和反转录酶（RTase）。实例包括嗜热脂肪杆菌聚合酶I、水生栖热菌（Taq）聚合酶I、强烈热球菌（Pfu）、沃斯氏热球菌（Pwo）、黄栖热菌（Tfl）、嗜热栖热菌（Tth）、海滨栖热菌（Tli）及海栖热袍菌（Tma）。这些酶、这些酶的修饰型式以及多种酶的组合可从厂家商购得到，包括罗氏公司（Roche）、英杰公司（Invitrogen）、凯杰公司（Qiagen）、斯特塔杰公司（Stratagene）及应用生物系统公司（AppliedBiosystems）。代表性酶包括（马萨诸塞州伊普斯维奇的纽英伦生物技术公司（NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA））、HotMasterTaqTM（艾本德公司（Eppendorf））、Mpx（菲尼酶公司（Finnzymes））、（富酶泰斯公司（Fermentas））、KOD（EMD生物科技公司（EMDBiosciences））、Z-Taq（塔卡拉公司（TAKARA））以及CS3AC/LA（密苏里州大学城的克伦塔公司（KlenTaq,UniversityCity,MO））。盐及缓冲液包括本领域的普通技术人员所熟悉的那些，包括对应地包含MgCl2和Tris-HCl及KCl的那些。缓冲液可以包含添加剂，如表面活性剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油、牛血清白蛋白（BSA）及聚乙二醇（PEG），以及本领域的普通技术人员所熟悉的其他添加剂。核苷酸一般为三磷酸脱氧核糖核苷，如三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧胞苷（dCTP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）以及三磷酸脱氧胸苷（dTTP），并且也适量添加到反应中用于扩增标靶核酸。在此还提供了多种方法，这些方法包括(1)使一种引物双链体的一个补体链与一种标靶核酸杂交，藉此将该补体链与其保护子链解离，并且(2)在一种聚合酶的存在下，以一种标靶互补的方式使该补体链在其3’端延伸。在此还提供了多种方法，这些方法包括在一种标靶核酸、一种聚合酶以及一种或多种在此描述的任一实施例的引物双链体的存在下，进行一种核酸合成反应。“核酸合成反应”是指合成核酸的任何反应。实例包括核酸扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或其变化型式（在此别处描述）、转录反应、反转录反应、边合成边测序或其他引物延伸反应（也参看，里扎迪（Lizardi）等人，自然-遗传学（Nat.Genet.）19:225-32（1998），以引用结合）。在一些情况下，提供了一种方法，该方法包括(1)合成一条补体链，该链具有一个标靶非特异性平衡区、一个标靶特异性分支移位区以及一个标靶特异性立足点区；(2)合成一条保护子链，该链具有一个与该补体链互补的平衡区和一个与该补体链互补的分支移位区；并且(3)使该补体链与该保护子链杂交以形成一种引物双链体。在一些情况下，提供了一种方法，该方法包括(1)提供一条补体链，该链具有一个标靶非特异性平衡区、一个标靶特异性分支移位区以及一个标靶特异性立足点区；(2)提供一条保护子链，该链具有一个与该补体链互补的平衡区和一个与该补体链互补的分支移位区；并且(3)将该补体链与该保护子链组合以形成一种引物双链体。在一些情况下，提供了一种方法，该方法包括(1)提供多个核酸分子，这些分子包含一种标靶核酸；(2)提供至少一种引物双链体，该双链体具有(i)一个平衡区、(ii)一个与该标靶核酸互补的分支移位区及(iii)一个立足点区；并且(3)在单个反应中，在适于核酸杂交的条件下，将该多个标靶核酸、至少一种引物双链体以及一种聚合酶组合。在此还提供了对至少一种感兴趣的标靶核酸进行扩增的方法，包括(1)提供多个核酸分子，这些分子包含至少一种标靶核酸；(2)提供至少一种引物双链体，该双链体具有(i)一个平衡区、(ii)一个分支移位区以及(iii)一个立足点区；并且(3)在单个反应中，在适于该至少一种标靶核酸扩增的条件下，将该多种标靶核酸分子、至少一种引物双链体及一种聚合酶组合。在某些实施例中，在单个反应中或在多个反应中（例如，在一个或多个多重化PCR扩增反应中）对多种独特的标靶核酸进行扩增。在一些实施例中，对约10到100、约100到约1000、约1000到约10,000，或约10,000到约100,000种核酸标靶进行扩增。一个反应中不同引物双链体的数目将取决于希望的标靶的数目。在一些实施例中，在此提供了对相对于一个标靶核酸分子具有一个或多个核苷酸变化的假核酸分子进行辨别的方法，该方法包括(1)提供多个核酸分子，这些分子包含至少一种标靶核酸；(2)提供至少一种引物双链体，该双链体具有(i)一个平衡区、(ii)一个分支移位区以及(iii)一个立足点区；并且(3)在单个反应中，在适于该至少一个标靶核酸分子扩增的条件下，将该多种标靶核酸分子、至少一种引物双链体及一种聚合酶组合。在此描述的任一方法可以进一步包括在单个反应中提供或组合以下一种或多种试剂：缓冲液（例如KCl、MgCl2、Tris-HCl）、dNTP（例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP，浓度为例如约50到约100μM）、聚合酶（例如，浓度为每50μl反应物约0.5-2.0个单位）和/或水。单个反应中一种引物双链体的每条链的浓度取决于例如标靶核酸的浓度而变化。在一些实施例中，可以使用约5到约50pg的质粒或病毒标靶，或者可以使用约50ng到约500ng的基因组标靶。在这些情况下，每一引物（第一链和第二链）的浓度可以为例如约0.05μM到约1μM。在多个特定实施例中，每一引物的浓度为约1nM到约1μM。在此描述的任一实施例中，单个反应可以经历循环的温度变化，这样使得一种dsDNA结构经受多轮的变性、随后的引物退火以及基于聚合酶的延伸，例如，类似于标准PCR所用的那些条件。在一些实施例中，变性步骤的温度范围是约90°C到约95°C。在某些实施例中，在循环之前，需要约1到约5分钟的初始变性步骤，确切的时间量可以取决于感兴趣的核酸标靶的GC含量。在某些实施例中，在一个循环反应期间，该变性步骤为约15到约30秒。在一些实施例中，退火步骤的温度范围是约50°C到约60°C。在一些实施例中，该退火步骤为约20°C到约40°C。在多个特定实施例中，该退火步骤是在室温（约20°C或约25°C）下。在某些实施例中，在一个循环反应期间，该退火步骤为约15到约30秒。在一些实施例中，延伸步骤的温度范围是约70°C到约75°C。在某些实施例中，在一个循环反应期间，该延伸步骤为约45到约60秒。一个循环反应的每一步骤的温度、时间及循环数目可以取决于感兴趣的核酸标靶的长度以及所使用的聚合酶。更长的标靶可能需要例如更长的延伸时间。对于一种500个核苷酸的标靶来说，循环条件的一个实例陈述于表2中。表2在此描述的任一实施例中，单个反应（例如核酸扩增）可以在室温（例如约20°C到约25°C）下进行。在某些实施例中，单个反应在室温下进行约1小时。在此描述的任一方法中，提供的一种引物双链体的第二保护子链可以超过第一互补链或超过退火的引物双链体。举例来说，在一些实施例中，该第二链是以约1×到约10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）该第一链浓度，或约1×到约10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）该退火的双链体浓度的浓度提供。在一些实施例中，该第一链是以约0.05μM到约1μM的浓度提供，而该第二链是以约0.10μM到约2μM，或约0.15μM到约3μM、约0.2μM到约4μM或约0.25μM到约5μM的浓度提供。在此描述的任一方法可以包含选自以下各项的方法：等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、解螺旋酶依赖性扩增、中间序列特异性PCR（ISSR）、反向PCR、连接介导的PCR、甲基化特异性PCR（MSP）、微小引物PCR、多重PCR、嵌套式PCR、重叠延伸PCR、定量PCR（Q-PCR）、反转录PCR（RT-PCR）、固相PCR、热不对称交错PCR（TAIL-PCR）以及降落PCR。在此描述的任一方法中，扩增的核酸标靶的产率可以为约30%到约100%。在一些实施例中，该产率为至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少100%。在此描述的任一方法中，扩增的核酸产物可以进行纯化。核酸纯化方法是本领域的普通技术人员众所周知的，并且包括酚提取、异硫氰酸胍、醇沉淀、DEAE（离子交换）、尺寸排阻色谱（SEC）、氯化铯、从琼脂糖提取、二氧化硅以及其他基于柱的纯化方法。在此描述的任一方法中，经过纯化的扩增的核酸标靶可以为约30%到约100%纯。在一些实施例中，该纯度为至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少100%纯。成像在此描述的引物双链体及系统还可以用于改良原位成像检验的特异性。生物RNA与荧光团标记的引物之间的非特异性相互作用常常是背景噪声的来源。因此，如图14中所描绘，使用在此描述的荧光团标记的核酸引物系统代替常规的引物在一些实施例中极大地改良了现有原位成像技术的性能。值得注意的是，通过用荧光团标记补体链或结构域并且用淬灭剂标记保护子链或结构域，当该引物双链体系统结合于标靶时，它将只产生一个可检测信号。单核苷酸多态性（SNP）检测单核苷酸多态性（SNP）的位置和身份的精确检测对于研究和治疗目的是特别受关注的。因此，在此描述的动力学辨别方法可用于便利的鉴别SNP。试剂盒在此提供了多种试剂盒，这些试剂盒包括(1)至少一个补体链，该链具有一个平衡区、一个分支移位区以及一个立足点区；及(2)至少一个保护子链，该链具有一个平衡区及一个分支移位区。在此提供了多种试剂盒，这些试剂盒包括至少一种引物双链体，该双链体包含(1)至少一个补体链或区，它具有一个平衡区、一个分支移位区以及一个立足点区；及(2)至少一个保护子链或区，它具有一个平衡区及一个分支移位区。在此描述的任一试剂盒可以进一步包含一种聚合酶。在此提供的任一试剂盒可以进一步包含一种或多种选自以下各项的试剂：缓冲液（例如KCl、MgCl2、Tris-HCl）、dNTP（例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP）以及水。在此提供的任一试剂盒可以包含保护子链，其摩尔量超过引物。在此提供的任一试剂盒可以进一步包含说明书或指导，用于获得有关使用这些试剂盒的组分的说明（例如来自网站）。在此提供的任一试剂盒可以进一步包括至少一个反应管、孔、腔室等。在此描述的任一引物或引物系统可以呈试剂盒的形式提供或包含在一个试剂盒内。实例根据本发明，PCR、转录以及反转录的以上局限性可以通过使用高特异性的引物双链体来克服。在此描述的实验论证了，引物双链体可以对具有单碱基变化的标靶（对于DNA和RNA标靶）（图16）及引物（图17）可靠地进行辨别。正确的标靶以大约50%的产率与7/5的引物杂交，但即使是大量过量（200×）的具有单碱基变化的标靶也不足以显著地杂交。针对多种不同的标靶对引物双链体进行设计并测试，并且每一引物双链体都相对于单核苷酸变化达到了高辨别因子（图17）。定量地，与具有单核苷酸变化的假标靶的杂交产率的中值辨别力为26。在原理实证的论证中，使用了这些引物双链体进行PCR（图18A和18B）。设计出一种半重复的标靶核酸，该核酸很难通过传统的PCR（不使用本发明的引物双链体的PCR）进行扩增。对标准的21个核苷酸的引物和这些引物双链体的产率进行计算。确定许多不同的热循环规程以便调查功能的范围。基于这些引物双链体的长度和核苷酸含量，标准的PCR条件将预测出这些引物的退火温度会为55°C。意外的是，作为一个实例，即使在对引物双链体退火最不利的条件（35°C和40°C）下，使用这些引物双链体扩增的正确长度的产物的分数（50.2%）也高于在其最有利的PCR条件（45°C）下使用标准引物扩增的正确长度的引物的分数（31.0%）。此外，在这一特定实验中，这些引物双链体经任意地设计（7个核苷酸立足点区和5个核苷酸平衡区），并且没有针对PCR产率性能进行优化。因此，可能的情况是，可以通过本发明的引物双链体的优化来达到甚至更高的PCR特异性。图15示出了使用在此提供的引物双链体进行的高特异性PCR。在图5A中，引物“PC”包含一个补体链“C”和一个保护子链“P”。当PC结合于期望的标靶的正确的位置“X”时，单链保护子寡核苷酸“P”作为一种惰性废产物释放，并且引发的标靶通过DNA聚合酶而伸长。在图5B中，当引物PC结合于非期望的标靶或正确的标靶的不正确的位置（在任一情况下，表示为“Y”）时，从补体链“C”中置换保护子在热力学上是不利的，并且在动力学上迅速发生逆转。因此，预期脱靶的扩增（例如，Y而非X的扩增）将显著地减少。图16示出了具有单个核苷酸辨别力的引物杂交的实验论证。在图16A中，短的合成DNA标靶“X”或假标靶“Y”与引物反应。（在保护子链“P”上的聚T尾用来将产物与凝胶上的反应物相区别。）红色框示出了假标靶Y的单碱基变化的位置。图16B示出了天然的聚丙酰胺凝胶的结果。引物“PC”是以2:1的保护子P与补体C的比率制备，并且在1μM浓度的PC下退火。添加正确标靶或假标靶以达到200nM的标靶（X或Y）、100nM的PC以及100nM的P的最终浓度。在一些实施例中，反应可以具有过量的保护子（P）引物。举例来说，在一些实施例中，该保护子链是以约1×到约10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）补体链的浓度提供。所有反应都在室温（25°C）下进行1小时。作为一个实例，标示“7/4”表示一种引物，该引物拥有7个核苷酸的单链核苷酸（呈3’突出物形式）来起始与标靶的杂交，并且保护子自发地解离，释放出4个核苷酸。图16C是由图16B中所示数据推断的杂交产率的曲线图。作为曲线“X”示出的是引物与正确的标靶X的杂交，而其余“虚线的”曲线示出了与假标靶Y的杂交。7/4、7/5及7/6引物都在其杂交产率（χ）方面对正确标靶与假标靶进行辨别。7/0的标靶则不然。在图16D中，辨别因子（Q）是对引物特异性的定量的度量，并且是按正确标靶的杂交产率（χ）除以假标靶的杂交产率（χ）来计算。在16E中，7/5引物与假标靶Y存在极少杂交，即使在这种标靶是以大量过量（即200倍）存在时仍然如此。图17示出了有关引物双链体的单碱基辨别能力的另外的实验结果和统计学。图17A示出了对四种另外的标靶和多组引物进行构建并测试：两种基于天然存在的微RNA序列，两种被设计成有意地具有显著的二级结构。图17B示出了针对每一标靶由7/5引物所达到的辨别因子（Q）的柱状图。由于凝胶扫描仪的局限性，不可能可靠地测量超过100的辨别因子，并且这些都分组为“100+”。图17C示出了RNA标靶和引物。该标靶序列是其序列与人类let7g微RNA相同的一种合成RNA寡核苷酸。图17D示出了天然PAGE的结果。PC引物是以2:1的保护子P与补体C的比率制备，并且在3μM的浓度下退火。添加正确标靶或假标靶以达到2μM的X或Y、1μM的PC以及1μM的P的最终浓度。该正确标靶成功地结合于引物；带有单核苷酸错配的标靶的杂交产率较低。图18示出了使用双链体引物改良一种准重复标靶的PCR产率的实验结果。图18A示出了一种准重复PCR标靶（168nt），传统的PCR引物难于以高产率对其进行扩增。此处，a*是针对X1的正确标靶。标为a*m1（它为X1-m17G）、a*m2（它为X1-m9T）以及a*m3（它为X1-m11G）的其余位点都不是正确标靶。类似地，b*是针对X2的正确标靶，并且b*m1（它为X2-m3T）、b*m2（它为X2-m11C）以及b*m3（它为X2-m18T）不是正确标靶。因此，最外面的结合位点是引物的完美结合位点，但在这些完美位点之间还存在3个另外的单碱基错配引物结合位点。这些引物双链体通过7个核苷酸结合于该标靶，并且保护子必须自发地解离，释放出5个核苷酸。该引物双链体被设计成使得其3’端无法通过聚合酶延伸。补体链的立足点区被设计在3’端而非先前设计中的5’端。在图18B中，如与标准引物相比较，引物双链体显示出显著更高的正确长度产物的产率。每一泳道都用所用引物以及温度循环规程进行标记（例如，“98-40-72”指示在98°C下变性、在40°C下退火并在72°C下伸长）。最左边的泳道示出了合成的寡核苷酸参照物。标为“正确%”的下方数字指示了对应于正确长度产物的谱带相较于泳道中所有谱带的积分强度的相对强度。引物双链体PCR产物呈现为比参照物和标准PCR产物长10个核苷酸，因为每一引物上有5个核苷酸的突出物（立足点区）。等效物本领域的普通技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定在此描述的具体实施例的许多等效形式。冠词“一个（种）”（a/an）在此用于指一个（种）或超过一个（种）（即，至少一个（种））的该冠词的语法宾语。举例来说，“一个要素”意思指一个要素或超过一个要素。除非作相反指示或另外从上下文明显可见，否则如果一组中一个、超过一个或所有组内成员存在于、用于或以其他方式相关于一种给定的产物或方法，那么认为在该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求项或描述得到满足。本发明包括该组的正好一个成员存在于、用于或以其他方式相关于一种给定的产物或方法的实施例。本发明包括该组的超过一个或所有成员存在于、用于或者以其他方式相关于一种给定的产物或方法的实施例。另外，应了解的是，本发明涵盖将所列的一个或多个权利要求项中的一个或多个限定、要素、条款、说明性术语等引入另一权利要求项中的所有变化、组合以及变更。举例来说，可以对附属于另一权利要求项的任一权利要求项加以修改，以使其包括一个或多个在附属于同一基础权利要求项的任何其他权利要求项中所见的限定。在要素是以例如马库西组（Markushgroup）格式等清单呈现的情况下，应了解的是，也披露了这些要素的各个亚组，并且可以从该组中去除任何要素。应当了解的是，总体来说，在本发明或本发明的多个方面提到包含特定要素、特征的情况下，本发明的某些实施例或本发明的多个方面由或主要由这些要素和/或特征组成。为简单起见，那些实施例未在此以文字具体地陈述。还应注意，术语“包含”意图为开放式的，并且容许包括另外的要素或步骤。当给定范围时，包括端点在内。另外，应了解的是，除非另作指示，或者另外从上下文以及本领域的普通技术人员的理解明显可见，否则以范围表示的值在本发明的不同实施例中可以采用所规定的范围内的任何特定值或子范围，除非上下文中另作清楚地指示，否则精确到该范围下限单位的十分之一。如在此所使用，术语“约”总体上可以指在所叙述的值加减10%范围内的任何值。然而，在一些情况下，“约”可以涵盖所叙述的值加减20%的范围。此外，应了解的是，在现有技术内的本发明的任何特定实施例都可以明确地从任一个或多个权利要求项中排除。由于这些实施例被认为是本领域的普通技术人员已知的，故可以将其排除，即使在此未明确地陈述该排除也如此。本发明方法的任何特定的实施例都可以出于任何原因从任一个或多个权利要求项中排除，无论是否涉及现有技术的存在。本发明并未将其应用局限于以下说明中所陈述或附图中所图示的组分的构建和安排的细节。本发明能够具有其他实施例并且以不同的方式实践或进行。此外，在此使用的措辞和术语都是出于说明的目的，并不应当被视为限制。在此使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含”、“涉及”及其变化形式打算涵盖其后所列的多项和其等效形式，以及其他多项。前述专利、专利申请及参考文献，特别是在此参考的传授内容各自以引用结合于此。[1]皮特森M.（Petersen,M.）和文格尔J.（Wengel,J.），LNA：治疗学和基因组学的通用工具（LNA:aversatiletoolfortherapeuticsandgenomics）.生物技术趋势（TrendsBiotechnol.）21,74-81,（2003）。[2]克鲁格A.T.（Krueger,A.T.）和库尔E.T.（Kool,E.T.），碱基对结构的重新设计：为了新基因组的生物化学与生物功能（RedesigningtheArchitectureoftheBasePair:TowardBiochemicalandBiologicalFunctionofNewGeneticSets）.化学与生物学（ChemBiol.）16,242-248（2009）。[3]里扎迪P.M.（Lizardi,P.M.）等人，使用等温滚环扩增进行的突变检测和单分子计数（Mutationdetectionandsingle-moleculecountingusingisothermalrolling-circleamplification）.自然-遗传学（Nat.Genet.）19,225-232（1998）。[4]佐伯R.K.（Saiki,R.K.），盖尔福德D.H.（Gelfand,D.H.），斯托菲S.（Stoffel,S.），斯查夫S.J.（Scharf,S.J.），通口R.（Higuchi,R.），霍恩G.T.（Horn,G.T.），穆利斯K.B.（Mullis,K.B.）以及艾里奇H.A.（Erlich,H.A.），用热稳定性DNA聚合酶进行的DNA的引物引导的酶促扩增（Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase）.科学（Science）239,487-491（1988）。[5]张D.Y.（Zhang,D.Y.），陈X.（Chen,X.）以及尹P.（Yin,P.），优化核酸杂交特异性（OptimizingNucleicAcidHybridizationSpecificity）.已提交（2011）。当前第1页1 2 3