纯化莱鲍迪甙C的方法
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南美多年生甜菊(SteviarebaudianaBertoni)由于其作为自然甜味剂而为人所知。甜菊植物的甜味是由于存在高甜度的甜糖苷。来源于甜菊的糖苷(甜菊糖苷)包括甜菊甙(4-13％干重)，莱鲍迪甙(Rebaudioside)A(2-4％)，莱鲍迪甙C(1-2％)，杜尔可苷(dulcoside)A(0.4-0.7％)和痕量的甜菊双糖甙、甜茶甙(rubusoside)和莱鲍迪甙B、D、E及F(Kinghorn(2002)Kinghorn(ed.)Stevia，甜菊属药用和芳香植物-工业简介(theGenusStevia.MedicinalandAromaticPlants-IndustrialProfiles)，第19卷TaylorandFrancis，LondonandNY)。在这些苷类之中，现在仅有甜菊甙和莱鲍迪甙A商业上可大量提供。制造甜菊甙和莱鲍迪甙A的原料为多年生灌木的碎叶。获得包含甜菊糖苷(steviolglycoside)的萃取物的常规萃取方法公开于按照如下类似方法的文献中：甜菊叶用热水或醇类萃取，萃取物通过用盐或碱溶液沉淀和浓缩来纯化，且萃取物再溶解于低级醇(甲醇或乙醇)中以结晶该苷类。已开发出用于萃取莱鲍迪甙C的方法。WO2011/037959公开了纯化莱鲍迪甙C的方法，通过在混合溶剂(95％EtOH/MeOH/H2O＝12.5/6/2)，或(95％丙醇/MeOH＝12.5/7.5)中回流甜菊粗萃取物固体或粗莱鲍迪甙C固体。溶液接下来冷却至22℃并用93-98％纯的莱鲍迪甙C晶体作为晶种。所得的混合物在22℃下放置16小时，并且过滤白色的晶体产品，用EtOH/MeOH(4/1)混合物洗涤两次并干燥得到纯的莱鲍迪甙C产品。该方法主要的缺点在于需要高纯度的莱鲍迪甙C以诱导纯化。另外，该方法的产率以及所得物质的纯度未公开。中国专利No.102127130公开了纯化莱鲍迪甙C的方法，通过将包含大约17％的莱鲍迪甙C的粗溶液通过超滤膜以生成具有26％莱鲍迪甙C含量的馏分。该馏分在55℃下浓缩直至固体含量达到40％。然后，液体和固体进行分离，使得固体中包含大约33％的莱鲍迪甙C。该粗品莱鲍迪甙C通过在混合溶剂(87％EtOH/68％MeOH/87％丙酮＝3/2/1)中重结晶而进一步纯化，所得莱鲍迪甙C的纯度为85.4％。用来生产和纯化莱鲍迪甙C的常规方法需要多个反应步骤或反复纯化步骤。需要一种用于制备高纯度莱鲍迪甙C的简单、有效和经济的方法，所述莱鲍迪甙C可用于食品、饮料、药品、化妆品和其他工业。发明概述本发明涉及一种纯化莱鲍迪甙C的方法。本发明的方法包括以下步骤：(a)用乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的物质；(b)保留乙酸乙酯和1-丁醇的可溶部分；(c)将乙酸乙酯和1-丁醇可溶部分与丙酮和水的溶液接触以重结晶莱鲍迪甙C；以及(d)收集重结晶的莱鲍迪甙C从而纯化莱鲍迪甙C。在一些实施方式中，乙酸乙酯∶1-丁醇的比例为60-70∶30-40，以及丙酮∶水的比例为80-90∶10-20。在其它实施方式中，包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的物质为四氢呋喃和水的溶液，其中四氢呋喃∶水的比例为20-30∶70-80。在进一步的实施方式中，该方法包括用乙酸乙酯∶1-丁醇(80-90∶10-20)的第一溶液萃取包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的物质的预步骤，并丢弃掉乙酸乙酯∶1-丁醇可溶部分。在更进一步的实施方式中，该方法包括将重结晶莱鲍迪甙C进行第二次重结晶的额外步骤，其中第二次重结晶使用1-丁醇∶水(97∶3)的溶液。在另一个实施方式中，重结晶的莱鲍迪甙C使用丙酮∶水(85∶15)的溶液洗涤。发明详述如表1所示，对莱鲍迪甙A生产过程中产生的废料进行HPLC分析，其包含大约17％的莱鲍迪甙A和20％的莱鲍迪甙C以及其他苷类。表1保留时间(分钟)组分总百分比15.974未知16.1321.631未知1.9522.194未知0.1924.425莱鲍迪甙A17.1824.840甜菊甙20.7925.801未知0.2726.187莱鲍迪甙F2.8826.800莱鲍迪甙C20.9827.444杜尔可甙A2.7427.854未知0.2728.451甜菊甙异构体2.9030.420甜茶甙1.6832.133未知5.9033.221甜菊双糖甙6.14已知在″废料″中的莱鲍迪甙C百分比高，而且莱鲍迪甙C可用作甜味剂，本发明特征在于一种获得高纯度莱鲍迪甙C的方法，起始自在莱鲍迪甙A生产过程中所产生的″废料″。根据本发明的方法，包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的物质使用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液进行萃取，以及保留乙酸乙酯/1-丁醇的可溶部分。然后，莱鲍迪甙C从乙酸乙酯/1-丁醇可溶部分用丙酮/水溶液重结晶，以及收集重结晶的莱鲍迪甙C。有利地，本发明的方法在不存在纯的莱鲍迪甙C晶体作晶种下进行。在本方法的上下文中使用的，″一种包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的物质″为起始原料，尤其是甜菊萃取物或甜菊萃取物馏分，其中已除去全部或部分的莱鲍迪甙A。在一个实施方式中，本发明方法的起始原料中40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的原始量的莱鲍迪甙A已除去。为了说明，其中甜菊叶具有为莱鲍迪甙C(1-2％)至少两倍量的莱鲍迪甙A(2-4％)，包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的原料可包含等量的莱鲍迪甙C和莱鲍迪甙A，或莱鲍迪甙A少于莱鲍迪甙C。在一些实施方式中，本发明的方法的起始原料为″来自甜菊的物质″，其包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A。在其它的实施方式中，起始原料为甜菊萃取物或通过常规方法制备的甜菊萃取物的馏分。起始原料可以固体、半固体或液体形式获得。当为固体或半固体形式时，理想的是将起始原料溶于合适的溶剂中以便于液相-液相萃取。在该方面，特定的实施方式包含起始原料，所述起始原料为包含莱鲍迪甙C和减少的莱鲍迪甙A的溶液。如本文所述，固体起始原料易于溶于四氢呋喃(THF)和水的溶液。因此，预期具有与THF类似极性的溶剂，如乙酸正丁酯、异丁醇、甲基异戊基酮或正丙醇，也可用于本发明的方法作为溶解起始原料的溶剂。然而，在特定实施方式中，起始原料溶于四氢呋喃(THF)和水的溶液。按照该实施方式，THF与水的比例为20-30∶70-80(体积/体积(v/v))的范围。在优选实施方式中，THF与水的比例为25∶75(v/v)。为了富集莱鲍迪甙C，对起始原料进行液相-液相萃取。按照本发明的方法的该步骤，起始原料用一种或多种乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取一遍或多遍。在一些实施方式中，起始原料用包含乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取一遍或多遍，其中乙酸乙酯和1-丁醇的比例为60-70∶30-40(v/v)。特别的，该实施方式包含乙酸乙酯和1-丁醇的比例为75∶35(v/v)。在其它实施方式中，低极性化合物首先通过用包含乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料一遍或多遍而除去，其中乙酸乙酯和1-丁醇的比例为80-90∶10-20(v/v)。按照该实施方式，抛弃乙酸乙酯/1-丁醇可溶部分且保留物用乙酸乙酯和1-丁醇的第二溶液进一步萃取。因此，在一个实施方式中，用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料包括以下步骤：(i)用包含60-70∶30-40比例的乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取起始原料；以及(ii)保留(i)中的乙酸乙酯/1-丁醇馏分。在可选择的实施方式中，用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料包括以下步骤：(i)用包含80-90∶10-20比例的乙酸乙酯和1-丁醇的第一溶液萃取起始原料，(ii)抛弃乙酸乙酯/1-丁醇馏分；(iii)用包含60-70∶30-40比例的乙酸乙酯和1-丁醇的第二溶液萃取(ii)中的保留物；以及(iv)保留(iv)的乙酸乙酯/1-丁醇馏分。当起始原料能用乙酸乙酯/1-丁醇溶液萃取时，可使用其它的合适溶剂，包括例如2-丁酮、正丙醇、乙酸正丁酯和异丙醇，单独使用或彼此联合或与乙酸乙酯或1-丁醇联合使用。根据本发明方法的下一个步骤，液相-液相萃取的物质或乙酸乙酯和1-丁醇可溶部分与丙酮和水的溶液接触以重结晶莱鲍迪甙C。在一些实施方式中，丙酮与水的比例为80-90∶10-20(重量/重量(w/w))。在某些实施方式中，丙酮与水的比例为85∶15(w/w)。除了丙酮，预期其它的溶剂例如乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、2-丁醇、叔丁醇或其混合物可用于重结晶莱鲍迪甙C。为了便于重结晶，混合物可加热至40℃至60℃的升高的温度，或更优选在45℃至50℃之间，以及然后冷却至接近室温(例如19-22℃)。形成晶体时，例如，通过过滤收集重结晶的莱鲍迪甙C，且可干燥用于储存。在另一个实施方式中，重结晶的莱鲍迪甙C可洗涤以进一步富集莱鲍迪甙C。按照该实施方式，重结晶的莱鲍迪甙C用比例为85∶15的丙酮∶水溶液洗涤。混合物可加热至40℃至60℃的升高的温度，或更优选在45℃至50℃之间持续约1至3小时，更优选2小时，然后冷却至接近室温(例如19-22℃)。然后过滤混合物以收集固体莱鲍迪甙C。通过包括该步骤，莱鲍迪甙C的量可富集至大于90％。在进一步的实施方式中，本发明的方法可包括将重结晶的莱鲍迪甙C进行第二次重结晶的步骤，其中第二次重结晶为1-丁醇∶水(97∶3)的溶液。按照本发明的方法纯化的莱鲍迪甙C为70-100％匀质莱鲍迪甙C，且发现可在多种食品、膳食补充剂、营养食品、药物组合物、口腔卫生组合物、餐桌甜品和化妆品中用作甜味剂。另外本发明的莱鲍迪甙C可用于制备消耗品，例如食物和药品，其保留了合意的甜度但含有较少量的碳水化合物甜味剂，例如蔗糖，且在某些情况下更少的卡路里。本发明通过以下非限制实施例更详细的描述。实施例1；从粗萃取物中初始纯化莱鲍迪甙C用多种不同的溶剂体系，观察到丙酮和水的混合物为从粗起始原料(即，产生于莱鲍迪甙A生产工艺中的″废料″)中重结晶莱鲍迪甙C的适宜溶剂。因此，测定从起始原料中重结晶莱鲍迪甙C的收率。对于这些实验，粗起始原料与丙酮/水(85/15，w/w)混合。典型地，对于1g的固体，使用4-6g的溶剂。混合物加热至48℃并且使得所有固体溶解。混合物冷却至室温并搅拌3-4天。过滤溶液收集白色沉淀，其然后用丙酮洗涤并在真空下50℃干燥8小时。表2粗起始原料的量粗品中RebC含量获得固体的量固体中RebC含量RebC回收收率5g24.5％0.9g77.0％56.6％5g32.5％1.4g69.6％60.0％5g32.5％1.3g76％60.8％20g32.5％5.2g75.6％60.5％6.0g36.4％1.84g76.8％64.7％6.84g40.7％2.37g74.3％63.2％16g44.0％6.34g80.0％72.0％14g44.0％6.08g81.7％80.6％RebC，莱鲍迪甙C.该分析显示″废料″用于直接重结晶莱鲍迪甙C时不是最适宜的，且包含更高含量的莱鲍迪甙C的起始原料，所得固体具有更高的纯度及收率。因此，为了增加纯度和收率，起始原料用不同溶剂进行液相-液相萃取。20克的莱鲍迪甙C起始原料溶解于含有70-80的水(v/v)的500ml丙酮中。溶液用500ml含有15％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯萃取两遍。1-丁醇/乙酸乙酯层主要含有极性较小的化合物并因此而抛弃。然后，丙酮/水相用500ml含有30-40％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯进一步萃取两遍。乙酸乙酯/1-丁醇层合并，且在真空下浓缩以提供富集的莱鲍迪甙C物质。所得产率和用丙酮/水和乙酸乙酯/1-丁醇进行液相-液相萃取的含量列于表3中。表3在其它一系列实验中，20克的起始原料溶解于500ml的THF中，其含有65-80的水(v/v)。溶液用500ml的含有15％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯萃取两遍。乙酸乙酯/1-丁醇层主要含有极性较小的化合物并因此而抛弃。然后，THF/水相用500ml含有30-40％的1-丁醇的乙酸乙酯(v/v)进一步萃取两遍。1-丁醇/乙酸乙酯层合并，且在真空下浓缩以提供富集的莱鲍迪甙C物质。所得产率和用THF/水和乙酸乙酯/1-丁醇进行液相-液相萃取的含量列于表4中。表4该分析显示当使用THF/水作为起始原料的溶剂时，莱鲍迪甙C的含量和回收最高，其中THF∶水的比例在20-30∶70-80范围内。另外，该分析显示合适的乙酸乙酯∶1-丁醇比例在60-70∶30-40的范围内。实施例2：纯化莱鲍迪甙C20克的起始原料溶解于500ml含有70-80％(优选75％(v/v))的水的THF/水混合物中。所得溶液用500ml的乙酸乙酯/1-丁醇混合物(85/15，v/v)萃取两遍。除去1-丁醇/乙酸乙酯层。然后，THF-水相进一步用500ml的乙酸乙酯/丁醇混合物萃取两遍，该混合物含有30-40％的1-丁醇，优选35％(v/v)。合并两遍萃取的乙酸乙酯/丁醇层并在真空下浓缩以得到8.70g的物质。通过HPLC分析确定该物质中莱鲍迪甙C的含量达到24.5％(表5)。表5保留时间(分钟)组分总百分比12.702未知1.1015.722未知4.6218.547未知4.2022.811未知1.0624.473莱鲍迪甙A16.7324.931甜菊甙25.2625.780未知0.1526.197莱鲍迪甙F2.8126.968莱鲍迪甙C24.5027.562杜尔可甙A3.4427.951未知0.2228.579甜菊甙异构体3.7130.543甜茶甙9.2032.216未知2.7233.485甜菊双糖甙0.26使用丙酮/水混合物，其含有10％至20％的水(重量)，优选15％，观察到液相-液相的萃取物质适宜用于重结晶。5克的液相-液相萃取物质(莱鲍迪甙C含量24.5％)与27.5g的丙酮/水(15/85，w/w)混合，混合物加热至48℃。得到的澄清溶液冷却至室温(即，19-22℃)并搅拌4天。过滤溶液收集白色沉淀，其然后用丙酮洗涤并在真空下50℃干燥8小时。通过HPLC分析确定，观察到重结晶物质(0.9g)具有莱鲍迪甙C的含量为76.98％(表6)。并且，莱鲍迪甙C的回收率为56.6％。表6保留时间(分钟)组分总百分比18.712未知2.3424.363莱鲍迪甙A6.8224.781甜菊甙6.5926.193莱鲍迪甙F0.8527.015莱鲍迪甙C76.9827.557杜尔可甙0.7527.995未知0.3928.578甜菊甙异构体0.9230.566甜茶甙0.7631.325莱鲍迪甙B2.08莱鲍迪甙C的纯度可进一步通过第二次重结晶来提高。第二次重结晶包括将2克的来自第一次重结晶的物质与27.5g的1-丁醇/水(97/3，w/w)混合，并加热混合物至78℃。得到的澄清溶液冷却至室温(即，19-22℃)并静置2天。过滤溶液收集白色沉淀，其然后用丙酮洗涤并在真空下50℃干燥8小时。通过HPLC分析确定，第二次重结晶得到1.1克的莱鲍迪甙C含量为93.0％的物质(表7)，并且回收率为78.7％。表7保留时间(分钟)组分总百分比24.082莱鲍迪甙A5.30％26.530莱鲍迪甙C93.0％27.599杜尔可甙A0.37％32.201未知1.38％而且，莱鲍迪甙C的纯度可通过包括一个洗涤步骤来进一步提高。洗涤步骤包括将5克的来自第一次重结晶的物质与100g的丙酮/水(85/15，w/w)混合，并加热混合物至58℃。混合物回流2小时并冷却至室温(即，19-22℃)并静置16小时。过滤溶液收集白色沉淀，其然后用丙酮洗涤并在真空下50℃干燥8小时。通过HPLC分析确定，洗涤步骤得到3.6克的莱鲍迪甙C含量为91.1％的物质(表8)，并且回收率为84.3％。表8保留时间(分钟)组分总百分比25.362莱鲍迪甙A3.6325.641甜菊甙0.6826.264莱鲍迪甙F0.8326.658莱鲍迪甙C91.1227.048杜尔可甙1.7527.419甜菊甙异构体0.6529.825未知1.35